Оптимизация метода выделения днк из срезов фиксированной ткани колоректальных опухолей - Медицина дипломная работа

Главная

Медицина
Оптимизация метода выделения днк из срезов фиксированной ткани колоректальных опухолей

Классы таргетных препаратов. Противоопухолевые препараты и колоректальный рак. Сравнительный анализ различных методов выделения ДНК из образцов ткани, фиксированной формалином и заключенной в парафин. Тестирование препаратов ДНК на мутации в гене KRAS.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Размещено на http://www.allbest.ru/
Рак толстой и прямой кишки - одна из наиболее распространенных злокачественных опухолей, заболеваемость которой с каждым годом растет все больше. В 2007 году в России умерло 37 111 человек от рака толстой и прямой кишки. В структуре смертности от злокачественных новообразований колоректальный рак занимает III место (11%) по данным Российского Онкологического Научного Центра имени Н.Н. Блохина.
При наличии у пациента отдаленных метастазов в другие органы (4 стадия) основным методом лечения является лекарственная терапия, которая включает в себя классическую химиотерапию и таргетную терапию. Для терапии колоректального рака применяются два таргетных препарата - цетуксимаб и панитумумаб, являющиеся анти- EGFR антителами. Лишь недавно было продемонстрировано значение мутации KRAS в определении резистентности к анти-EGFR терапии. Ген КRAS занимает промежуточное положение в цепи сигналов от EGFR к ядру клетки. В случае мутации KRAS, имеющей место у ?40% больных колоректальным раком (КРР), этот ген способен самостоятельно продуцировать активирующие ростовые сигналы. Блокада EGFR в этой ситуации неэффективна. Поэтому анти-EGFR антитела показаны лишь тем больным, у кого нет мутации KRAS. Таким образом, в настоящее время ген KRAS является единственным общепризнанным фактором, предсказывающим резистентность к терапии анти-EGFR антителами.
Целью данной работы является оптимизация метода выделения ДНК из срезов опухолевой ткани колоректального рака, фиксированной формалином и заключенной в парафин. При фиксации формалином между цепями ДНК и белками образуются поперечные сшивки, также в препарате присутствуют различные ингибиторы. Это мешает корректной работе ПЦР-теста. Некоторые морфологические особенности опухолевой ткани могут приводить к снижению количества ДНК в получаемом препарате.
Новое направление в лечении - таргетная терапия
Переход исследований в медицине на молекулярный уровень привел к накоплению в последние десятилетия многочисленных данных, позволивших детально описать патогенез целого ряда заболеваний. Принципиальное изменение ситуации произошло в связи с завершением интенсивных исследований в иммунологии, биотехнологии и молекулярной биологии. В результате развития этих областей науки сформировалась унифицированная идеология таргетной (или мишень-направленной) терапии. Таргетная (целевая) терапия (target therapy) в онкологии -- новое направление в лечении злокачественных опухолей, основным принципом которой является селективное воздействие на критичные для опухоли мишени (ферменты, рецепторы).
Мишенями для воздействия таргетных препаратов выступают рецепторы к эпидермальным факторам роста и факторам роста сосудов (рецепторы ангиогенеза); белки, осуществляющие проведение митогенных сигналов от рецепторных молекул; апоптоз-контролирующие молекулы. Таким образом мишени таргетных препаратов - это собственные белки организма, участвующие в процессах канцерогенеза и определяющие способность опухоли к прогрессии и метастазированию.
Сегодня разрешенными к использованию в клинике являются следующие группы препаратов:
1. химерные или гуманизированные моноклональные антитела к рецепторам факторов роста, экспрессируеммых на поверхности злокачественных клеток или эндотелия кровеносных сосудов;
2. препараты из малых синтетических молекул, в отличие от моноклональных антител проникающие внутрь клетки и блокирующие внутриклеточный тирозинкиназный домен рецептора фактора роста.
