Использование дифракционных методов для анализа структуры, фракционного состава и равновесных взаимодействий биологических макромолекул - Биология и естествознание курсовая работа

Главная

Биология и естествознание
Использование дифракционных методов для анализа структуры, фракционного состава и равновесных взаимодействий биологических макромолекул

Физико-химические свойства полиэтиленгликолей. Сывороточные белки крови, их классификация и функции. Общие и модифицированные липопротеины. Экспериментальное измерение рентгенограмм рассеяния МУРР от анализируемых образцов, его результаты и оценка.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.


ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДИФРАКЦИОННЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ АНАЛИЗА СТРУКТУРЫ, ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА И РАВНОВЕСНых ВЗАИМОДЕЙСТВИй БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ
Процессы, связанные с обменом липидов в организмах, относятся к важнейшим метаболическим процессам. Известно, что различные типы нарушений липидного обмена сопровождаются изменениями фракционного и субфракционного состава сывороточных липопротеинов (ЛП) крови [1-13]. Выявлено участие ЛП в механизмах нарушения липидного обмена, сопровождающих развитие не только атеросклероза, но и целого ряда других патологий (диабет, гепатит, панкреатит и др.). Поэтому для диагностики и профилактики заболеваний людей и животных, а также для оценки эффектов лечений имеется острая необходимость точно и быстро (экспрессно) определять фракционный состав липопротеинов в сыворотках крови. Авторами работ [16-20] была разработана новая методика анализа структуры и фракционного состава ЛП на основе дифракционного метода МУРР. Методика не требует применения дорогостоящих реактивов и позволяет относительно быстро определять фракционный состав ЛП в прямой шкале размеров (радиусов) ЛП частиц и в абсолютных единицах концентраций (мг/дл). В работах [3, 4, 21] было показано, что кровь здоровых людей также содержит до 40% так называемых модифицированных липопротеинов. В связи с этим для диагностики дислипопротеинемий (ДЛП) необходимо измерять концентрации не только общих, но и модифицированных липопротеинов, причем во всех основных фракциях и подфракциях липопротеинов.
Для препаративного выделения модифицированных ЛП из сывороток крови используют полиэтиленгликоли (ПЭГ). Известно, что растворы полиэтиленгликолей способны осаждать из сывороток крови агрегированные иммунные глобулины и иммунные комплексы [1-6]. При различных концентрациях ПЭГ происходит преципитация различающихся по молекулярной массе и размерам иммунных комплексов. Так, например, низкие концентрации ПЭГ (< 3%) осаждают комплексы крупных размеров, высокие концентрации (> 6%) вызывают преципитацию и низкомолекулярных соединений, а 3,5% ПЭГ осаждают наиболее распространенные «промежуточные» комплексы средних размеров.
Дифракционные методы изучения строения нано-частиц вещества, основанные, в частности, на рентгеновском или световом рассеянии, позволяют проводить всесторонние исследования макромолекул в растворе. При рассеянии под малыми углами можно изучать их общее строение, а под средними и большими - особенности их внутренней структуры [14, 15]. Благодаря этому данные методы получили весьма широкое распространение. Дифракционные методы дают информацию о структуре и взаимном распределении рассеивающих масс (неоднородностей электронной или оптической плотности) - информацию, которую невозможно получить другими (недифракционными) методами. Эти физические методы анализа позволяют проводить научные исследования внутренней структуры и дисперсного состава веществ и материалов различных типов: коллоидные растворы и гели биополимеров (белки, нуклеиновые кислоты, вирусы, клетки), а также взвеси органических и неорганических частиц. Исследования и анализы дифракционными методами проводятся с использованием специальных приборов - дифрактометров [14, 15].
Метод малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) позволяет непосредственно определять значения структурных параметров частиц размером от единиц до нескольких тысяч ангстрем. В этот диапазон, как известно, попадают все белки, нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды, липопротеиды и другие макромолекулярные комплексы, а также малые и средние вирусы. С использованием метода МУРР могут быть получены такие важные характеристики биополимеров, как молекулярный вес, размеры, объём, форма частиц, дисперсный состав (распределение по размерам) и целый ряд других параметров [14].
