Колоночная флэш-хроматография

Колоночная флэш-хроматография

MacondoRC

Мы в телеграмм:

💡 Получите все необходимое вместе с Macondo. Стать членом сообщества можно через Macondo Synthesis или Macondo Shop (ссылка в шапке профиля).

У нас вы найдете:

🟢 Рецепты синтеза:🔹Мефедрон🔹A-PVP🔹МДМА🔹Амфетамин🔹Метамфетамин🔸Рецепты других веществ

🟠 Товары:🔹Реактивы и прекурсоры🔹Лабораторная посуда и оборудование🔹Конструкторы почтой🔹Конструкторы кладом

🟡 Услуги:🔹Консультации для новичков🔹Консультации для магазинов🔸 Справочник WIKI

🟣 Прочее:🔹 Правила🔹 Контакты


Введение:

Колоночная хроматография является развитием тонкослойной хроматографии (ТСХ). Предполагается, что читатель имеет некоторый опыт лабораторной практики и имел дело с тонкослойной хроматографией. Вместо нанесения образца на тонкий слой кремнезема или оксида алюминия образец наносится на цилиндр с адсорбентом, и растворитель постоянно подается под давлением до тех пор, пока компоненты полностью не вытекут из цилиндра. Благодаря этой модификации компоненты можно не только разделять, но и собирать в разные емкости, что позволяет очищать смеси и отделять препараты от загрязнений. Колоночная хроматография (также известная как «флэш-хроматография») часто используется в исследовательских целях, о чем свидетельствует ее частое появление в процедурных разделах журнальных статей.
Процедурное обсуждение
Те же основные принципы тонкослойной хроматографии (ТСХ) применимы и к колоночной хроматографии. Фактически, ТСХ всегда проводится перед проведением колонки, чтобы оценить ситуацию и определить правильное соотношение растворителей. Для получения хорошего разделения идеально, если желаемый компонент имеет Rf около 0,35 (о Rf читайте в разделе ТСХ) и отделен от других компонентов как минимум на 0,2 единицы Rf. Если пятна, которые нужно разделить, расположены очень близко (если разница в Rf < 0,2), лучше всего, если середина пятен будет иметь Rf 0,35. Значение Rf около 0,35 является идеальным, поскольку оно достаточно медленное, чтобы могло произойти уравновешивание стационарно-подвижной фазы, но достаточно быстрое, чтобы минимизировать расширение зоны из-за диффузии.

Есть несколько переменных, которые неприменимы к ТСХ, но влияют на разделение компонентов при колоночной хроматографии. К ним относятся диаметр колонки, количество используемого адсорбента и скорость потока растворителя. Рис. 1 показаны переменные рекомендации, основанные на размере выборки и степени разделения между компонентами. Во всех сценариях необходимо подготовить колонны высотой 12,5–15 см.

Рис. 1 Сводка рекомендуемых значений для колоночной хроматографии.

Например, колонка диаметром 2,5 см должна быть в состоянии очистить около 400 мг материала, если разделение хорошее (ΔRf > 0,2, третья колонка на рис. 1), или около 160 мг, если разделение затруднено (ΔRf > 0,1). . Колонку можно подготовить и элюировать с использованием примерно 200 мл растворителя, а фракции можно собрать примерно с 10 мл раствора каждая.

Существует несколько вариантов физического запуска столбца. Одно большое различие в методах заключается в том, как готовится колонка. При методе «сухой упаковки» сухой кремнезем или оксид алюминия добавляют непосредственно в колонку, а растворитель пропускают порциями, а затем под давлением. При методе «мокрой упаковки» колонну сначала наполняют растворителем, затем слегка встряхивают сухой кремнезем или оксид алюминия, а затем набивают под давлением. При «суспензионном» методе растворитель добавляют к диоксиду кремния или оксиду алюминия в колбе Эрленмейера, выливают на колонку в виде шламового материала, затем набивают под давлением (давление можно создавать шприцем).