Первый противоопухолевый препарат ритуксимаб (мабтера) на основе моноклональных антител был выпущен в 1997 году. Препарат представляет собой химерные антитела против антигена CD20, который экспрессируется на поверхности В-клеток, начиная со стадии пре-В-клеток, и до стадии дифференцированных плазматических клеток. Этот антиген экспрессируется более чем на 95%опухолевых клеток В-клеточных лимфом, и отсутствует в моноцитах,Т-лимфоцитах и клетках нелимфоидного ряда [1]. Препарат разрешен в РФ для лечения B-клеточной неходжкинской лимфомы (рецидивирующей или химио-устойчивой, низкой степени злокачественности или фолликулярной) у взрослых больных. На сегодняшний день примерами таргетных препаратов реально вошедших в клиническую практику, являются моноклональные антитела (МКА) к рецепторам эпидермального фактора роста (трастузумаб или Герцептин - МКА к HER-2/neu и цетуксимаб или Эрбитукс - МКА к EGFR), малые молекулы-блокаторы тирозинкиназ EGFR - гефитиниб (Иресса) и эрлотиниб (Тарцева), ингибитор тирозинкиназы с-KIT, всех ABL киназ и рецептора тромбоцитарного фактора роста - иматиниб мезилат (гливек), принципиально изменивший возможности терапии миелолейкоза и гастроинтестинальных стромальных опухолей, а также МКА к рецепторам сосудистого эндотелиального фактора роста препарат бевацизумаб (Авастин), обладающий противоопухолевой активностью при колоректальном раке, немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) и некоторых других опухолях. Краткие сведения о таргетных препаратах, применяемых в настоящее время, представлены в таблице 1.
Недавно для лечения колоректального рака были разработаны препараты на основе антител к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR), который гиперэкспрессируется в 50-80% опухолей. Эти препараты повышают показатели общей выживаемости только у части пациентов.[2]
Стало ясно, что пациенты с метастатическим колоректальным раком, у которых в опухолевых клетках немутировавший( “дикий”) тип гена KRAS (Kirsten rat sarcoma), дают гораздо более выраженный ответ на анти- EGFR терапию нежели пациенты с мутанитным типом гена KRAS.
Мутация в гене KRAS приводит к активации внутриклеточного сигнального каскада, результатом чего является: клеточная пролиферация, защита от апоптоза клеток, увеличение инвазии и метастазирование, ангиогенез. Статус гена KRAS коррелирует с резистентностью опухоли к анти- EGFR терапии. В связи с этим Американское Общество Клинических Онкологов и Европейское Медицинское Агентство рекомендует применение данных препаратов только для лечения опухолей, содержащих ген KRAS дикого типа.
Таблица 1. Таргетные препараты и их мишени.
Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR, HER1, ErbB1) является клинически подтвер жденной молекулярной «мишенью». Опухолевые клетки гиперэкспрессируют ЕGFR в 75-89% случаев колоректального рака[4].
EGFR - трансмембранный гликопротеин молекулярной массой 170 kD, обладающий тирозинкиназной активностью. EGFR (или HER1) относится к семейству рецепторов эпидермального фактора роста, которое также представлено другими его видами: erbB2/HER2-neu; erbB3/HER3 и erbB4/HER4. EGFR экспрессируется на поверхности как нормальных, так и трансформированных эпителиальных клеток и участвует в регуляции клеточного роста и дифференцировки. Как и все рецепторные тирозинкиназы, EGFR состоит из трех участков: внеклеточный лиганд-связывающий домен, трансмембранный гидрофобный участок и внутриклеточный тирозинкиназный домен (Рис.1).
В роли лигандов выступают экскретируемые нормальными и/или опухолевыми клетками ростовые факторы EGF, TGF-a и амфирегулин, которые аутокринным и/или паракринным путем регулируют активность рецептора эпидермального фактора роста. Активация EGFR происходит после связывания одного из специфичных лигандов с внеклеточным доменом, последовательных конформационных изменений в виде димеризации рецептора и реакции фосфорилирования тирозиновых остатков внутриклеточного домена. На этапе взаимодействия с факторами роста существует возможность не только гомодимеризации EGFR, т.е. образования двух идентичных рецепторов EGFR связанных с общим лигандом, но может произойти и гетеродимеризация EGFR с другими представителями семейства erbB, в частности с рецептором Her2/neu и erb3.[5]. Образование гетеродимера приводит к значительному усилению внутриклеточных сигнальных импульсов. В результате всех этих взаимодействий активированная тирозинкиназа перелает импульс через специальные сигнальние пути Raf-MEK-MAPK (регулирует пролиферацию клетки, инвазию и метастазирование) и PI-3K-Akt (блокирует апоптоз опухолевой клетки).[6,7,8]
Рис. 2. Два подхода блокирования EGFR. Связывание внеклеточного домена рецептора с лигандом активирует три сигнальных каскада: RAS-MAPK, PI3K-Akt и STAT. Вместе эти сигнальные пути контролируют транскрипцию, клеточную пролиферацию, адгезию, ангиогенез. Одна группа препаратов - это моноклональные антитела, которые конкурентно связываются с внеклеточным доменом рецептора, блокируя лиганд-индуцированную активацию EGFR. Вторая группа - это малые молекулы, которые ингибируют тирозин-киназу, препятствуя присоединению АТФ к внутриклеточному домену рецептора[21].