Метод светорассеяния (СР) отличается высочайшей чувствительностью, а применение более длинноволнового излучения (по сравнению с МУРР; отличие может составлять тысячи раз) позволяет определять структурно-дисперсные характеристики рассеивающих частиц размером от 40 нм до нескольких микрон и более [15]. Кроме того, существуют и чисто физические отличия в механизмах взаимодействия излучений с веществом анализируемых частиц: рассеяние в МУРР происходит на неоднородностях электронной плотности, а в СР - на неоднородностях оптической плотности, отличающихся показателями преломления. Поэтому эти два дифракционных метода хорошо дополняют друг друга [14, 15].
Целью настоящей дипломной работы является изучение равновесных и неравновесных молекулярных взаимодействий биологических макромолекул (сывороточных белков крови) с полиэтиленгликолями различной молекулярной массы, включающее следующие задачи:
1. Освоение двух дифракционных методов анализа (МУРР и СР) и новых методик анализа сывороточных белков крови, в частности, липопротеинов (общих и модифицированных).
2. Исследование эффектов молекулярных взаимодействий белков сывороток крови с различными полиэтиленгликолями в допреципитационных и преципитационных стадиях.
3. Математический и статистический анализ полученных экспериментальных данных.
4. Выбор «оптимального» полиэтиленгликоля (определенной молекулярной массы) и определение его оптимальной концентрации для препаративного выделения и анализа модифицированных липопротеинов.
1.1 Физико-химические свойства полиэтиленгликолей
полиэтиленгликоль липопротеин кровь сывороточный
Полиэтиленгликоли - полимеры окиси этилена, используются в качестве растворителей, эмульгаторов, связывающих элементов, загустителей, структурообразующих компонентов [22]. Их общая химическая формула: НО - [СН 2 СН 2 О -] n. Как правило, ПЭГ синтезируют с молекулярными массами от 150 до 40000 Да. При молекулярных массах менее 400 Да ПЭГ находятся в жидкой фазе, а при больших - в порошкообразном состоянии. ПЭГ в растворе способен связываться с протеином различными способами, но существуют преобладающие, например, наиболее часто связывание с белком происходит в азот-содержащих местах или в областях структуры белков, содержащих имидазольную группу гистидина. Кроме того, химические связи ПЭГ с лизином и аргинином, например, препятствуют расщеплению модифицированных молекул трипсином. Одно из важнейших свойств ПЭГ - их высокая гидрофильность [22]. Высокое содержание атомов водорода в молекуле ПЭГ создает водородные связи с молекулами воды, что влечет за собой образование «водного облака» вокруг комплексов «ПЭГ - белок». За счет этого значительно повышается их гидродинамический радиус.
1 .2 Сывороточные белки крови , их классификация и функции
Сыворотки крови состоят из сложной смеси белков с разной структурой и функциями [5]. Разделение на фракции белков методом электрофореза (ЭФ) основано на различной подвижности белков в разделяющей среде под действием электрического поля. Обычно методом ЭФ выделяют 5-6 основных стандартных фракций сывороточных белков: альбумины и 4-5 типов глобулинов (альфа-1 (2), бета-1 (2), и гамма-глобулины.
Фракция альфа-глобулинов включает в себя острофазные белки: альфа1-антитрипсин - ингибитор многих протеолитических ферментов - трипсина, химотрипсина, плазмина. Они обладают широким спектром защитных функций. К альфа-глобулинам также относятся транспортные белки (тироксинсвязывающий глобулин, транкортин, альфа - липопротеины). Их функции: связывание и транспорт кортизола, тироксина и обратный транспорт липидов, соответственно.
Фракция бета-глобулинов содержит трансферрин (белок-переносчик железа), гемопексин (связывает гем, что предотвращает его выведение почками и потерю железа), компоненты комплемента (участвующие в реакциях иммунитета), бета-липопротеины (участвуют в прямом транспорте холестерина и фосфолипидов) и часть иммуноглобулинов.