Важно знать, что при добавлении растворителя к диоксиду кремния или оксиду алюминия выделяется тепло (они обладают экзотермической теплотой сольватации). В этом разделе представлен суспензионный метод, основная причина которого заключается в том, что он позволяет осуществить этот экзотермический этап в колбе Эрленмейера, а не на колонке. Если во время набивки колонны выделяется тепло, в результате кипения растворителя могут образовываться пузырьки. Если их не удалить должным образом, они могут помешать разделению колонки, а также могут привести к растрескиванию адсорбирующего материала в колонке.

Пошаговые процедуры:

Рис. 2 а) ТСХ смеси ферроцен/ацетилферроцен, б) колоночная хроматография

Колонка, изображенная в этом разделе, показывает очистку образца массой 0,20 г, содержащего смесь ферроцена и ацетилферроцена (сырой ТСХ показан на рис. 2а ) . Фракции объемом примерно 8 мл собирали в небольшие пробирки и использовали примерно 400 мл элюента.

Рис.3 а ) Пластина для ТСХ со смесью сырого ферроцена и ацетилферроцена перед элюированием, б) После элюирования, в) Колонка с фриттой, г) Колонка с ватой, вклиненной в дно, д) Колонка без ватного клина (необходимо вставить перед использованием)


Запустите TLC:

1) Проведите ТСХ образца, подлежащего очистке (рис. 3 а и б ), чтобы определить подходящий растворитель для хроматографии. Желаемый компонент должен иметь Rf около 0,35 и в идеале должен быть отделен от всех других пятен как минимум на 0,2 единицы Rf.

2) Подготовьте партию элюента, дающего правильное значение Rf. Приготовленное количество зависит от количества пробы, размера колонки и того, планируется ли в середине процесса изменить состав растворителя. (См. рис. 1 для ознакомления с рекомендациями и элюотропный ряд для тенденций «растворяющей способности»).

Подготовьте насадочную колонку:

3) Возьмите подходящую колонку (см. рис. 1) и убедитесь, что рядом с запорным краном есть что-то, что пропускает жидкость, но не твердое вещество. Колонки могут иметь спеченный диск (также известный как «фритта»), рис.3 в ), или пробку из ваты или стекловаты, оставшуюся от предыдущего пользователя (рис.3 г ). Если диска или заглушки нет (рис. 3 д ), вбейте небольшой комок ваты или стекловаты в нижнюю часть колонны с помощью длинного стержня.

Рис. 4 а) Заливка кремнезема на высоту 12,5-15 см в вытяжном шкафу, б) Заливка кремнезема в колбу Эрленмейера, в и г ) Приготовление суспензии

4) Закрепите колонну идеально вертикально на кольцевой подставке или решетчатой конструкции, зажав ее трехпальцевыми зажимами в двух местах. В вытяжном шкафу залейте в колонку силикагель или адсорбент оксида алюминия на высоту 12,5-15 см (рис. 4 а ).

Примечание по безопасности:

порошкообразный кремнезем и оксид алюминия вызывают раздражение легких, поэтому с ними всегда следует обращаться осторожно в вытяжном шкафу. Просыпанную пыль следует удалять, протирая ее влажным бумажным полотенцем (если оно влажное, мелкие частицы менее рассеиваются).

5) В вытяжном шкафу перелейте отмеренный в колонке адсорбент в колбу Эрленмейера (рис.4 б ), затем добавьте немного элюента (рис.4 в ). Приготовьте рыхлую суспензию, вращая и перемешивая стеклянной палочкой для перемешивания (рис. 4г ) , пока весь адсорбент не станет полностью влажным, не начнут выделяться пузырьки газа и консистенция не станет несколько густой, но текучей.

Рис.5 а) Заливка суспензии в колонку, б) Промывка колбы, в) Адсорбент, прилипший к стенкам колонки, г) Смывание прилипшего адсорбента

6) Поставьте стакан или колбу Эрленмейера под зажатую колонку и откройте запорный кран. Одним быстрым движением перемешайте и вылейте суспензию диоксида кремния или оксида алюминия в колонку с помощью воронки с большим горлышком (рис. 5а ) . Немедленно используйте больше элюента, чтобы смыть остатки суспензии из колбы Эрленмейера (рис. 5 б ) и на колонку.

7) Немедленно смойте остатки кремнезема или оксида алюминия со стенок резервуара колонки, используя элюент и вращательные движения пипетки Пастера (рис. 5 c и d ). Если дать высохнуть, адсорбент прилипнет к стеклу и его будет трудно смыть.