Важнейшей системой, регулируемой с участием активированного EGFR, является система гена K-ras. Продукт гена K-ras, белок р21 ras (белок ras), представляет собой регуляторный трансмембранный G белок. Активированный EGFR запускает реакцию, в результате которой образуется активированная форма белка ras -- GTP (гуанозин-5'-трифосфат). После «передачи сигнала» активированная форма гидролизируется до неактивной формы ras -- GDP (гуанозин-5'-дифосфат). Активированный р21 ras запускает каскад ферментативных реакций, передающий сигнал в ядро клетки, известный как Raf-MEK-MAPK путь.
K-ras ген локализуется в локусе р12 XII хромосомы и кодирует белок, ответственный за передачу сигналов от мембраных рецепторов тирозинкиназ (TGFR, VGFR, EGFR, HER-2) к цитоплазматическим киназам. «Диким» принято называть немутировавший тип гена. При мутации гена K-ras теряется способность к самостоятельной дезактивации белка ras, т.е. нарушается его переход из активной ras-GTP в неактивную ras-GDP форму. Белок ras блокируется в постоянно «включенном» состоянии. Эти приводит к постоянной стимуляции передачи сигнала в ядро клетки по Raf-MEK-MAPK -- пути и, следовательно, к нарастанию клеточной пролиферации.
В настоящее время существует 2 группы антагонистов EGFR. К первой группе относятся моноклональные антитела (цетуксимаб и панитумумаб), которые конкурентно связываются с внеклеточным доменом рецептора, блокируя лиганд-индуцированную активацию EGFR. Вторая группа - это малые молекулы, которые ингибируют тирозин-киназу, препятствуя присоединению АТФ к внутриклеточному домену рецептора (гефитиниб и эрлотиниб) (Рис. 2). Эти препараты используются в лечении немелкоклеточного рака легкого, рака головы и шеи, прямой и ободочной кишки, поджелудочной железы.[9]. Гиперэкспрессия EGFR опухолевыми клетками, как правило, ассоциируется с поздними стадиями и метастатическим фенотипом заболевания и, соответственно, коррелирует с плохим прогнозом [10].
Таблица 2. Экспрессия EGFR различными видами опухолей.
Колоректальный рак (КРР) в настоящее время занимает 3-е место в мире в структуре заболеваемости злокачественными опухолями, уступая лишь раку легкого и раку молочной железы. Примерно у половины пациентов на момент постановки диагноза или позже развивается диссеминация процесса. Еще 30 лет назад единственным доступным для лечения метастатического КРР (МКРР) препа- ратом был 5-фторурацил (5-ФУ), а средняя продолжительность жизни больных МКРР составляла около 12 мес. Новые химиотерапевтические препараты, такие как иринотекан и оксалиплатин, в сочетании с инфузиями 5-ФУ (режимы FOLFIRI и FOLFOX) позволили увеличить этот показатель до 20 мес. С 1990-х годов арсенал химиотерапевта пополняется новым классом противоопухолевых средств - таргетными препаратами.
Среди анти-EGFR-антител в настоящее время доступны два препарата: цетуксимаб и панитумумаб (Вектибикс). Основное их отличие заложено в структуре. Так, цетуксимаб представляет собой химерное моноклональное антитело к EGFR и на 34% состоит из мышиных антител, что может вызывать нежелательную иммунологическую реакцию. Панитумумаб является на 100% человеческим иммуноглобулином G2 (IgG2) и обладает большей аффинностью к EGFR, чем его натуральные лиганды. Меньшая иммуногенность препарата позволила в 3 раза снизить частоту выраженных инфузионных реакций по сравнению с цетуксимабом, а также отказаться от премедикации.