Фракция гамма-глобулинов состоит из иммуноглобулинов: IgG, IgA, IgM, IgE. Функционально эти макромолекулы представляющих собой антитела, обеспечивающие гуморальную иммунную защиту организма от инфекций и чужеродных веществ. Гамма-глобулины используются в качестве препаратов для профилактики и лечения, главным образом, инфекционных заболеваний. Препараты из них называют также иммуноглобулинами. Гамма-глобулины оказывают губительное действие на вирусы, бактерии, спирохеты и простейшие. Этим определяется их важная роль в предупреждении и лечении ряда инфекционных заболеваний. При введении гамма-глобулинов искусственно создается состояние так называемого пассивного иммунитета. Обычно их получают из крови людей, переболевших определенным заболеванием, или из крови животных, которым специально вводили соответствующие вакцины. Как правило, гамма-глобулины образуются (синтезируются) на второй неделе после начала иммунизации или болезни.
При многих заболеваниях встречается нарушение «нормального» соотношения концентраций фракций белков плазмы крови (диспротеинемии). Диспротеинемии при наблюдении в динамике могут характеризовать стадию заболевания, его длительность, а также эффективность проводимых лечебных мероприятий.
Известно, что поступление и вывод из организма липидов осуществляется с участием липопротеинов (ЛП) крови - сложных белков, транспортирующих липиды к органам тела и от них в печень [4-6]. В настоящее время огромен интерес к изучению структуры и функции ЛП крови, а также к их роли в развитии ряда патологических состояний (дислипопротеинемий (ДЛП)), таких, как инфаркты, инсульты, артериальная гипертензия, диабет и многих других. Сегодня ЛП привлекают внимание ученых и медиков-практиков и как транспортная форма, которая осуществляет перенос не только липидов, но и витаминов, гормонов, различных ксенобиотиков [1-6].
Липопротеины - это очень гетерогенный класс соединений [4-6]. Различают 4 основных фракции ЛП крови, отличающиеся друг от друга соотношением белкового и липидных компонентов, средней плотностью и размером частиц: хиломикроны (ХМ), липопротеины очень низкой (ЛПОНП), низкой (ЛПНП) и высокой плотности (ЛПВП). Сывороточные липопротеины крови представляют собой компактные мицеллообразные структуры - комплексы с гидрофобным ядром из триглицеридов (ТГ) и этирифицированного холестерина (ЭХС) и с гидрофильной оболочкой из аполипопротеинов (апол-белки), фосфолипидов (ФЛ) и свободного (неэтирифицированного) холестерина (НЭХС) [4, 20]. Причем гидрофильная оболочка у ЛП всех классов имеет практически одинаковую толщину, близкую к 22 А, а размеры гидрофобного ядра варьируют в широких пределах [16-20]. Также известно, что липопротеины крови имеют строение, сходное с жидкими кристаллами, но при этом образующие их компоненты (БК, ТГ, ФЛ, ЭХС и НЭХС) связаны друг с другом нековалентно [6].
Модифицированные ЛП образуются в организме из нормально синтезированных и секретированных в кровь ЛП. Причиной модификации обычно является появление свободных радикалов, продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также некоторых метаболитов [3, 4]. Таким образом, к модифицорованным in vivo ЛП относятся перекисно-модифицированные и гликозилированные ЛП, аутоиммунные комплексы ЛП-антитело и агрегированные ЛП.
В настоящее время для анализа ЛП крови и диагностики нарушений липидного обмена применяют ряд физических и химических методов (ультрацентрифугирование, ЭФ и др.) [6]. В работах [16-20] был предложен новый подход к анализу фракционно-компонентного состава сывороточных ЛП крови с использованием метода МУРР. Кроме того, авторами была предложена единая математическая модель строения частиц сывороточных ЛП крови человека. Полученные в данных работах [19, 20] результаты свидетельствуют об эффективности применения метода МУРР для определения фракционно-компонентного состава общих и модифицированных ЛП непосредственно в цельных плазмах или сыворотках крови. Новая методика анализа ЛП в сыворотках крови отличается экспрессностью (0.5 ч на анализ), простотой подготовки образцов для анализов, использованием всего одного вспомогательного реактива (вещества-контрастера типа сахарозы), высокой точностью и разрешением вплоть до отдельных субфракций.
