Методы получения лейкоцитарного и рекомбинантного интерферона в препаративных количествах. Курсовая работа (т). Медицина, физкультура, здравоохранение.

👉🏻👉🏻👉🏻 ВСЯ ИНФОРМАЦИЯ ДОСТУПНА ЗДЕСЬ ЖМИТЕ 👈🏻👈🏻👈🏻

Медицина, физкультура, здравоохранение

Вы можете узнать стоимость помощи в написании студенческой работы.


Помощь в написании работы, которую точно примут!

Похожие работы на - Методы получения лейкоцитарного и рекомбинантного интерферона в препаративных количествах

Скачать Скачать документ
Информация о работе Информация о работе


Скачать Скачать документ
Информация о работе Информация о работе


Скачать Скачать документ
Информация о работе Информация о работе

Нужна качественная работа без плагиата?

Не нашел материал для своей работы?


Поможем написать качественную работу Без плагиата!

Интерфероны представляют собой
белковые молекулы с молекулярной массой от 15000 до 21000 дальтон,
продуцируемые и секретируемые клетками в ответ на вирусную инфекцию или другие
возбудители.


Интерфероны (ИФН) - группа
аутогенных гликопротеинов, биомеханизм действия которых связан с одновременным
противовирусным эффектом - активацией клеточных генов, в результате чего
синтезируются белки, ингибирующие синтез вирусной ДНК (РНК) и обладающие
иммуномодулирующим эффектом - способностью усиливать экспрессию антигенов на
клеточных мембранах и увеличивать активность цитотоксических Т-клеток и
естественных киллеров [4].


ИФН подразделяются на два типа. К
первому типу, действующему как ингибиторы репликации вируса и оказывающему
преимущественно противовирусный эффект, относятся 22 различных подтипа ИФН-б и
один подтип ИФН-в. Ко второму типу, проявляющему иммуномодуляторную активность,
относятся ИФН-г.


Существует три иммунологически
различных класса ИФН: ИФН-б, ИФН-в, ИФН-г.


К ИФН естественного происхождения относятся
лимфобластоидный и лейкоцитарный ИФН (ИФН-б), синтезируемые соответственно
стимулированными моноцитами и В-лимфоцитами человека, которые затем
экстрагируются и очищаются; фибробластный ИФН (ИФН-в), получаемый из культуры
фибробластов человека, и Т-лимфоцитарный ИФН (ИФН-г).


К искусственно синтезируемым ИФН
относится рекомбинантный ИФН-б, который представляет собой высокоочищенный
единственный подтип ИФН-б, получаемый по рекомбинантной молекулярной технологии







С инфекционными болезнями, вызываемыми
бактериями, медицина уже до известной степени научилась справляться при помощи
антибиотиков, сульфонамидов и других препаратов. Но при заболеваниях,
вызываемых вирусами, положение иное, хотя уже в то время, когда еще не было и
речи ни о бактериях, ни о вирусах, против одного из опаснейших вирусных, как
потом выяснилось, заболеваний, а именно оспы, была предложена вполне
действенная предохранительная прививка.


Успешная борьба с детским параличом, которая
велась в последнее время, показала, что болезни вирусного происхождения не
являются непобедимыми. Изучение вирусов привело в последние годы к открытию,
которому суждено большое будущее. Речь идет об интерфероне.


Приведем историю интерферона. Еще в 1935 году
ученый Маграсси, изучая на кроликах вирус, вызывающий лихорадку, при которой на
губах образуются пузырьки (герпес), обратил внимание на одно странное на первый
взгляд обстоятельство. Он вводил кроликам в глаз культуру вируса и через
несколько дней обнаруживал этот вирус в мозге у подопытных животных. Когда он
вводил этим кроликам через 4 дня в мозг культуру вируса, вызывающего во всех
ста процентах случаев смертельное воспаление мозга, на кролика с вирусом
герпеса это не действовало. Он как бы не допускал вирус в мозг, подавлял его
действие и тем предохранял от болезни. Так вот, подавление действия одного
вируса другим при смешанной инфекции и было названо интерференцией вирусов.
Через 22 года поисков и исследований учеными многих стран двум американцам -
Айзексу и Линдеману удалось частично раскрыть это загадочное явление и
направить исследования на путь практического эксперимента, который может
привести и к лечению вирусных болезней человека. Айзеке и Линдеман сообщили об
этом в лондонском медицинском журнале. Эти ученые заражали куриные зародыши
вирусами инфлюэнцы, которые размножаются в яйцевых оболочках зародыша. Но для
опыта они брали не живые, а умерщвленные, инактивированные вирусы инфлюэнцы.
Затем заражали эти куриные зародыши живыми, активными вирусами, но неудачно.
Это наблюдается не только при пользовании вирусами инфлюэнцы и яйцевыми
оболочками куриного зародыша. Такое же явление можно отметить при свинке, кори,
герпесе и не только при использовании яйцевых оболочек куриного зародыша, но и
на тканях щитовидной железы, почечных клетках человека и так далее.


