Микрофлюидика и мультиомики

В статье мы рассмотрим один из вопросов применения микрофлюидики. А именно ее широкие возможности для синг-селл мультиомики, когда ученые изучают не просто информацию одной модальности, а стараются «выжать» из одной клетки все возможные данные. Например, одновременно проанализировать сложные регуляторные сети, связанные с вариациями на уровне генома, особенности модификаций эпигенома и экспрессии транскриптома, а также протеома. Причем анализировать с высокой чувствительностью обнаружения, точностью и скоростью!

Клеточная гетерогенность

Известно, что даже в сходных условиях генетически идентичные клетки гетерогенны. При взаимодействии друг с другом клетки вырабатывают вещества, которые могут индуцировать пути передачи сигнала в других клетках. Это способствует разнообразию внутри клеточных популяций. Важно изучать это разнообразие и исследовать новые неопределенные ранее цитотипы.  

В клеточной биологии и при изучении заболеваний человека существуют массовые (bulk) методики. Однако они показывают усредненный уровень экспрессии популяций и маскируют гетерогенность. А технологии одиночных клеток помогают уловить скрытые свойства!

Что дает мультиомика отдельных клеток

За последние десятилетия исследования генома, эпигенома и транскриптома достигли значительных успехов благодаря появлению секвенирования нового поколения. В частности, Illumina стала преобладающей платформой для генерации массивов данных. Однако моноомики (mono-omics или single omics) не могут полностью описать клеточную гетерогенность. Недавно было разработано множество технологий одноклеточной мультиомики (single cell multiomics), в фокусе которой находятся геном, эпигеном, транскриптом и протеом одновременно. Интеграция данных разных модальностей обеспечивает куда более полную и наглядную оценку гетерогенности, чем моноомика единичных клеток. 

На первом этапе анализ генома отдельных клеток позволяет исследовать геномную гетерогенность путем выявления динамических изменений в ДНК, таких как вариации числа копий (copy number variation) и снипы. Когда закодированная в геноме информация реализуется в экспрессии генов, свою роль начинает играть эпигеном. Поэтому на втором этапе эпигенетическое профилирование имеет фундаментальное значение для понимания механизмов, управляющих клеточной памятью из поколения в поколение и регуляцией экспрессии генов. Транскриптом, в свою очередь, преобразуется в различные клеточные фенотипы, которые могут быть обнаружены с помощью анализа протеома.

Достижения мультиомики отдельных клеток способствуют лучшему пониманию механизмов, участвующих в онкогенезе, иммунном ответе, развитии зародыша. Соответственно, эти знания уже полезны во многих областях, включая изучение рака, неврологию и эмбриологию.

Как микрофлюидика помогает мультиомике

Микрофлюидика стала незаменимым инструментом для одноклеточных мультиомных методологий. Миниатюрные «лаборатории-чипы» с микронными структурами и каналами для выделения клеток и манипулирования ими позволяют сократить трудоемкие и времязатратные операции. Закрытые реакционные камеры размером от пиколитра (10^-12 л) до микролитра концентрируют субстрат (ДНК, РНК, белки и т.д.) и изолируют его от внешних факторов, повышая эффективность реакции и точность обнаружения.

Кроме того, уменьшение объема реакции сводит к минимуму расход реагентов, делая мультиомный анализ доступным для лабораторий общего профиля. А еще микрофлюидика легко масштабируется: на чипах могут идти тысячи манипуляций с отдельными клетками для получения интегрированных наборов данных.

Среди микрофлюидных технологий выделяют 3 основные схемы: капельную микрофлюидику, микрофлюидику на основе клапанов и цифровую микрофлюидику (DMF). Поговорим о каждой подробнее.

Капельная микрофлюидика

Классическая капельная микрофлюидика использует масляную фазу для отделения водной фазы с образованием водных капель, стабилизированных поверхностно-активным веществом. При слиянии двух несмешивающихся жидкостей отдельные клетки оказываются заключены в капли таким образом, что количество инкапсулируемых клеток на каплю определяется распределением Пуассона.

Метод на основе разделения капель приобрел популярность для секвенирования отдельных клеток благодаря очевидным преимуществам: он прост в изготовлении и пригоден для крупномасштабной обработки. На этом технологическом базисе построен весь single cell RNA-seq: метод Drop-seq или коммерческая платформа 10X Chromium. 

Цифровая микрофлюидика

Цифровая микрофлюидика (DMF) — это технология обработки жидкости, позволяющая управлять отдельными каплями с помощью внешнего поля, построенного на принципе электросмачивания диэлектрика (EWOD). С помощью DMF капли можно распределять, перемещать, объединять и разделять программно в соответствии с заданной траекторией. Благодаря преимуществам автоматизации DMF подходит для обнаружения ДНК, обработки белков и анализа клеток.

Опишем механизм работы системы на основе DMF под названием DISCО, предназначенной для целевого лизиса одиночных клеток и восстановления клеточного содержимого. Платформа DMF содержит гидрофильные участки, проходя которые, клеточная суспензия разбивается на более мелкие капли, образуя виртуальные микроячейки, содержащие клетки. После этого на целевую клетку подается высокоэнергетический лазерный импульс, приводящий к образованию локализованной плазмы, не нарушающей работу соседних клеток. Вызванный плазмой кавитационный пузырь расширяется, сжимается и разрушает клеточную мембрану, высвобождая клеточное содержимое, которое затем секвенируют.

Микрофлюидика на основе клапанов

В микрофлюидных устройствах на основе клапанов применяются мягкие эластомерные мембраны, которые отклоняются для пропуска или перекрытия потока жидкости. Разделение ячеек с одиночными клетками достигается гидродинамически с помощью множества клапанов и насосов для контролируемого введения реагентов. Это позволяет проводить серию реакций для создания библиотек РНК и ДНК из отдельных клеток. Схема на основе клапанов используется в таких технологиях выделения РНК, как Fluidigm C1 и Paired-seq.

Пространственная мультиомика

В заключении коснемся одного из перспективных подходов в области мультиомного анализа — пространственной мультиомики одиночных клеток. В 2020 году группе ученых благодаря микрожидкостным технологиям удалось создать метод пространственной мультиомики DBiT-seq. Он позволил изучать и транскриптом, и протеом, и тем самым получать более точную информацию о клеточных типах, да еще и представлять, как они распределены в 3D.

Методы мультиомики отдельных клеток сейчас находятся «на волне» и играют все более заметную роль в задачах определения клеточного разнообразия, идентификации новых цитотипов, отслеживания траекторий дифференцировки клеточных линий и расшифровки механизмов регуляции между омиками. Без микрофлюидики это вряд ли стало возможным.

Мы рассмотрели интересные детали из мокрой части, а о биоинформатической обработке данных сингс-селл омик будем подробнее говорить на курсе по RNA-секвенированию. Стартуем 25 октября.