Аутоиммунные комплексы липопротеид - антитело
О наличии циркулирующих в крови иммунных комплексов, содержащих ЛП в качестве антигена, известно давно, однако долгое время оставалось неясным, имеют ли эти комплексы какое-либо отношение к атеросклерозу [3]. Образование циркулирующих в крови иммунных комплексов (ЦИК) «модифицированный ЛП - антитело» можно рассматривать как проявление защитной реакции организма, направленной на быстрое удаление из кровотока модифицированных (т.е. ставших чужеродными) ЛП. Это происходит путем активного захвата иммунных комплексов купферовскими клетками печени [3, 4].
Из всех классов ЛП перекисное окисление липидов (ПОЛ) затрагивает в первую очередь именно ЛПНП [3, 4]. Легкая подверженность ЛПНП пероксидации, очевидно, объясняется особенностями их липидного состава. Основными антиоксидантами этих ЛП являются: б-токоферол, г-токоферол, в-каротин и убихонон-10. ПОЛ в частицах ЛПНП - сложный многоступенчатый и еще не до конца выясненный процесс. Постоянно возникающие в живом организме свободные радикалы O 2 - , HO 2 * и НО * генерируют образование гидроперекисей ненасыщенных ЖК, входящих в состав ФЛ, ТГ и ЭХС липопротеидов низкой плотности. В окисленных ЛПНП обнаружены в повышенных количествах 7-кето-холестерин, 7б- и 7 в-гидроксихолестерины. Перекисной модификации подвергаются также подфракции ЛПОНП, что, несомненно, повышает их атерогенность [4].
Отдельно следует сказать о перекисной модификации фракции ЛПВП. В опытах in vitro изолированные ЛПВП также подвергаются окислению, причем при равных концентрациях холестерина в пробе степень окисления ЛПВП и ЛПНП оказалась практически одинаковой. В частицах ЛПВП окислению подвергаются ненасыщенные ЖК фосфолипидов и эфиров холестерина, а также стероидное ядро и боковая цепь ХС. Кроме того, образование продуктов ПОЛ часто ведет к повреждению апобелков ЛПВП. В первую очередь повреждаются остатки триптофана, а затем уже тирозина и лизина. Это ведет к изменению функциональных свойств ЛПВП и, прежде всего, к ослаблению холестерин-акцепторной функции.
Гликозилированно-модифицированные ЛП
Гликозилирование - весьма распространенный тип модификации белков, в ходе которой происходит неферментативное ковалентное присоединение моносахаридов (преимущественно глюкозы) к аминогруппам белков [5]. Гликозилированию подвергаются все классы ЛП, но по объему наибольшая доля падает на ЛПНП и ЛПВП. Гликозилирование ЛП имеет место и в норме, но особенно активно оно протекает у лиц с повышенным уровнем глюкозы в крови, в частности у диабетиков. Так, если в норме у человека гликозилировано 1,3-2% лизиновых остатков ЛПНП, то у диабетиков эта величина возрастает в 2-3 раза.
Следует особо отметить еще один важный фактор: в ответ на появление в крови гликозилированных ЛП может развиться аутоиммунный ответ с образованием антител на эти ЛП. Было показано [6], что если кроличьи ЛПНП подвергнуть гликозилированию in vitro (блокирование глюкозой 12% e-аминогрупп) и затем вернуть их тому же кролику внутривенно, то в ответ на введение аутологичных гликозилированных ЛПНП образуются антитела.
1 .4 Методы рентгеновской и оптической дифракции
Пусть плоская монохроматическая волна A 0 exp ( ik 0 r ) падает на рассеивающий центр О, который под действием излучения становится источником сферической волны (рис. 1). Тогда в точке наблюдения L, результирующая волна имеет вид [14].