Цетуксимаб представляет собой химерные моноклональные антитела IgG1, которые связываются с внеклеточным доменом EGFR. Цетуксимаб обладает высокой специфичностью и примерно в 10 раз большей аффинностью к рецепторам эпидермального фактора роста, чем его естественные лиганды - EGF и TGF-б. Молекулярная масса цетуксимаба составляет около 154 кДa.
Конкурентное ингибирование EGFR цетуксимабом предотвращает индуцированное лигандами фосфорилирование внутриклеточного домена тирозинкиназы, подавляя последующую активацию сигнального каскада.
Связывание цетуксимаба с EGFR приводит к димеризации рецепторов с последующим эндоцитозом и внутриклеточной деградацией комплекса антитело-рецептор. В результате плотность EGFR на поверхности клеток снижается. Кроме того, цетуксимаб может индуцировать противоопухолевый эффект посредством антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности.
Образование новых кровеносных сосудов (неоангиогенез) - ключевой фактор, определяющий процессы роста опухоли и ее метастазирования. При этом главным регулятором процесса ангиогенеза является VEGF. Сигнальный каскад EGFR тесно связан с VEGF и процессами ангиогенеза посредством фосфатидилинозитол-3-киназы, протеин-серин/треонин киназы Akt и имеющейся у млекопитающих молекулярной мишенью рапамицина (mTOR). Таким образом, одиним из возможных противоопухолевых эффектов цетуксимаба заключается в подавлении продукции VEGF опухолевыми клетками, а значит, и последующего неоангиогенеза.
При использовании цетуксимаба наиболее выражены побочные кожные реакции. Точная роль EGFR кожи еще не полностью ясна, известно, что они вовлечены во многие процессы, происходящие в эпидермисе. EGFR экспрессируются кератиноцитами, фибробластами кожи и внешней оболочкой корней волосяных фолликулов. Нарушения экспрессии и активности EGFR тесно взаимосвязаны с аномалиями роста и дифференциации эпидермиса. Ингибирование EGFR моноклональными антителами или ингибиторами тирозинкиназы приводит к возникновению на коже характерной папуло- пустулезной угреподобной сыпи, которая на фоне применения цетуксимаба возникает примерно у 80% пациентов. Обычно повреждения кожи представлены эритематозными фолликулярными папулами, которые могут превращаться в пустулы и затем вскрываться с образованием желтых корочек. Могут развиваться следующие побочные реакции со стороны кожи и ее придатков: изменения структуры волос на голове (они становятся более ломкими, тонкими, вьющимися) и андрогеноподобная алопеция в лобной части. Иногда, напротив, наблюдается ускоренный рост волос на голове и ресниц.
Данные клинических исследований цетуксимаба
Сегодняшние представления об эффективности цетуксимаба в 1 линии терапии метастатического колоректального рака основываются на данных двух крупных рандомизированных исследований III фазы -- CRYSTAL и OPUS. В исследование CRYSTAL включены 1217 пациентов метастатическим КРР с гиперэкспрессией EGFR[11,12,13,14].
В качестве терапии 1 линии пациенты получали либо FOLFIRI (группа А), либо FOLFIRI+Цетуксимаб (группа В). Оценка эффективности была проведена у 1198 пациентов. В группе В (FOLFIRI+Цетуксимаб) объективный ответ был достоверно выше по сравнению с группой А (FOLFIRI) и составил 46,9% против 38,7% (p=0,0038). Частота характерных для Цетуксимаба кожных реакций в виде сыпи составила 18,7% в группе В (FOLFIRI+Цетуксимаб) против 0,2% в группе А (FOLFIRI).
Наиболее интересные данные были получены при анализе результатов лечения в зависимости от KRAS- статуса (Таблица 2). KRAS -анализ был выполнен у 540 пациентов (45% от включенных в исследование). У 348 (64,4% от числа обследованных пациентов) был выявлен «дикий» тип KRAS , из них 172 (49,4%) пациента группы А и 176 (50,6%) пациента группы В. У 192 (35,6%) пациентов был выявлен мутировавший тип KRAS, из них 105 (54,7%) пациента группы А и 87 (45,3%) пациента группы В.