Хотя опыт и напоминает нам предохранительную
прививку, например, против оспы, все-таки вопрос в целом еще был весьма неясен,
и оба исследователя продолжали свою работу. Они доказали, что в жидкую часть
культуры, в которой размножаются клетки, переходит какое-то вещество. Оно и
вызывает явление интерференции, почему Айзеке и Линдеман и называли его
интерфероном.


После того как интерферон появится в жидкой
части культуры, можно заставить его действовать и на другие клетки; последние
тогда оказываются предохраненными от соответствующей вирусной инфекционной
болезни.


Любопытно, что интерферон не специфичен.
Полученный, например, при помощи вирусов инфлюэнцы, он действует так же и при
оспе, но, по-видимому, особенно хорошо тогда, когда применяется на том же виде
животного, на каком был получен.


Можно полагать, открытие интерферона будет
особенно ценным для практической медицины. В настоящее время ставится вопрос о
возможности получения интерферона в более сильной концентрации. Если в этом
направлении будут достигнуты успехи, со временем начнется причинное лечение
вирусных заболеваний. [4,15,25]







1.2 Характеристика и классификация
интерферонов




Интерфероны - общее название, под которым в
настоящее время объединяют ряд белков со сходными свойствами, выделяемых
клетками организма в ответ на вторжение вируса. Благодаря интерферонам клетки
становятся невосприимчивыми по отношению к вирусу. «Определяемый в качестве
интерферона фактор должен быть белковой природы, обладать антивирусной
активностью по отношению к разным вирусам, по крайней мере, в гомологичных
клетках, опосредованной клеточными метаболическими процессами, включающими
синтез РНК и белка»


-      Обладает активируемым действием -
интерферон не действует на внеклеточный вирус, а противодействует вирусной
инфекции путем усиления фагоцитоза, активизации естественных киллерных клеток,
стимулирует образование интерлейкина-2, увеличивает синтез ферментов.


-      Ингибирование клеточного роста - Как
противоопухолевое средств - способен подавлять деление онкогенных клеток при
сохранении функции актвации всех звеньев иммунной системы.


-      Обладает антимикробной активностью


-      Оказывает радиозащитное действие


-      Интерферон является иммуномодулятором
- стимулирует иммунную систему организма.


1.      Обладает антивирусным действием.
Самостоятельно интерферон не уничтожает вирусы. После проникновения в клетку
вируса начинает синтезироваться интерферон, который выходит за пределы клетки и
прикрепляется к поверхности гликозидных рецепторов клеток, пораженных вирусами
или клеток, в которых вирус еще не проник. Гликозидные рецепторы способен
передавать внутрь клеток сигналы, запускающие механизм синтеза ферментов -
эндонуклеазы и протеиназы. Эндонуклиаза способна «разрезать» молекулы
нуклеиновых кислот вирусов на уровне трансляции


.       Интерферон вызывает ингибирование
клеточного роста (используется как противоопухолевое средство) - способен
подавлять деление онкогенных клеток при сохранении функции активации всех
звеньев иммунной системы.


.       Интерферон оказывает стимулирующее
влияние на фагоцитоз, естественные клетки - киллеры и макрофаги; повышает
неспецифическую резастентность клеток; а общая иммунологическая реактивность
организма адекватна уровню интерферонообразования.


.       Интерферон обладает антимикробной
активностью


.       Оказывает радиозащитное действие


.       Интерерон является иммуномодулятором -
т. е. регулирует иммунологические реакции, стимулирует иммунную систему
организма.