Здесь k 0 и k - волновые векторы падающей и рассеянной волн, |k 0 | = |k|= 2р/л, л - длина волны, А 0 и А 0 b /| r | - амплитуды этих волн, r - вектор, соединяющий точку L с рассеивающим центром в точке О. Амплитуда рассеянной сферической волны равна произведению амплитуды падающей волны и коэффициента b/|r|, где значение b определяется видом падающего излучения и природой рассеивающего центра, находящегося в точке О. Чем сильнее взаимодействие падающей волны с центром О, тем больше коэффициент b . Он имеет размерность длины и носит название длины рассеяния, или амплитуды рассеяния точечного центра. Рассеяние плоской монохроматической волны на реальных объектах, состоящих из совокупности ядер и электронов, можно рассматривать как точечные рассеивающие центры.
Рис. 1. Рассеяние плоской волны точечным центром (а) и ограниченной областью, задаваемой потенциалом ц(r') (б)
Рассеивающую способность произвольного скопления ядер, электронов при облучении их рентгеновскими лучами или светом можно характеризовать рассеивающей плотностью ц(r) - скалярным полем, заданным в ограниченной области пространства. Для рентгеновского рассеяния ц(r) - плотность распределения заряда, в случае света - это оптическая плотность вещества, зависящая от показателя преломления. Взаимодействие волны (рентгеновского излучения или света) с веществом можно представить себе таким образом, что волна электромагнитного излучения взаимодействует со всеми ядрами, электронами и валентными оболочками, которые становятся источниками сферических волн. Суперпозиция этих волн представляет собой первое приближение к реальному рассеянию. Можно показать, что функция
является амплитудой упругого рассеяния на скалярном поле ц(r). Это - так называемое первое борновское приближение, иными словами - приближение однократного рассеяния.
Выражение (2.2) представляет собой интеграл Фурье, т.е. разложение функции f(h) по базисной системе ортогональных функций - экспоненциальных функций exp( ihr ). Решение обратной задачи - нахождения ц(r) при известной функции f(h) - дается обратным преобразованием [14]
Таким образом, преобразования Фурье лежат в основе расчетов амплитуд рассеяния по заданной системе рассеивающих центров и плотности поля рассеяния по заданной амплитуде рассеяния, если, разумеется, выполнены условия первого борновского приближения. При определении атомной и молекулярной структуры вещества стараются всегда так поставить эксперимент, чтобы это приближение (и тем самым взаимные интегральные фурье-преобразования (2.2) и (2.3) для амплитуды и плотности рассеяния) выполнялось. Экспериментально определяется не сама амплитуда рассеяния, а интенсивность I(h), пропорциональная квадрату амплитуды рассеяния:
Щ - телесный угол). Функция I(s) называется интенсивностью рассеяния (название, принятое в рентгеноструктурном анализе и в светорассеянии). Видно, что размерность этой функции - квадрат длины. Важной характеристикой объекта является полная интенсивность (или полное сечение) рассеяния, которая дается интегрированием (2.4) по всем углам:
Главной задачей структурного анализа вещества является восстановление распределения рассеивающей плотности ц(r) по измеренной функции I(h) [14, 15].
С точностью до h 4 имеем разложение интенсивности I(h) в близи точки h = 0 [14, 15]:
Выражение в скобках в правой части (2.6) можно рассматривать как первые два члена разложения в ряд Маклорена функции ехр ( - h 2 R 2 g /3). Поэтому с точностью до членов, пропорциональных h 4 , для начальной части кривой рассеяния можно записать
Это - так называемая формула Гинье, выведенная им еще в 1939 г. [14]. Для установления связи параметров I(0) и R g со строением частицы подставим разложение:
sin(hr)/hr = 1 - h 2 r 2 /6 + h 4 r 4 /120 - h 6 r 6 /5040 +…
Поместив начало координат в центре массы частицы, можно получить выражение:
Это - известное выражение для радиуса инерции частицы относительно ее центра массы.
Таким образом, начальная часть кривой рассеяния вне зависимости от конкретного строения частицы описывается с помощью двух параметров: I(0), который характеризует общее количество рассеивающей материи, и R g , который несет информацию о ее распределении относительно центра массы частицы [14, 15].