Рис.6 а) Раскачивание колонны для удаления пузырьков воздуха, б) Подача давления воздуха, в) Добавление песка, г) Промывка песка с боков

8) Сильно толкните колонку, используя пробковое кольцо или костяшки пальцев (рис. 6а ) , чтобы выбить из колонки любые пузырьки воздуха (которые могут вызвать плохое разделение или растрескивание адсорбента в колонке), а также обеспечить равномерное осаждение адсорбент.

9) Слегка надавите на верхнюю часть колонки (рис. 6 b ), чтобы сжать ее, и остановитесь, когда уровень элюента достигнет 1 см от верха колонки. Если с воздухопроводом используется Т-образный переходник, как показано на рис. 6b , то точное управление воздушным потоком может быть достигнуто путем регулировки зажимного зажима на резиновой трубке. На протяжении всего процесса элюирования держите белую колонку адсорбента влажной, при этом уровень элюента должен находиться выше верхнего слоя диоксида кремния или оксида алюминия. Аккуратно сломайте уплотнение, чтобы прекратить давление, и закройте запорный кран, чтобы предотвратить дальнейшее вытекание жидкости.

10) Добавьте тонкий слой песка (рис.6 в ) высотой примерно 0,5 см. Промойте стенки колонки элюентом, вращая движениями, чтобы удалить песок со стенок стекла (рис. 6 d ). Откройте запорный кран и дайте жидкости стечь, пока она не окажется чуть выше слоя песка. Примените давление воздуха, если капание происходит слишком медленно.

Добавьте образец:

Как только образец наносится на колонку, начинается гонка со временем, поскольку диффузия начинает расширять материал. Образец не следует применять до тех пор, пока вы не будете готовы сразу и полностью заполнить столбец. Этот процесс может занять от 15 до 90 минут! Если для сбора фракций используются пробирки, перед добавлением пробы пробирки следует расположить на штативе, а высоту колонки следует отрегулировать так, чтобы штатив для пробирок мог скользить под ней.

Рис. 7 а) Растворение твердого вещества в небольшом количестве дихлорметана, б) Нанесение образца, в) Промывка образца в колбе, г) Приложение давления, чтобы протолкнуть образец на колонку сразу за слоем песка.

11) Если проба сырой нефти представляет собой жидкость, используйте ее напрямую (переходите к шагу 13).

12) Если проба сырой нефти представляет собой твердое вещество, выполните одно из следующих действий:
а) Идеальная ситуация: растворите твердое вещество в минимальном количестве элюента (максимум несколько мл).
б) Если твердое вещество не особенно растворимо или не растворяется в нескольких мл элюента, растворите его в минимальном количестве дихлорметана (максимум в нескольких мл, рис.7 а ).
в) Если твердое вещество нерастворимо в элюенте, возможна альтернативная процедура. Растворите твердое вещество в круглодонной колбе, используя несколько мл низкокипящего растворителя (например, дихлорметана или ацетона). Добавьте в колбу примерно 1 г кремнезема или оксида алюминия, затем удалите растворитель на роторном испарителе, чтобы на адсорбенте осталось твердое вещество, содержащее образец. Оставив дюйм элюента на поверхности насадочной колонки (пропустите добавление слоя песка, если используется этот метод), вылейте образец, адсорбированный диоксидом кремния, на колонку, используя воронку с широким горлышком. Если на стекло прилипла пыль, промойте его большим количеством элюента (перейдите к шагу 15).

13) Аккуратно добавьте образец в колонку с помощью пипетки, капая жидкость или раствор прямо на песок кончиком пипетки как можно ближе, а не вниз по бокам (рис. 7 b ). Будьте осторожны и не впрыскивайте жидкость с силой, чтобы не образовались вмятины в колонке с песком или кремнеземом/оксидом алюминия.

14) Промойте контейнер для проб небольшим количеством растворителя (или дихлорметана, если он используется, рис. 7 c ) и добавьте промывную жидкость в колонку, используя ту же пипетку (чтобы также промыть пипетку).