Интерферон относится к протеинам или
гликопротеинам, в состав которых включено 146-166 аминокислотных остатков.
Молекулярная масса - 20-80 кДальтон. Вырабатывать интерферон могут клетки
позвоночных от рыб до человека. наиболее активными продуцентами интерферона являются
лимфоциты и макрофаги. Наиболее активными индукторами среди вирусов являются
вирус Ньюкаслской болезни, вирус Сендай, чумы свиней.


1.      Лейкоцитарный или б-IFN-получают в
культуре лейкоцитов выделенных из крови доноров. Различают 20 рекомбинантных
вариантов, отличающихся последовательностью аминокислот в полепептидной цепи и
биологической активностью.


.       Фибробластный или в-IFN-для получения
используют культуру фибрабластов.


.       Иммунный или г-IFN - его синтезируют
сенсебилизированные Т-лимфоциты при повторном контакте с митогенами, а также с
бактериальными и вирусными антигенами.


Все три класса интерферонов обладают различными
физико-химическими свойствами и отличаются друг от друга серологически.


Различают следующие виды интерферонизации:


.       Экзогенная - введение готового
интерферона в организм, использование мазей, содержащих интерферон.


.       Эндогенная - введение в организм
индукторов интерферон, которые стимулируют процесс образования интерферона.


Наиболее активными индукторами интерферона
являются синтетические и природные двунитевые РНК.




Таблица 1 - Влияние интерферона на иммунный
ответ и функции клеток


Резистентность
клеток к вирусному инфицированию

Гиперчувствительность
замедленного типа

Активность
натуральных киллеров (НК)

Экспрессия
антигенов главного комплекса гистосовместимости (MHC)

Рост
клеток (в том числе и опухолевых)

Чувствительность
к токсическому действию поли I:

Реакция
трансплантанта против хозяина

Активность
лимфоцитов, ответственных за зависимую от антител цитотоксичность

Активность
цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ)

Наиболее изученным свойством интерферона
является его способность препятствовать размножению вирусов. Он образуется в
клетках млекопитающих и птиц в ответ на вирусную инфекцию.При заражении клетки
вирус начинает размножаться. Клетка-хозяин одновременно с этим начинает
продукцию интерферона, который выходит из клетки и вступает в контакт с
соседними клетками. Хотя интерферон не обладает прямым противовирусным
действием, он способен вызывать такие изменения в клетках, которые препятствуют
размножению вируса, формированию вирусных частиц и дальнейшему его
распространению. Интерферон действует в нескольких направлениях. Во-первых, он
оказывает влияние на клетки, соседние с инфицированной, запуская в них цепь
событий, приводящих к подавлению синтеза вирусных белков и в некоторых случаях
сборки и выхода вирусных частиц (путём активации олигоаденилатциклазы). В ответ
на воздействие интерферона клетки вырабатывают большое количество протеинкиназы
R. Этот фермент фосфорилирует фактор инициации трансляции eIF-2,
фосфорилированный eIF-2 формирует неактивный комплекс с другим фактором,
eIF-2B. В результате уровень белкового синтеза в клетке снижается. После
протеинкиназы R активируется синтез рибонуклеазы L, которая расщепляет
клеточные РНК и ещё больше снижает уровень белкового синтеза. В целом,
интерферон-зависимое подавление трансляции является губительным как для вируса,
так и для клетки-хозяина. Помимо влияния на трансляцию, интерфероны способны
активировать сотни других генов (они известны как гены, стимулируемые
интерфероном), играющих роль в защите клетки от вирусов[2][3]. Кроме того,
интерферон лимитирует распространение вирусных частиц путём активации белка
p53, что ведёт к апоптотической смерти инфицированной клетки.


Вторым направлением действия интерферонов
является стимуляция иммунной системы для борьбы с вирусами. Интерферон повышает
синтез молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов и
активирует иммунопротеасому. Высокий уровень молекул главного комплекса
гистосовместимости I класса обеспечивает эффективную презентацию вирусных
пептидов цитотоксическим Т-лимфоцитам и натуральным киллерам, а иммунопротеасома
осуществляет процессинг вирусных пептидов, предшествующий презентации. Высокий
уровень молекул главного комплекса гистосовместимости II класса обеспечивает
презентацию вирусных антигенов Т-хелперам. Т-хелперы, в свою очередь, выделяют
цитокины, которые координируют активность других клеток иммунной системы.
Некоторые виды интерферонов, например интерферон-г, могут прямо стимулировать
клетки иммунной системы, такие как макрофаги и натуральные киллеры. Образование
интерферона могут стимулировать не только интактные вирусы, но и различные
другие агенты, например некоторые инактивированные вирусы, двухцепочечные РНК,
синтетические двухцепочечные олигонуклеотиды и бактериальные эндотоксины.