Таблица 3. Эффективность режимов, включающих Цетуксимаб, в первой линии терапии метастатического КРР в зависимости от мутационного статуса гена KRAS.
Медиана выживаемости без прогрессированиия
У пациентов с «диким» типом KRAS (n=348) медиана выживаемости без прогрессирования заболевания была выше у больных, получавших Цетуксимаб+FOLFIRI (9,9 месяца против 8,7месяца, HR=0,68 p=0,017). 1-годичная выживаемость без прогрессирования составила 43% у больных, получавших Цетуксимаб+FOLFIRI, против 25%, получавших только FOLFIRI. Из пациентов, получивших Цетуксимаб+FOLFIRI (n=277) медиана выживаемости без прогрессирования составила 9,9 месяца (n=172) у пациентов с «диким» типом KRAS против 7,6 месяца у пациентов с мутировавшим типом K-ras (n=105), данное различие является значимым (HR=0,63 p=0,007). (Рис.4).
Рис. 4. CRYSTAL: Выживаемость без прогрессирования у больных с «диким» тип K-ras.
У пациентов с «диким» типом KRAS (n=348) оказался выше и уровень ответа на Цетуксимаб+FOLFIRI (n=172) по сравнению с FOLFIRI (n=176) -- 59,3% против 43,2% (p=0,0025). Наиболее впечатляющий уровень ответа был получен у больных с «диким» типом KRAS при изолированных метастазах в печень: 77,1% (n=35) при Цетуксимаб+FOLFIRI против 50,0% (n=32) при FOLFIRI (p=0,025) [15].При оценке общей выживаемости у пациентов с «диким» типом KRAS (n=348) медиана общей выживаемости была выше у больных получивших Цетуксимаб+FOLFIRI -- 24,9 месяца против 21,0 месяца (HR=0,84 p=0,22).
Второе крупное исследование, результаты которого в настоящее время широко обсуждаются, -- рандомизированное исследование II фазы OPUS, изучающее эффективности режима Цетуксимаб+FOLFOX4 (группа A) по сравнению с FOLFOX4 (группа В) в первой линии лечения метастатического рака толстой кишки с эксперссией EGFR [16].В исследование было включено 337 пациентов. Объективный ответ был несколько выше в группе больных, получавших Цетуксимаб+FOLFOX4 -- 45,6% против 35,7% в группе получавшей FOLFOX4 (p=0,064), не было получено также достоверного различия между медианами выживаемости без прогрессирования болезни в обеих группах. Кожные реакции в виде сыпи были зарегистрированы только в группе А (FOLFOX4+Цетуксимаб) частота этого осложнений III-IV составила 14,1% .
У 233 пациентов (69% от 337 включенных в исследование) был определен тип KRAS. У 134 (58% от числа обследованных пациентов) был выявлен «дикий» тип K-ras, из них 61 (48%) пациента группы А и 73 (54%) пациента группы В. У 99 (42%) пациентов был выявлен мутировавший тип KRAS, из них 52 (53%) пациента группы А и 47 (47%) пациента группы В. У пациентов с «диким» типом KRAS (n=134) оказался достоверно выше уровень ответа на Цетуксимаб+FOLFOX4 по сравнению с FOLFOX4 -- 60,7% против 37% (p=0,011).
У пациентов с «диким» типом KRAS (n=134) медиана выживаемости без прогрессирования заболевания оказалась выше у больных, получавших Цетуксимаб+FOLFOX4 (7,7 месяца против 7,2 месяца, HR=0,56 p=0,016).( Рис.5).
Рис. 5. OPUS: Выживаемость без прогрессирования у больных с «диким» тип K-ras.
Из больных, получивших Цетуксимаб+FOLFOX4 (n=113) медиана выживаемости без прогрессирования заболевания составила 7,7 месяца (n=61) у пациентов с «диким» типом K-ras против 5,5 месяца у пациентов с мутировавшим типом KRAS (n=52), данное различие является значимым (HR=0,45 p=0,0009).
Таким образом, пациенты с «диким» типом KRAS получили некоторое преимущество от добавления цетуксимаба к стандартной химиотерапии. На основании исследований CRYSTAL и OPUS цетуксимаб был одобрен в Европе для лечения пациентов с метастатическим колоректальным раком с немутировавшим типом гена KRAS, экспрессирующим рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR).