15) Откройте запорный кран и дайте жидкости капать до тех пор, пока образец не пройдет мимо слоя песка (рис.7 d ) и не попадет в белую область колонки (примените давление воздуха, если это занимает более 20 секунд).

16) Аккуратно промойте стенки колонки вихревыми движениями, используя 1–2 пипетки, наполненные элюентом, чтобы смыть разбрызганную пробу. Опять дайте жидкости стечь (или примените давление воздуха), пока образец не попадет в белый адсорбент.

Повторяйте этап промывки до тех пор, пока не будете уверены, что вся проба осела на адсорбенте. Если часть образца все еще находится в слое песка, она может раствориться в элюенте при добавлении большего количества растворителя, что приведет к потере выхода. Если состав окрашен, смывка должна быть совершенно прозрачной.

Рис.8 а и б ) Заполнение резервуара для растворителя, в и г ) Элюирование колонки

Заполните элюент и элюируйте колонку:

17) Аккуратно добавьте еще элюент с помощью пипетки (рис.8 а ), вращая по бокам, а затем, когда слой песка больше не будет нарушен добавками, осторожно влейте большее количество (рис.8 б ) приготовленного элюента. заполнить резервуар (или залить столько, сколько необходимо). Чистый элюент, собранный при набивке колонки, можно использовать повторно.

18) Используйте давление воздуха, чтобы аккуратно и равномерно элюировать образец через колонку (рис. 8 c и d ). Чем больше раз давление запускалось и прекращалось, тем больше вероятность того, что колонка треснет. Лучше всего, если давление будет оставаться мягким и постоянным все время.

Оптимальная скорость капель во время элюирования зависит от размера колонки. Идеальный поток элюента – это когда растворитель в цилиндрической части колонны над адсорбентом падает со скоростью 5 см в минуту. Следовательно, скорость капель должна быть медленнее при использовании узкой колонки по сравнению с более широкой колонкой. Скорость капель для однодюймовой колонки должна быть такой, чтобы отдельные капли были едва различимы. Поток жидкости, выливающийся из запорного крана при таком размере колонки, немного слишком быстрый.

Рис.9 а) Сбор фракций, г) Запуск колонки

Собирайте фракции:

19) Немедленно начните собирать элюирующую жидкость в пробирки на штативе (рис.9 а ). См. рис. 1, где приведены рекомендации по объемам сбора в каждую пробирку.

20) Когда первая пробирка заполнится или наберется определенная высота жидкости, как рекомендует инструктор или рис. 1, переместите штатив, чтобы начать сбор жидкости в другую пробирку (рис. 9 b и c ) . Наполняйте и храните пробирки на стойке в порядке.

Эти разные трубки называются «фракциями». Цель колонки — собрать достаточно мелкие фракции, чтобы большинство (или некоторые) фракций содержали чистый материал. Если разделение смеси затруднено (если ΔRf компонентов низкое), лучше всего собирать небольшие фракции (например, наполовину заполненные пробирки).

Рис. 10 а) Промывочный материал выплеснулся на кончик колонки, г) Студенты управляют колонкой


21) Когда жидкость стекает с колонки, она часто разбрызгивается на внешнюю часть кончика колонки, а когда растворитель испаряется, вы можете увидеть кольцо материала на кончике (вы увидите кольцо твердого вещества, если компонент представляет собой твердое вещество, как показано на рис. 10 б , или маслянистые капли, если компонент представляет собой жидкость). Если компоненты окрашены, кончик колонки следует промыть (рис. 10 c ), когда кажется, что один компонент полностью элюируется, и до того, как подойдет другой компонент.

22) Периодически следите за уровнем элюента и доливайте его до того, как он упадет ниже слоя песка.

Рис. 11 а) Элюирование, б) Добавление этилацетата для увеличения полярности растворителя, в) Уровень растворителя приближается к слою песка, г) Доливка

Возможно увеличение полярности:

23) Во всей колонке можно использовать один элюент, особенно если разделяемые компоненты имеют одинаковые значения Rf. Однако если компоненты имеют очень разные значения Rf, полярность растворителя может быть увеличена после того, как один компонент элюируется из колонки (рис. 11 а ).

