Выделение секреторных гранул из лимфоцитов - Биология и естествознание курсовая работа

Главная

Биология и естествознание
Выделение секреторных гранул из лимфоцитов

Основные типы лимфоцитов по функциональным и морфологическим признакам как клеток иммунной системы и ее ключевого звена. Дезоксирибонуклеазы секреторных гранул лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА. Методы выделения и изучения лимфоцитов.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования
"КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ"
ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ
Специализация: 012307 - Молекулярная биология
ВЫДЕЛЕНИЕ СЕКРЕТОРНЫХ ГРАНУЛ ИЗ ЛИМФОЦИТОВ
Научный руководитель д. б. н., профессор кафедры биохимии
секреторная гранула лимфоцит иммунная
· Т-лимфоциты выполняют функцию регуляции иммунитета. Т-помощники стимулируют выработку антител, а Т-супрессоры тормозят ее.
· NK-лимфоциты осуществляют контроль над качеством клеток организма. При этом NK-лимфоциты способны разрушать клетки, которые по своим свойствам отличаются от нормальных клеток, например, раковые клетки. Содержание Т-лимфоцитов в крови составляет 65-80 % от общего количества лимфоцитов, В-лимфоцитов - 8-20 %, NK-лимфоцитов - 5-20 %. В образовании антител центральная роль принадлежит B-лимфоцитам. При этом B-лимфоциты обеспечивают специфический приобретенный иммунитет совместно с другими малыми лимфоцитами - T-лимфоцитами, используя разнообразные механизмы, направленные в большинстве случаев на расширение пределов эффективности врожденного иммунитета.
Лимфоциты класса T образуются в зобной железе, или тимусе, откуда они и получили свое обозначение - "T": предшественники T-лимфоцитов поступают в тимус, где и происходит их созревание. T-лимфоциты подразделяются на ряд подклассов. Главные из них это две различные, неперекрывающиеся субпопуляции: клетки одной из них несут маркер CD4 и в основном "помогают" в осуществлении иммунного ответа или индуцируют его (T-хелперы), клетки другой несут маркер CD8 и обладают преимущественно цитотоксической активностью (цитотоксические T-лимфоциты (T-киллеры).
Optima L-90K: 1 000 - 90 000 об/мин, с шагом 100 об/мин Optima L-100K: 1 000 - 100 000 об/мин, с шагом 100 об/мин
По таймеру до 99 часов 59 минут в режим HOLD
±5 мл или 10% при объёме менее 5 мл
Используется экологически безопасный хладогент
- быстрый: от 0 об/мин до заданной скорости;
медленный: от 0 до 500 об/мин, далее быстрый разгон до установленной скорости
медленное (до 500 об/мин быстрое торможение, далее медленная остановка;
9 программ, устанавливаемых пользователем,
220-240 В,20 А, 50 Гц (однофазный ток)
Зонально-скоростное центрифугирование
От технически грамотного осуществления процесса ультрацентрифугирования зависит успех эксперимента, а также сохранность и срок службы дорогостоящей машины. Поэтому давайте разберемся, что представляет собой метод ультраценрифугирования.
Особенности этого типа центрифугировнаия отражены в названии: "скоростное", потому что частицы разделяются по скорости оседания, причем плотность их значительно больше, чем плотность среды, и "зональное" так как частицы разных размеров оседают более или менее ограниченными слоями - зонами. Частицы разных размеров очищаются не раздельно, а одновременно, при одном центрифугировании.
Исходную смесь частиц наносят в виде тонкого слоя на более плотную среду, заполняющую весь объем пробирки бакет-ротора. В ходе центрфугирования наиболее тяжелые частицы быстро продвигаются ко дну пробирки. За ними с отставанием, но тоже в виде отдельного слоя, двигаются менее крупные частицы, затем еще более мелкие и т.д. Таким образом, образуются дискретные зоны, или полосы частиц, отличающихся друг от друга скоростью оседания. [7]
Идея метода состоит в создании такого градиента по длине пробирки (в бакет-роторе), чтобы плотность среды центрифугирования у дна была больше, чем у наиболее плотных частиц, а у мениска - меньше, чем у наименее плотных. При достаточно длительном центрифугировании частицы будут перемещаться вдоль градиента до тех пор, пока не достигнут положения, в котором плотность среды равна их плавучей плотности. Движение прекращается, частицы различной плотности располагаются в разных участках градиента. Таким образом, осуществляется фракционирование частиц по их плотности.