Цель дифракционного эксперимента - это измерение интенсивности рассеяния I(h) при определенных величинах модуля вектора рассеяния h = 4 • р • n • (sin и)/л, где n - показатель преломления окружающей частицу среды [14, 15]. Для исследования структуры частиц или вообще каких-либо неоднородностей плотности определенного масштаба нужно иметь возможность вести измерения рассеянного излучения в определенном интервале значений шкалы h, А -1 . Для дисперсных систем с более крупными размерами частиц надо использовать меньшие значения h и наоборот. Поэтому измерения рассеянного излучения необходимо проводить при таких углах рассеяния 2и, при которых реально используемые длины волн (л) излучения не могут существенно превышать межплоскостные расстояния: для рентгеновского излучения это 1 ч 2 А [14].
Формирование весьма узкого пучка первичного излучения, падающего на образец, достигается коллимационной системой первичного монохроматического пучка (рис. 2).
Pиc. 2. Схема формирования первичного и рассеянного излучения при малых углах рассеяния в прямом (а) и обратном (б) пространствах: 1 - источник излучения; 2, 3, 4 - круглые отверстия коллиматора; 5 - образец; 6 - плоскость приемника излучения
Система двух круговых диафрагм малого размера, разнесенных на большое расстояние (по сравнению с размером отверстий), позволяет приблизиться к условиям плоской волны. Величина проекции первичного пучка в плоскости приемника, а в сочетании с выбранным расстоянием от образца до детектора и тот наименьший угол 2и min (соответственно h min ), начиная с которого ведутся измерения интенсивности рассеянного излучения, и определяют разрешение конкретной коллимационной системы. Таким образом, верхний предел размеров неоднородностей, которые могут быть исследованы на данных установках (дифрактометрах), определяется углом 2и min , а нижний предел разрешения всегда соответствует величине 2и = 180 о [14, 15].
2 .1 Измерение рентгенограмм рассеяния от анализируемых образцов
Измерения малоугловых рентгенограмм проводили на дифрактометре фирмы Siemens (Германия) методом пошагового сканирования с использованием гониометра и рентгеновского сцинтилляционного детектора [14]. Малоугловые рентгенограммы измеряли в угловом диапазоне: h = 0.013 - 0.22 А -1 , где h = 4 • р • sin(И)/л; 2И - угол рассеяния. Для измерения рентгеновского рассеяния использовалась кювета из кварцевого капилляра диаметром 0.65 мм и с толщиной стенок 0.01 мм, установленная в металлическую оправу. Длина волны используемого излучения л = 1.54 А, температура образцов при измерении рентгенограмм 20 о С. Непосредственное измерение рентгенограмм МУРР проведено в.н.с. ГНЦ ВБ «Вектор» Тузиковым Ф.В., имеющим соответствующие допуски работы с рентгеновским оборудованием. В рентгенограммы вносились поправки на фоновое рассеяние, поглощение, коллимацию, проводилось сглаживание. Первичная математическая обработка экспериментальных данных МУРР и вычисление функций распределения сферических частиц по размерам выполнялись на ЭВМ PC по алгоритмам, описанным в [14], а также с использованием процедур оптимизации.
На рис. 3 приведена общая схема дифрактометров, в частности, малоуглового дифрактометра.
Рис. 3. Общая схема дифрактометров. 1 - источник излучения (рентгеновская трубка, лазерный источник) с коллиматором; 2 - анализируемый образец; 3 - падающий пучок излучения; 4 - рассеянное рентгеновское или световое излучение, вызванное образцом 2; 5 - приемная щель; 6 - рентгеновский или световой детектор (приёмник рассеянного излучения)
Чтобы исключить рассеяние рентгеновских лучей другими (кроме ЛП) белками крови, в анализируемые образцы плазмы предварительно вводили нейтральное (для структуры биополимеров) рентгеноконтрастное вещество - NaNO 3 , создавая плотность, равную средней плотности гидратированных белков. Плотность растворителей в образцах обеспечивали с помощью формулы [16-20]: m = V ? (с 0 - с с ) ? с к /(с к - с 0 ), где V, с 0 - объем и требуемая конечная плотность растворителя в образце (в сыворотке, плазме и контрольном буфере); с с - исходная плотность жидкого образца; m, с к - масса и плотность используемого сухого вещества-контрастера. Плотность растворителей контролировали пикнометрически. В сыворотках крови учитывали их разбавление за счет объема вещества сухого контрастера и вводили соответствующие поправки на концентрацию.