Увеличение полярности растворителя заставит компоненты перемещаться «быстрее». Есть несколько причин, по которым желательно более быстрое элюирование. Во-первых, если один компонент уже вышел из колонки, значит, колонка уже выполнила свою работу по разделению, поэтому ускорение процесса не повлияет на чистоту собранных фракций. Во-вторых, чем дольше работает колонка, тем шире будут полосы компонентов (из-за диффузии), а для сбора широкой полосы материала потребуется (и потеряет) много растворителя.

Рис. 12 Содержит неполный список элюотропных рядов, список распространенных растворителей, ранжированных в соответствии с их «растворяющей способностью» в нормально-фазовой хроматографии. Более полярный растворитель вызывает наиболее резкое увеличение Rf.

24) Чтобы повысить полярность растворителя, полярный растворитель можно капать непосредственно в элюент в резервуаре колонки (рис. 11 б). Например, при использовании смеси гексан:этилацетат добавление чистого этилацетата к элюенту, находящемуся в настоящее время в резервуаре, увеличит его полярность. Если уровень элюента низкий, можно приготовить раствор, содержащий более высокий процент более полярного компонента. Например, если в колонке сначала использовалась смесь гексан:этилацетат 4:1, использование смеси 1:1 будет более полярным растворителем.

25) Элюируйте колонку более полярным растворителем, как и раньше, всегда не забывайте следить за уровнем элюента и доливайте его (рис. 11d ) , прежде чем он упадет ниже слоя песка.

26) Чтобы увеличить полярность растворителя, полярный растворитель можно капать непосредственно в элюент в резервуаре колонки (рис. 11 б ). Например, при использовании смеси гексан:этилацетат добавление чистого этилацетата к элюенту, находящемуся в настоящее время в резервуаре, увеличит его полярность. Если уровень элюента низкий, можно приготовить раствор, содержащий более высокий процент более полярного компонента. Например, если в колонке сначала использовалась смесь гексан:этилацетат 4:1, использование смеси 1:1 будет более полярным растворителем.

27) Элюируйте колонку более полярным растворителем, как и раньше, всегда не забывайте следить за уровнем элюента и доливайте его (рис. 11 d ), прежде чем он упадет ниже слоя песка.

Рис. 13 а) Оригинальная пластинка ТСХ, б) Фракции, собранные колонкой, в) Нанесение фракций на пластину ТСХ, г) Визуализированная пластинка ТСХ с образцами каждой фракцииНайдите и сконцентрируйте нужный компонент

28) При нахождении нужного компонента во фракциях пробирки полезно понять взаимосвязь между Rf и порядком элюирования в колоночной хроматографии.

При колоночной хроматографии образец наносится в начале колонки и элюируется вниз, тогда как при тонкослойной хроматографии образец наносится на дно пластины и элюируется вверх. Таким образом, колонку можно рассматривать как перевернутую пластинку для ТСХ. Соединение с более высоким Rf протекает «быстрее», то есть в конечном итоге оно окажется выше на пластинке ТСХ и будет собрано первым на колонке. В колонке, изображенной в этом разделе, компонент с более низким Rf (оранжевый цвет на пластинке ТСХ на рис. 13а ) является компонентом, собранным вторым из колонки.

29) Сначала определите, в каких пробирках содержится растворенное соединение.
а) Нанесите образец каждой фракции на пластинку для ТСХ, помеченную номерами фракций, соответствующими порядку их сбора (рис. 13 в ). Лучше всего наносить каждый образец 2–3 раза друг на друга на случай, если фракции разбавлены.
б) Если было собрано много фракций, из-за чего вы не решаетесь брать пробу каждой фракции, один из методов определения бесцветных фракций, которые могут содержать соединение, - это поиск намека на остаток в пробирках. После испарения на верхней части пробирки иногда остаются твердый остаток (рис. 13) или маслянистые капли, что свидетельствует о том, что эти фракции содержат не только растворитель. Отберите пробы из всех фракций вблизи пробирок, содержащих видимый остаток.