Такое разделение имеет следующие особенности:
1. Размеры частиц и их массы не будут сказываться на окончательном распределении. Положение на градиенте будет определяться только плотностью частиц.
2. Движение частиц к положению равновесия будет происходить как из области более низкой плотности градиента, чем их плавучая плотность, так и из области более высокой плотности. Таким образом наряду с седиментацией будет происходить и флотация. Это означает, что нет необходимости наносить тонкий начальный слой препарата на жидкость, заполняющую пробирку. Можно даже весь препарат смешать с полным объемом градиентной среды.
3. Процесс центрифугирования должен быть весьма длительным, так как при подходе к положению равновесия частицы будут двигаться очень медленно.
4. Вязкость среды в связи с этим является нежелательным фактором.
5. При равновесном ультрацентрифугировании возможна заметно большая загрузка препаратом, чем при зонально-скоростном центрифугировании.
6. В области равновесия частицы расположатся в виде полосы, ширина которой определится соотношением двух процессов:
концентрирования за счет седиментации - флотации и тепловой диффузии частиц. Эта ширина будет тем меньше, чем круче градиент плотности среды и чем больше масса частиц - увеличение массы уменьшает склонность к диффузии. [7]
Электрофорез (от электро - и греч. рhoresis - несение, перенесение) - метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к передвижению во внешнем электрическом поле. Передвижение частиц при электрофорезе зависит от ряда факторов, основными из которых являются: напряженность электрического поля, величина электрического заряда, скорость и размер частицы, вязкость, рН и температура среды, а также продолжительность электрофореза [8].
Физический принцип метода заключается в следующем: биологические макромолекулы несут определённый электрический заряд благодаря наличию групп, способных к электролитической диссоциации и концентрации протонов в среде (рН). Под действием электрического поля, в зависимости от знака суммарного заряда положительно заряженные макромолекулы перемещаются к катоду (отрицательно заряженному электроду), а отрицательно заряженные - к аноду (положительному электроду), причём трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. Такое явление носит название электрофореза. Электрическое поле создают в токопроводящих растворах с помощью электродов. [2]
Факторами, обусловливающими подвижность биополимеров в геле, являются: суммарный заряд, масса, форма, линейные размеры макромолекулы и пор геля.
Основой электрофоретического разделения является разная скорость движения заряженных молекул в электрическом поле. Подвижность возрастает с увеличением суммарного заряда. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одинаковой скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине дорожки.
С другой стороны, разделяемые молекулы движутся в геле. Природа любого геля - ситоподобная структура, в которой молекулы воды удерживаются внутри трехмерной сетки, образованной длинными полимерными молекулами. Используемые гели содержат много жидкости (80-99.5%), в которой (т.е. в рабочем буфере) мигрируют макромолекулы. Фракционируемые макромолекулы любых размеров сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду и снижает скорость движения молекул: чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к месту нанесения, чем меньшие (в агарозном, крахмальном и полиакри-ламидном гелях).
Электрофорез ДНК . В основе разделения нуклеиновых кислот электрофорезом в агарозном геле лежит принцип молекулярного сита, так как нуклеиновые кислоты имеют отрицательный суммарный электрический заряд, обусловленный диссоциацией остатков фосфорной кислоты. Величина заряда мало зависит от рН окружающей среды и для всех нуклеиновых кислот отношение заряда к массе практически одинаково, поэтому фракционирование их при электрофорезе идёт за счёт различия размеров и формы молекул. Скорость миграции и эффективность разделения различных образцов нуклеиновых кислот в агарозном геле определяется размером молекул и их конформацией, концентрацией агарозы, напряжённостью электрического поля [8].
ДНК: молекулярная масса измеряется в парах азотистых оснований (base-pairs, англ.), сокращенно - bp, соответственно - килоbp (1000 bр) или кbр.