Биологическая активность интерферона очень
высока. У мышиного интерферона она составляет 2·109 ед./мг., а одна единица
снижает образование вирусов примерно на 50 %. Это означает, что достаточно
одной молекулы интерферона, чтобы сделать клетку резистентной к вирусной
инфекции. Показано, что молекулы интерферона должны оказывать действие на
клетку в течение минимум четырех часов, для того, чтобы в клетке начались
процессы борьбы с вирусом, таким образом, многие специалисты не считают
эффективным интраназальное применение интерферона для профилактики ОРВИ. Тем не
менее, последние исследования показывают, что интерферон, примененный на
слизистую оболочку, может действовать в качестве иммунологического адъюванта
против вируса гриппа, усиливая специфический ответ иммунной системы. В США
проводятся клинические испытания вакцины против гриппа, которая использует
интерферон в качестве адъюванта.


Интерферон вызывает и целый ряд других
биологических эффектов, в том числе подавляет размножение клеток. Недавние
исследования показали, что в определённых условиях он может препятствовать
развитию злокачественных новообразований. Установлено также, что интерферон
действует на иммунную систему и вызывает изменение клеточных мембран. Таким
образом, интерфероновая система, вероятно, может играть важную роль в защите
организма от вирусов.


Интерфероны проявляют некоторые виды
активности как лимфокины и им-муномодуляторы. Интерфероны I типа, действующие
преимущественно как ингибиторы репликации вирусов в клетке, реализуют свой
эффект, стимулируя выработку рибосомами клеток хозяина клеточных ферментов,
которые тормозят продукцию вирусов, нарушая трансляцию вирусной мРНК и синтез
вирусных белков.


Интерфероны вырабатывают большинство
видов животных, но проявление их активности видоспецифично, т.е. они действуют
только у того вида животных, в которых вырабатываются.


Интерфероны вызывают индукцию трех
ферментов:
-      олигоизоаденилат
синтетазы, активирующей РНК-азу, которая разрушает вирусную РНК;


-      фосфодиэстеразы,
разрушающей конечные нуклеотиды тРНК, что приводит к нарушению элонгации
пептида.


С учетом антивирусного и
иммуномоделирующего эффектов интерферонов в НПО «Биомед» предложены и успешно
апробированы, суппозитории с интерфероном аn1 и пробиотиками при терапии
дисбактериозов вирусной и бактериальной этиологии, кандидозов; в
гинекологической практике для лечения эндометритов, кольпитов, вагинитов и
гинекологического герпеса. [27, 29, 30]




1.4 Особенности получения
интерферонов




Известны способы получения
лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека,
индуцированных вирусами и другими индукторами.


Основным недостатком этих способов
получения интерферонов являются вероятность контаминации конечного продукта
вирусами человека, такими как вирус гепатитов В и С, вируса иммунодефицита и
др.


В настоящее время более
перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом,
который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно
более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые
при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии
варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его
экспрессию.


В качестве исходных микроорганизмов
используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и
Escherichia coli.


Недостатком использования P.
pastoris в качестве продуцента интерферона, является крайне сложные условия
ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию
индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза.


Недостатком использования штаммов
Ps. putida является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии
(10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является
использование штаммов Escherichia coli.


Известно большое количество плазмид
и созданных на их основе штаммов Е. coli, экспрессирующих интерферон: штаммы Е.
coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR
322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штамм Е. coli pINF- AP2 (SU 1312961),
штамм Е. coli pINF- F-Pa (AU 1312962), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой
p280/21FN (Кравченко В.В. и др. Биоорганическая химия, 1987, т.13, №9,
с.1186-1193), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой pINF14 (SU 1703691), штамм
E.coli SG 20050 с плазмидой pINF16 (RU 2054041) и др. Недостатком технологий,
основанных на использовании этих штаммов, является их нестабильность, а также
недостаточный уровень экспрессии интерферона.


Наряду с особенностями используемых
штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии
выделения и очистки интерферона.