Также цетуксимаб показал свою эффективность и удовлетворительную переносимость, рекомендован в разных странах мира для лечения местнораспространенного и метастатического плоскоклеточного рака головы и шеи.
Панитумумаб представляет собой человеческое моноклональное антитело класса IgG2, полученное из клеточной линии млекопитающих (яичники китайского хомячка) путем рекомбинантной ДНК-технологии. Панитумумаб связывается с лиганд-связывающим доменом рецептора EGFR и ингибирует процесс аутофосфорилирования, который индуцируется всеми известными лигандами рецептора EGFR. Связывание панитумумаба с рецептором EGFR приводит к интернализации рецептора, ингибированию процессов клеточного роста, индукции апоптоза и уменьшению продукции интерлейкина-8 и фактора роста эндотелия сосудов.
Наиболее частыми нежелательными реакциями при применении панитумумаба в режиме монотерапии были дерматологические реакции, наблюдавшиеся приблизительно в 93% случаев. Также побочными реакциями, возникавшими у > 20% пациентов были расстройства желудочно-кишечного тракта (тошнота, рвота, диарея).
В этом году были представлены результаты другого рандомизированного исследования - PRIME, в котором срав- нивали комбинацию FOLFOX + панитумумаб c режимом FOFLOX в качестве 1-й линии терапии больных метастатическим колоректальным раком. В исследовании участвовали 1183 пациента, из которых 656 (55%) не имели мутации KRAS [17]. Основной задачей исследования было улучшение выживаемости до прогрессирования в зависимости от статуса KRAS. У больных без мутации KRAS добавление панитумумаба позволило достоверно увеличить медиану выживаемости до прогрессирования с 8,0 мес до 9,6 мес . Также отмечена тенденция и к улучшению продолжительности жизни , однако окончательный анализ продолжительности жизни еще преждевременен. Частота объективных ответов увеличилась незначительно - с 48% до 55%.
Таблица 4. Панитумумаб при лечении МКРР: результаты рандомизированных исследований (анализ пациентов без мутации K-RAS).
Медиана продолжительности жизни, мес
Совместное применение бевацизумаба и анти-EGFR-антител
Бевацизумаб -- противоопухолевое лекарственное средство. Представляет собой рекомбинантные гиперхимерные (гуманизированные, приближенные к человеческим) моноклональные антитела класса IgG1, которые селективно связываются и ингибируют биологическую активность фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).
Бевацизумаб и анти-EGFR-антитела в комбинации с химиотерапией улучшают результаты лечения по сравнению с одной химиотерапией. Обладая разными механизмами действия и отличающимся токсическим профилем, их совместное применение выглядело перспективным. Многоцентровое исследование III фазы PACCE предполагало рандомизацию больных в группы химиотерапия + бевацизумаб или химиотерапия + бевацизумаб + панитумумаб. В качестве химиотерапии применяли как режимы на основе оксалиплатина (823 пациента), так и иринотекана (230). Основной задачей исследования было улучшение выживаемости до прогрессирования в группе с оксалиплатином. Исследование было досрочно приостановлено после планового промежуточного анализа, который показал ухудшение выживаемости до прогрессирования с 11,4 мес до 10,0 мес и продолжительности жизни с 24,5 мес до 19,4 мес в группе панитумумаб + бевацизумаб по сравнению с одним бевацизумабом [18].Первоначально негативные результаты исследования объясняли большей токсичностью в экспериментальной группе: частота кожной сыпи III-IV степени увеличилась с 1% до 36%, диареи III-IV степени - с 13% до 24%, инфекции III-IV степени - с 10% до 19%. Однако в сходном исследовании CAIRO-2, в котором сравнивали режимы XELOX + бевацизумаб или XELOX + бевацизумаб + цетуксимаб, выживаемость до прогрессирования в группе с цетуксимабом также оказалась ниже [19]. При этом токсичность в обеих группах была сравнимой. По-видимому, существует определенный антагонизм между двумя классами таргетных препаратов, механизм которого еще следует установить. Имеющиеся данные двух исследований свидетельствуют о недопустимости одновременного применения бевацизумаба и анти-EGFR антител (панитумумаба и цетуксимаба).