Рис.14. Кольцо твердого вещества на краях трубок после испарения. в) Визуализируйте пятнистую пластинку ТСХ с помощью УФ-света и/или красителя, чтобы определить, какие фракции содержат соединение (рис. 13 d ).
Рис. 15 а) Элюированные пластинки ТСХ фракций, содержащих возможное соединение, б) Объединение фракций, в) Промывка пробирки для фракций

28) Проведите ТСХ всех фракций, содержащих соединения, определяя до пяти образцов на пластину ТСХ шириной 2,5 см. Для этой цели можно использовать более широкие пластины ТСХ, если таковые имеются.

29) Идентифицируйте соединение с желаемым Rf путем сравнения с исходной пластинкой сырой ТСХ. Выберите сохранение фракций, содержащих желаемое соединение в чистой форме, о чем свидетельствует элюированная пластинка ТСХ. Например, если на фиг.15а желательно соединение с более высоким Rf , следует сохранить фракции 6-10.

30) Чистые фракции объединить в круглодонную колбу подходящего размера (не более чем наполовину, рис.15 б ). Промойте каждую пробирку небольшим количеством элюента (или другого растворителя, если проблема с растворимостью) и добавьте промывную жидкость в круглодонную колбу (рис. 15 c ).

31) Выпарите растворитель на роторном испарителе, чтобы очищенное соединение осталось в колбе.

Рис. 16 а) Использование давления воздуха для сушки колонки, б) Дание колонке высохнуть в перевернутом положении, в) Сбор отработанного кремнезема

Очистите колонку:

32) Чтобы высушить колонку, подайте давление воздуха, чтобы слить большую часть элюента из колонки в контейнер для отходов. Затем дополнительно высушите колонку, используя один из этих методов:
а) Оставьте подключенной слабую струю воздуха, проходящую через колонку, чтобы она дополнительно высохла, пока вы убираете другие вещи (рис. 16 а ).
б) Закрепите колонку вверх дном над большим стаканом для отходов в вытяжном шкафу так, чтобы адсорбент упал после высыхания (рис. 16 б ). Это займет много времени (до следующего урока), но это вариант.

33) После высыхания адсорбент можно слить из колонки в контейнер для отходов в вытяжном шкафу (рис.16 в ).

Примечание по безопасности:

Порошкообразные адсорбенты вызывают раздражение легких, и их опасность усугубляется, если в колонке содержатся остаточные соединения, которые теперь могут попасть в ваши легкие. Заливку порошков кремнезема или глинозема всегда следует производить в вытяжном шкафу.

34) Когда большая часть адсорбента будет собрана в контейнер для отходов, смойте водой остатки твердого вещества в раковину, а затем промойте колонку ацетоном в стакан для отходов. Далее очистите колонку водой с мылом и высушите, отделив части запорного крана.

Устранение неполадок:

В столбце:

Воздушный пузырь — это пустой карман, в котором не происходит равновесия неподвижной и подвижной фаз, поэтому компоненты перемещаются вокруг воздушного пузыря быстрее, чем следовало бы. Это может привести к неравномерному элюированию полос, что может привести к перекрытию, если разделение смеси затруднено (если компоненты имеют очень близкие значения Rf, как на рис. 17).

Рис. 17 Влияние пузырька воздуха на разделение в колонне

Если в колонке видны пузырьки воздуха, а песок или образец еще не были нанесены, хорошенько встряхните колонку во время набивки, чтобы удалить все пузырьки воздуха. Если пузыри не двигаются, обратитесь к инструктору, поскольку, возможно, вы слишком деликатно подходите к выполнению задачи. Если песок или образец уже были нанесены, лучше оставить колонку как есть и надеяться, что пузырьки воздуха не повлияют на разделение.

Полосы элюируются неравномерно:

Если компоненты смеси окрашены, это может быть заметно по искривленному элюированию полос. Скорее всего, это связано с тем, что колонна зажата под небольшой диагональю. Если колонна зажата наклонно, компоненты будут перемещаться наклонно (рис. 18). Это может вызвать проблемы разделения, если компоненты имеют одинаковый Rf.

Рис. 18 Влияние кривого столбика на отрыв

Невозможно решить эту проблему в середине колонки, но если компоненты имеют очень разные значения Rf, наклонные полосы могут не влиять на разделение. В дальнейшем обязательно проверяйте, чтобы колонна была идеально вертикальной как в направлении «бок-в-сторону», так и в направлении «перед-зад».

Report Page