2 .2 Измерение индикатрисс светорассеяния
Прибор для измерения светорассеяния от анализируемых образцов (световой дифрактометр) состоял из одного фотодетектора и 14 лазерных монохроматических источников, установленных по внутреннему периметру камеры светорассеяния. В центр камеры помещали образец, а управление установкой и получение значений интенсивности производили при помощи компьютера. При этом поочередно включались лазерные источники и рассеянное излучение попадало в фотоприемник (детектор), после чего сигнал с приемника поступал на фотоэлектронный умножитель, откуда через аналоговый цифровой преобразователь передавался на компьютер. Индикатриссы светорассеяния измеряли в угловом диапазоне 2И = 33,75 ч 67,5 0 (h = 0.0011 ч 0.0022 А -1 ), где h = 4 • р • n ? sin(И)/л; n - показатель преломления буферной смеси (~1,35). Длина волны используемого светового излучения л = 4300 А, температура образцов при измерении индикатрисс 20 0 С. В индикатриссы вносили поправки на фоновое рассеяние и поглощение излучения образцом.
Калибровку прибора проводили для контроля влияния факторов, влияющих на точность измерений эффектов светорассеяния (состояние чистоты кюветы, аппаратные искажения и помехи). Для этого регулярно измерялись индикатриссы рассеяния (зависимости интенсивности рассеяния от угла) для стандартного образца (Daw Latex, Sigma, полистерин, диаметр частиц 2R = 0,234 мкм). Известно, что радиус инерции (Rg) и радиус (R) для однородной сферы связаны, как [14].
Для всех полученных в работе экспериментальных данных был проведен математический и статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента для средних арифметических (результаты считали достоверными при Р < 0,05).
2 .3 Титрование сывороток крови полиэтиленгликолями
Для титрования и анализа модифицированных ЛП методом МУРР предварительно в сыворотки и плазмы крови добавляли растворы ПЭГ до необходимой концентрации, после чего эти смеси инкубировали при 8 о С в течение 18 ч [1, 2]. Осадки отделяли центрифугированием (центрифуга Т-51, Германия) при 6000 об/мин в течение 30 мин. Для растворения осажденных иммунных комплексов к осадку добавляли физиологический раствор (pH 7,4) в объеме исходной сыворотки [3]. Окончательную диссоциацию иммунных комплексов, включающих и модифицированные ЛП, проводили путем добавления сухого NaNO 3 , используемого в качестве контрастера.
При титровании сывороток крови ПЭГ методом светорассеяния пластмассовую или стеклянную цилиндрическую кювету заполняли буферной смесью (физиологический раствор, 750 мкл, pH 7,4). Далее добавляли 100 мкл сыворотки и тщательно перемешивали, после чего производили титрование растворами ПЭГ по 5 или 10 мкл вплоть до достижения запланированных конечных концентраций. При каждой концентрации ПЭГ производили измерение интенсивностей рассеянного света (по четырем точкам углов рассеяния). Из полученных данных с использованием специальной программы вычислялись средние значения радиусов инерции (Rg) образованных комплексов «ПЭГ - белки», а также значения интенсивностей светорассеяния в нулевом угле (I(0)) [14, 15].
3 .1 Экспериментальные данные по светорассеянию
На рис. 4 приведена индикатрисса светорассеяния от стандартного образца в координатах Гинье (ln I(h), h 2 ). Видно, что точки индикатриссы рассеяния хорошо соответствуют линейному графику и высокой монодисперсности частиц латекса. Значение радиуса инерции (Rg = 912 ± 15 А), вычисленное из наклона этого графика оказалось близко к ожидаемому (Rg = 906 А) для данного стандартного образца (частицы стандартизованного латекса - однородные сферы).