В настоящее время панитумумаб для монотерапии зарегистрирован в Евросоюзе и Российской Федерации у больных МКРР без мутации KRAS, получавших ранее оксалиплатин, иринотекан и фторпиримидины. Однако, основываясь на результатах успешного применения препарата в 1-й и 2-й линиях, в ближайшее время следует ожидать расширение показаний к его применению.
Достоверным маркером чувствительности опухоли к терапии цетуксимабом и панитумумабом является ген KRAS.
При тестировании мутаций в генах KRAS, BRAF, PIK3CA и экспрессии PTEN среди пациентов с отсутствием какой-либо из исследуемых мутаций вероятность ответа на лечения была 51%, в то время как у пациентов с 1 из исследуемых мутаций - только 4%, у пациентов с 2 и более мутациями - 0%. Прогноз пациентов с наличием каких-либо из исследованных мутаций также был значительно хуже по сравнению с остальной группой больных. [20]. Определение мутации KRAS позволяет не только выделить группу больных, у которых ответ на лечение ингибиторами эпидермального фактора роста (EGFR)будет более вероятен, но и предупредить потенциально опасные эффекты от применения этих препаратов у других пациентов.
Рис.5. Мутировавший тип K-ras. Нарушается переход белка ras из активной ras-GTP в неактивную ras-GDP форму. Белок ras блокируется в постоянно «включенном» состоянии. Происходит постоянная независимая от EGFR стимуляции передачи сигнала в ядро клетки по Raf-MEK-MAPK -- пути.
Наиболее часто встречающимися являются мутации в 12 и 13 кодонах:
Существует несколько методов определения мутации KRAS, имеющие различную чувствительность. Так, сиквенирование позволяет выявлять наличие 60% мутантной ДНК, HRM - 5-10%.
Чувствительность теста на основе аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени позволяет выявлять наличие 5% мутантной ДНК в опухоли, что значительно выше чувствительности прямого секвенирования ДНК. Для исследования можно использовать свежезамороженную ткань опухоли; блоки опухолевой ткани, фиксированной формалином, заключенной в парафин; срезы опухолевой ткани в парафине.
Целью работы является оптимизация метода выделения ДНК из образцов ткани. В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:
1) провести сравнительный анализ различных методов выделения ДНК,
2) определение мутаций KRAS в ДНК из срезов опухолей, фиксированных формалином, заключенных в парафин.
Для работы использовались парафиновые блоки опухолевой ткани с установленным диагнозом рака прямой или ободочной кишки.
Для выделения ДНК из блоков ткани в парафине излишки парафина обрезали скальпелем и готовили серийные срезы толщиной 10 мкм с площадью ткани на срезе 25-80мм 2 . Если поверхность образца была длительное время экспонирована на воздухе, то первые 2-3 среза отбрасывали, а последующие 6-8 использовали в тесте. Первый и последний рабочие срезы серии окрашивали гемотоксилин-эозином , и патоморфолог оценивал процент опухолевых клеток.
Выделение геномной ДНК производили тремя способами: 1) с помощью набора DNA Mini Kit ( Qiagen, кат. №51304), щелочным методом, с помощью набора MagneSil Genomic, Fixed System (Promega, product MD 1490).
· геномная ДНК плаценты человека («Биолинк»);
· праймеры (последовательность праймеров для ПЦР в режиме реального времени является интеллектуальной собственностью компании «Биолинк»);
Для работы использовались парафиновые блоки опухолевой ткани с установленным диагнозом рака прямой или ободочной кишки.
Для выделения ДНК из блоков ткани в парафине излишки парафина обрезали скальпелем и готовили серийные срезы толщиной 10 мкм с площадью ткани на срезе 25-80мм 2 . Если поверхность образца была длительное время экспонирована на воздухе, то первые 2-3 среза отбрасывали, а последующие 6-8 использовали в тесте. Первый и последний рабочие срезы серии окрашивали гемотоксилин-эозином , и патоморфолог оценивал процент опухолевых клеток. Остальные 4-6 рабочих среза помещали по 2 среза в пробирку на 1,5мл. ДНК.
Принцип работы набора основан на специфическом связывании ДНК с силикатной мембраной колонки QIAamp MinElute. При этом ингибиторы ПЦР, такие как двухвалентные катионы и белки, удаляются с мембраны промыванием буферными растворами.