Молекулы одинакового размера, но различной формы, например фибриллярные и глобулярные белки, обладают разной подвижностью из-за различий в силе трения и электростатического взаимодействия с окружающей средой.
Буфер создает и стабилизирует рН носителя и, тем самым, влияет на скорость миграции разделяемых веществ. С ростом рН ионизация органических кислот возрастает, а оснований, наоборот, уменьшается, и, следовательно, меняется их электрофоретическая подвижность. Оптимальное значение рН рабочего буфера обусловливает не максимальный заряд, а максимальное различие зарядов разных белков исходной смеси.
Рабочие значения напряжения и тока подбирают не только с учетом обеспечения теплоотвода, как для белков, но и с таким расчетом, чтобы напряженность электрического поля в геле не превышала 5 В/см геля. При больших значениях напряженности поля крупные молекулы нуклеиновых кислот могут, деформируясь, "протискиваться" через поры геля независимо от своей массы. Видно, что проведение электрофореза при высоком напряжении эквивалентно уменьшению длины геля и область эффективного разделения ДНК в агарозном геле снижается.
Особенности электрофореза белков . Белки - это цвиттер-ионы, т.е. молекулы, имеющие и положительно ( + ) заряженные и отрицательно ( - ) заряженные радикалы. Поэтому молекула белка в растворе при любом рН, отличным от изоэлектрической точки, имеет определенный преобладающий заряд ( + ) или ( - ) и мигрирует к соответствующему полюсу в постоянном электрическом поле. Позднее был разработан метод ступенчатого электрофореза (диск - электрофорез (от англ. "discontinuous" - прерывистый). Отличительная особенность диск-электрофореза - это полимеризация на пластине двух гелей: рабочего (мелкопористого) и над ним - "формирующего" (крупнопористого) геля. Диск-электрофорез - метод, сочетающий в себе разделение белков по их общему электрическому заряду, по величине молекулярной массы и по форме. Использование двухслойного носителя с различным размером пор и двух буферов, отличающихся между собой по составу и рН, обеспечивает концентрирование исследуемых белков в узкой стартовой зоне. Это важно для чёткого разделения смеси белков.
Раствор, в котором мигрируют белки, удерживается сеткой полиакриламидного геля (ПААГ). ПААГ служит при электрофорезе поддерживающей средой и принимает активное участие в процессе разделения макромолекул благодаря эффекту молекулярного сита.
В качестве носителя при диск-электрофорезе используют ПААГ, который имеет структуру трехмерной сетки. Получают его сополимеризацией акриламида и сшивающего агента N,N метиленбисакриламида. Подбирая соответствующую концентрацию акриламида получают гель с нужным размером пор. При работе с глобулярными белками пользуются соотношением между средней молекулярной массой белков (М) и концентрацией (С) акриламида, которую надо взять для полимеризации, например (см. табл.2):
Таблица 2. Выбор концентрации акриламида в зависимости от мол. массы белка
В качестве катализаторов при получении ПААГ - геля используют персульфат аммония и N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД). Варьируя концентрацией полимера можно получить гели с широким диапазоном пор.
Для удобства изложения используются следующие обозначения: Т - процентное отношение суммарной массы обоих мономеров к объему их раствора, С - процентное отношение массы метиленбисакриламида (Бис) к общей массе обоих мономеров.
На практике для исследования белков часто Т составляет 30 %, а С-2,6 %. Чтобы приготовить растворы используют следующий расчет:
Количество Бис > Т С / 100 = 302,6/100=0,76г.
Количество акриламида > 30 г - 0,76 г =29,24 г.
Навески акриламида и бис-акриламида растворяют в 100 мл дН 2 О.
Характеристика миграции белков . Электрофоретическая подвижность биополимеров в геле (Rf?) пропорциональна их подвижности в свободной жидкости ( Rf O ), которая определяется отношением суммарного заряда макромолекулы к её массе. Фактором, обуславливающим отличие Rf ? от Rf O , является сила трения о гель. Сила трения зависит от соотношения линейных размеров белков и пор геля, и, следовательно, от молекулярных масс белков. Молекулярные массы большинства белков не превышают 500000, поэтому использование гелей агарозы не целесообразно. Как правило, электрофорез белков проводят в ПААГ, содержащем от 5% до 20 % акриламида.