Для изучения особенностей взаимодействия различных ПЭГ с белками сывороток крови нами были выбраны ПЭГ с молекулярными массами от 1000 до 20000 Да. Были приготовлены растворы ПЭГ в физрастворе с максимальными концентрациями (с учетом их растворимости). Для удобства экспериментов необходимо было привести все ПЭГ к одной объемной концентрации. Для этого измеряли индикатриссы светорассеяния от каждого из приготовленных исходных растворов ПЭГ. Как и следовало ожидать, для частиц в растворе с молекулярными массами от 1 до 20 кДа индикатриссы светорассеяния практически не отличались от констант (из-за соотношения длины волны света (4300 А) и размера молекул ПЭГ (20-100 А)). Поскольку известно, что , где С, М - концентрация и средняя молекулярная масса рассеивающих частиц, соответственно, то это позволяет определять необходимые коэффициенты разведения [15]. На рис. 5 приведены графические зависимости экспериментальных интенсивностей светорассеяния в нулевой угол (I(0)) до и после приведения их к одной концентрации.
Рис. 4. График Гинье для стандартного образца (Daw Latex, Sigma, полистерин, диаметр частиц 2R = 0,234 мкм). .
Рис. 5. Зависимость интенсивностей светорассеяния в нулевом угле (I(0)) для различных ПЭГ в исходном (черные точки) и приведенном состоянии концентраций (светлые кружочки).
(кроме ПЭГ-20000, у которого предельная концентрация разведения оказалась существенно ниже, чем у других ПЭГ). Таким образом, все концентрации используемых ПЭГ были приведены к концентрации 250 мг/мл, что соответствует примерно 25% объемной и весовой концентрации.
Таблица 1. Результаты титрования объединенной сыворотки ПЭГ-6000. Объем исходного буфера V = 750 мкл (метод светорассеяния)
Интенсивности светорассеяния, имп/сек
Рис. 6. Графики Гинье для объединенной сыворотки, титруемой ПЭГ-6000 (метод светорассеяния). Нижние графики соответствуют меньшим концентрациям ПЭГ-6000, а верхние - большим, соответственно
Рис. 7. Значения интенсивностей светорассеяния (I(0)) от комплексов «ПЭГ-белки», образующихся в объединенной сыворотке крови при взаимодействии сывороточных белков с различными ПЭГ
Рис. 8. Средние значения радиусов инерции (Rg) комплексов «ПЭГ-белки», образующихся в объединенной сыворотке крови при взаимодействии сывороточных белков с ПЭГ-4000, ПЭГ-6000 и ПЭГ-8000
Рис. 9. Значения параметра 10 14 *I(0)
Использование дифракционных методов для анализа структуры, фракционного состава и равновесных взаимодействий биологических макромолекул курсовая работа. Биология и естествознание.
Сочинение Воображение По Тексту Саши Черного
Реферат Особенности Развития Ощущений У Детей
Дипломная работа по теме Формирование социальных компетенций в условиях дополнительного образования в санаторно лесной школе
Стороны в арбитражном процессе: права и обязанности, процессуальное соучастие, правопреемство
Курсовая работа по теме Рынок недвижимости (жилья) и проблемы его формирования в России
Лабораторная Работа По Химии Химическая Посуда
Реферат На Тему Кризисные Явления Современной Белорусской Семьи. Отношение К Браку
Реферат: СМИ и целевая аудитория
Организация Логистического Управления Реферат
Реферат: Союз Мьянма. Скачать бесплатно и без регистрации
Сочинение по теме Айвенго. Скотт Вальтер
Реферат по теме Особенности проведения занятий по плаванию с детьми от 1 до 3 лет
Реферат: Проблемы химического разоружения и пути их решения
Реферат: Система прав і свобод громадянина, закріплених Конституцією України
Реферат: Закон Мура. Скачать бесплатно и без регистрации
Научная Разработанность Курсовой Работы
Реферат На Тему Аналіз Теорій Економічної Інтеграції В Реальному Секторі Провідних Західних Вчених. Можливість Застосування Теоретичних Концепцій Економічної Інтеграції України З Єеп
Сравните Данные Ниже Темы Сочинений Какие
Реферат: Probation And Parole Essay Research Paper Prison
Развитие Рынка Диссертация
Техника безопасности во время школьного похода - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда реферат
Иван Михайлович Сеченов и его произведение "Рефлексы головного мозга" - Биология и естествознание реферат
Электробезопасность на производстве - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда реферат