ДНК выделяли согласно инструкции к набору QIAamp DNA MINI KIT.
Выделение ДНК проводилось по методу Shi et al (2004) с модификациями [22].
Температура экстракции была изменена с 120?С на 95?С с последующей экстракцией хлороформом. Осаждение ДНК производилось полиакриламидом и изопропанолом.
Процесс фиксации ткани приводит к образованию поперечных сшивок между белками и ДНК, между цепями ДНК. Это уменьшает эффективность ПЦР. В качестве сорбента ДНК в данном наборе используется парамагнитная смола, ДНК-связывающая способность которой ограничена несколькими нанограммами.
В первую очередь было необходимо оценить качество и количество ДНК в препарате. Для этого проводилась контрольная ПЦР с праймерами на константный район гена KRAS и подбиралось оптимальное для дельнейшего тестирования разведение. Затем проводилась ПЦР с праймерами на 7 мутаций гена KRAS.
Полимеразную цепную реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл 0,2 мМ dATP, dGTP, dTTP, dCTP, 2 мкл 25 мМ MgCl 2 , по 1,25 мкл каждого праймера, 1/500 V (V- общий объем смеси) красителя Sybr Green, 1/100 V референс- красителя флуорисцеина), 1? буфер для Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мкл. SmartTaq ДНК-полимеразы, 5 мкл ДНК, выделенной из образцов. Условия амплификации: первый цикл: 95 о С - 2 мин.; затем 10 циклов без регистрации оптических данных: 94 о С - 20 с., 60 о С - 30 с, 72 о С - 20c; 35 циклов с регистрацией оптических данных: 94 о С - 20 с., 60 о С - 30 с, 72 о С - 20 c, 72 о С -15с - сбор оптических данных.
Таким образом с каждым препаратом ДНК проводилися 8 реакций: одна контрольная реакция и семь реакций соответствующих разным мутациям 12 и 13 кодонов.
При тестировании ДНК методом ПЦР в режиме реального времени, полученной из парафиновых срезов, в ряде случаев наблюдается низкий уровень амплификации, причиной которого может быть наличие ингибиторов в растворе ДНК или малое количество ДНК. При фиксировании ДНК формалином образуются перекрестные сшивки между ДНК и белками, между разными цепями ДНК. Малое количество ДНК связано с недостаточным количеством опухолевых клеток в образце.
Причины недостаточного количества опухолевых клеток в образце:
1) Технические причины: не берется пе
Оптимизация метода выделения днк из срезов фиксированной ткани колоректальных опухолей дипломная работа. Медицина.
Реферат: Социально - экономические, политические изменения в СССР в 1953 - 1980 гг.
Правовое Обеспечение Правовой Деятельности Реферат
Курс Лекций На Тему Теоретические Основы Менеджмента
Контрольная работа: Общая характеристика нормативных правовых актов субъектов гражданского права административного
Реферат: Разработка информационно-справочной системы администратора
Реферат: A Review Of Lawrence W Levine S
Реферат: Методические рекомендации по подготовке, оформлению и защите курсовых работ студентов, обучающихся по специальностям
Реферат: Ушедшие в арктическое небо
Курсовая работа по теме Спелеология в Крыму
Сигареты Эссе Крепость
Отчет по практике по теме Работа с нормативными материалами и правовой информацией
Реферат: Столыпинская аграрная реформа
Дипломная работа по теме Логико-математический исследование учебного материала темы 'Квадратные неравенства'
Реферат: Современные методики проектирования систем оплаты труда
Ответ на вопрос по теме Тесты по информатике с ответами. Вариант 3
Реферат по теме Виды финансовых рисков
Конфликты На Предприятии Курсовая
Курсовая На Тему Назначение И Выплата Пенсий
Реферат: Dilemma Of Determinism Essay Research Paper Dilemma
Курсовая На Тему Перевозка Тбо Классификация
Основы химической безопасности. Химическое заражение. Зона и очаг заражения. Классификация опасных химических веществ - Военное дело и гражданская оборона реферат
Селекция животных - Биология и естествознание презентация
Фразеологизмы с компонентом-зоонимом в русском и польском языках - Иностранные языки и языкознание дипломная работа