Известен способ получения
интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение
биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием,
гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата,
его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе
DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного
элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету
фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1640996). Недостатком этого
способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при
получении конечного продукта.


Известен также способ получения
интерферона, включающий в себя культивирование штамма E.coli SG 20050/pIF16, в
LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы,
ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток.
Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере,
растворяют в растворе гуанидин хлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком,
центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины,
ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и
сефадексе G-50 (RU 2054041).


Недостатками этого способа является
его относительно невысокая производительность основных этапов процесса
выделения и очистки. В особенности это относится к ультразвуковой обработке
продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности
выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для
промышленного производства интерферона.


В качестве наиболее близкого аналога
(прототипа) может быть указан способ получения лейкоцитарного интерферона
человека, заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма E.coli,
замораживании полученной биомассы при температуре не выше -70°С,
размораживании, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, удалении ДНК и РНК
введением в лизат ДНК-азы и очисткой выделенной нерастворимой формы интерферона
отмывкой буферным раствором с детергентами, растворении осадка интерферона в
растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке
ионообменной хроматографией. В качестве продуцента используют штамм E.coli SS5,
полученный с помощью рекомбинантной плазмиды pSS5, содержащей три промотора:
Plac, Pt7 и Ptrp, и ген альфа -интерферона с введенными нуклеотидными заменами.



Экспрессия интерферона штаммом
E.coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя промоторами: Plac,
Pt7 и Ptrp. Уровень экспрессии интерферона составляет около 800 мг на 1 л
клеточной суспензии.


Недостатком способа является низкая
технологичность использования ферментативного разрушения клеток, ДНК и РНК
микроорганизма и одностадийная хроматографическая очистка интерферона. Это
обуславливает нестабильность процесса выделения интерферона, приводит к
снижению его качества и ограничивает возможность использования приведенной
схемы для промышленного производства интерферона.


Недостатками данной плазмиды и
штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильного нерегулируемого
промотора фага Т7 в штамме Е. coli BL21 (DE3), в котором ген Т7 РНК полимеразы
находится под промотором lac оперона и который всегда "течет".
Следовательно, в клетке непрерывно происходит синтез интерферона, что приводит
к диссоциации плазмиды и снижению жизнеспособности клеток штамма, и в
результате - снижение выхода интерферона.


Для получения больших количеств ИФН
используют шестидневные однослойные культуры клеток куриного эмбриона или
культивируемые лейкоциты крови человека, зараженные определенным видом вируса.
Иными словами, для получения ИФН создают определенную систему вирус-клетка.


Из клетки человека изолирован ген,
ответственный за биосинтез ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя
технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения кДНК ИФН-ов состоит в
следующем:


.       Из лейкоцитов человека
выделяют мРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию,
встраивают в сайт модифицированной плазмиды.


.       Полученным продуктом
трансформируют Е. соli; образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые
идентифицируют.


.       Каждую группу клонов
гибридизируют с ИФН - мРНК.


.       Из образовавшихся гибридов,
содержащих кДНК и хРНК, выделяют мРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза
белка.


.       Определяют интерферонную
противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции.
Группы, проявившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК,
гибридизировавшийся с ИФН - мРНК; повторно идентифицируют клон, содержащий
полноразмерную ИФН - кДНК человека. [1, 9 , 29]




1.5 Перспективные исследования в
области получения интерферонов




С развитием методов молекулярной биологии,
биохимии и биотехнологии повышаются требования качества к практически важным
продуктам, получаемым в данных областях. Одним из примеров подобных тенденций
является повышение чистоты фармакологических субстанций, полученных с использованием
технологий «рекомбинантных ДНК». Это, в частности, относится к белку,
лекарственные препараты которого существуют уже более 20-и лет, - человеческому
рекомбинантному интерферону a-2b.


Наиболее выгодным экономически является
использование штаммов- продуцентов, в которых уровень биосинтеза целевого белка
составляет десятки процентов от суммарных клеточных полипептидов (в этих
случаях, как правило, гетерологичный белок накапливается в бактериальной клетке
в виде нерастворимых конгломератов - телец включения).


Создание подобных бактериальных
штаммов-продуцентов возможно только при соблюдении ряда условий, один из
которых - стабильность мРНК при экспрессии целевого гена. Основным фактором
стабильности мРНК и эффективности ее трансляции, является кодоновая композиция
гетерологичного рекомбинантного гена. При наличии редко встречающихся
аминокислотных кодонов, в гене, клонированном в составе мультикопийного
экспрессионного вектора, подобная генетическая конструкция будет
нежизнеспособна, или же, уровень синтеза целевого белка будет крайне низким.
Другим фактором неэффективной экспрессии гетерологичного гена может являться
интерференция процесса транскрипции гена (особенно, с сильного бактериального
или фагового промотора) с процессом репликации рекомбинантной плазмиды, что
возможно даже при наличии теминатора транскрипции в 3’-концевой нетрансли-
руемой области целевого гена.


Повышение требований к чистоте препаратов на
основе рекомбинантных белков, выделяемых из бактериальных штаммов-продуцентов,
потребовало развитие новых биохимических методов анализа белков. Появились
такие анализы на чистоту, как анализ ВЭЖХ, тесты на остаточную ДНК и на
остаточные белки штамма-хозяина и вектора. Тест на пирогенность постепенно
вытесняется тестом на бактериальные эндотоксины (ЛАЛ-тест). Усложнение
аналитического контроля привело к принципиальным изменениям технологий
производства субстанции рекомбинантных белков, т.к. применение старых
технологических путей являлось не удовлетворительным по качеству конечного
продукта, или же, экономически невыгодным.


При суперсинтезегетерологичных белков в клетках E .
coli
(в таких количествах, что целевой белок начинает образовывать тельца
включения), бактериальные клетки находятся в состоянии стресса. Во многих
случаях бактериальная культура практически не растет после индукции синтеза
целевого белка. Кроме того, в условиях стресса, накапливающиеся в тельцах
включения белки могут иметь нежелательные модификации, начиная с неотщепленногоN-
концевого метионина, и заканчивая ацетилированием или окислением некоторых
аминокислотных остатков белка. Подобные модифицированные вариантымогут не
отделяться от целевого белка при его очистке с помощью различных видов
гидрофобной и ионообменной жидкостной хроматографий (не говоря уже про аффинную
и гель-фильтрационную), так как при модификации изменение конформации белка не
происходит, а изменение массы и заряда ничтожно мало по сравнению
немодифицированной молекулой. Но при правильном подборе условий
модифицированный белок можно детектировать ОФ-ВЭЖХ, а следовательно, при
большом количестве таких молекул в препарате, он не удовлетворяет критериям
необходимой чистоты. Было замечено, что количество и характер подобных примесей
в препаратах рекомбинантных белков зависит от условий ферментации
штамма-продуцента, а не только от использованной технологии выделения и очистки
целевого продукта. Таким образом, процесс получения высокоочищенной субстанции
рекомбинантного белка для ее дальнейшего практического использования при
создании медицинских или ветеринарных препаратов представляет собой комплексную
задачу, изменения одного из этапов которой, значительно влияет на остальные
этапы. [9, 17, 23]







1.6 Клинические особенности
применения интерферонов




Объем экспериментального и клинического
материала по интерферонам (ИФН), накопленный к настоящему времени, огромен.
Многотомные издания и обзорные работы по этой теме исчисляются десятками. В
кратком изложении передать всю совокупность материала совершенно невозможно,
поэтому остановимся только на наиболее важных данных, которые представляют
интерес с клинической точки зрения. Система интерферонов является универсальным
фактором как неспецифической резистентности, так и иммунорегуляции,
функциональная недостаточность и нарушение синтеза которой обусловливает
патогенетическую основу большого числа процессов - воспаления,
иммунопатологических реакций, репарации. Активная выработка интерферона - залог
устойчивости организма к возникновению инфекционных заболеваний или быстрой
локализации очага инфекции в случае его возникновения [5]. Интерфероны
относятся к видоспецифическим цитокинам, представляя собой группу биологически
активных белков и/или гликопротеидов, синтезируемых клетками в процессе
иммунной реакции в ответ на воздействие стимулирующих агентов. Интерфероны -
важнейшие факторы естественного иммунитета, первая линия противоинфекционной
защиты. Особое место ИФН занимают потому, что индукция их синтеза, прежде всего
натуральными киллерами, клетками моноцитарного ряда, а также дендритными
клетками, предшествует формированию специфических иммунных реакций, как это
четко было показано при ряде вирусных инфекций Подобно другим цитокинам,
специфические защитные эффекты ИФН также реализуются через каскады проведения
сигналов. Интерферон был открыт в Англии в 1957 г. А. Айзексом и Ш.
Линденманном при изучении явления интерференции вирусов. В последующие годы ИФН
всегда привлекал внимание вследствие совершенно уникальной способности
подавлять репродукцию вирусовкак в иммунокомпетентных, так и в соматических
клетках без отрицательного влияния (в физиологичных дозах) на метаболизм. По
широте спектра действия, высокой избирательности в отношении
вирусоспецифических процессов, отсутствию цитотоксических эффектов ИФН не имеет
равных среди других противовирусных препаратов.


Система ИФН состоит из генов ИФН и рецепторов, а
также эффекторных молекул трех видов, относящихся к двум типам:тип - ИФН-а и
ИФН-Р; тип - ИФН-у.


Гены ИФН типов I и II расположены на разных
хромосомах и имеют разные рецепторы. Радикально различаются они и по механизмам
индукции и продукции. ИФН I типа продуцируются всеми ядерными клетками (в том
числе малодифференцированными) в ответ на чужеродную генетическую информацию.
Самыми сильными их индукторами являются вирусы или двуспиральные РНК,
являющиеся одной из стадий репликации вирусного генома. Из продуцируемой
лейкоцитами противовирусной активности свыше 90% обусловлено ИНФ-а и менее 10%
- ИНФ-у. В культуре фибробластов такой же индуктор, напротив, вызывает синтез
только ИНФ-Р. В отличие от ИНФ I типа, ИНФ II типа продуцируется только двумя
видами ядерных клеток: Т-лимфоцитами в процессе активации - при взаимодействии
с антиген-представляющим макрофагом; естественными киллерны-ми клетками (ЕК) -
при взаимодействии с клетками-мишенями. Активными индукторами ИНФ-у являются также
митогены Т-лимфоцитов фитогемагглютинин (ФГА), конканавалин А (КонА). В этом
случае необходимости в кооперации с макрофагами нет. Функциональное различие в
процессах индукции ИФН типов I и II необходимо учитывать в клинической
практике. Для организма далеко не безразлично, какой вид ИФН продуцируется в
каждый конкретный момент.Известно, что вирус гриппа индуцирует в изолированных
лейкоцитах синтез ИФН-а. Взаимодействие ИФН с клеткой осуществляется только
через посредство специфического рецептора, пронизывающего цитоплазматическую
мембрану. Уровень рецепторов на клеточной мембране - вели
Похожие работы на - Методы получения лейкоцитарного и рекомбинантного интерферона в препаративных количествах Курсовая работа (т). Медицина, физкультура, здравоохранение.
Сочинение На Тему День России 12 Июня
Приватизация Жилых Помещений В России Курсовая
Реферат по теме Продвинутая CSS-верстка: шаг за шагом
Реферат По Экологии На Тему Озоновые Дыры
Курсовая работа: Место и роль управленческого консультирования в рыночной экономике. Скачать бесплатно и без регистрации
Физиология Обмена Веществ И Энергии Реферат
Доклад по теме Юмор как средство формирования социальной автономности подростков
Дипломная работа по теме Пьеса Оскара Уайльда 'Саломея': проблематика и вопросы поэтологии
Отчет По Практике Химика Лаборанта
Контрольная работа по теме Балансовые теории
Декабрьское Сочинение 202
Доходы местных бюджетов от местных, региональных и фед налогов и сборов
Роль Лфк В Системе Медицинской Реабилитации Реферат
Курс Лекций На Тему Проектирование Автоматизированных Систем
Эссе На Тему Отдавая Памяти Долг
Сочинение Проблема Человеческого Достоинства В Драме Гроза
Реферат: Браніслаў Тарашкевіч і яго Беларуская граматыка для школы
Мой Учитель Сочинение 1 Класс
Курсовая работа по теме Измерение температуры свода электросталеплавильных печей
Курсовая работа по теме Влияние уровня уверенности в себе на социально-психологический статус в группе
Похожие работы на - Оптимизация налогообложения предприятий швейной промышленности
Контрольная работа: Вербальні описи
Похожие работы на - Информационная система реализации готовой продукции на предприятии