Как говорилось выше, белки являются цвиттер-ионами. Их суммарным зарядом, а, следовательно, и отношением заряда к массе можно управлять изменением рН буфера, в котором полимеризуется ПААГ и ведется электрофорез. Оптимальное значение рН рабочего буфера обуславливает не максимальный заряд, а максимальное различие зарядов разных белков, составляющих смесь. Таким образом, рН рабочего буфера не должно слишком отличаться от изоэлектрических точек всех белков смеси (при изоэлектрической точке все белки имеют нейтральный заряд). Для кислых белков оптимальные значения рН - нейтральное или слабощелочное. Белки мигрируют от катода ( - ) к аноду ( + ). Для щелочных белков (гистонов, белков рибосом и т.д.) целесообразно использовать слабокислые буферы (рН = 4 - 5). Эти белки различаются по величине суммарного положительного заряда и мигрируют в направлении от анода ( + ) к катоду ( - ). Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда.
Для однозначного определения молекулярной массы белка по скорости его миграции при электрофорезе полипептидную цепочку распрямляют (рис.1). Такой приём используется при электрофорезе белков, обработанных додецилсульфатом натрия (ДСН - C 12 H 25 OSO 3 Na).
Разделение белков по размеру с использованием додецилсульфата натрия (ДСН). Суть метода. Электрофорез в ПААГ-ДСН позволяет фракционировать белки только по молекулярной массе. Для этого белки обрабатывают трёхкратным избытком ДСН-Na (1,4 мг ДСН-Na на 1 мг белка). Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют. Постоянство соотношения детергент/белок делает постоянным отношение () заряда к массе любого белка. Благодаря электрическому отталкиванию остатков серной кислоты на поверхности белка полипептидная цепочка распрямляется и приобретает форму жёсткого эллипсоида вращения (рис.2).
Рис. 2. Схематичное изображение полипептидной цепочки после добавления ДСН
Размер малой оси эллипсоида равен 1,6 нм, большой - линейно связан с числом аминокислотных остатков, т.е. с молекулярной массой.
Электрофоретическая подвижность (Rf?) связана с молекулярной массой белка (М) соотношением: Rf? = A - B lg M, где А и В - коэффициенты пористости геля и др. условий.
Величину электрофоретической подвижности (Rf) определяют в относительных единицах, выражающих отношение пути миграции белка к миграции бромфенолового синего за время электрофореза .
Одновременно проводят электрофорез белков-"маркёров", молекулярные массы которых известны. [9]
Буфер для разделяющего геля (с 0,4% ДСН)
Разделяющий гель заливали между стеклами камеры, не доводя до верха 2 см, и оставляли полимеризоваться 40 мин.
Готовили 4,5% концентрирующий гель по схеме:
Буфер для концентрирующего геля (с 0,4% ДСН)
Наносили концентрирующий гель поверх застывшего разделяющего геля и вставили гребёнку. Оставили полимеризоваться 20 мин.
После полимеризации устанавливали стеклянную камеру в аппарат для электрофореза, заливали камеру электродным буфером, убирали гребенку.
Пробы прогревали на водяной бане при 96 О С в течение 3 мин, с последующим охлаждением до 20 О С.
Электрофорез вели при постоянной силе тока. До входа образцов в Р.Г. - ток 20 мА, основной режим - 40-45 мА. Когда полоса БФС дошла до границы геля, электрофорез останавливали.
После электрофоретического разделения гель помещали в кристаллизатор, содержащий раствор 7% уксусной кислоты и 20% спирта (1ч - 24ч) для фиксации.
Окрашивание серебром . Гель отмывали четыре раза по 5 мин в б/дН 2 О. Гель переносили на 20 мин в 50% -ный раствор этилового спирта, затем ополаскивали в течение 5 мин в б/дН 2 О. Переносили в раствор 50% -ного спирта, содержащего 0,05% формальдегида, на 15 мин, отмывали 5 мин в б/дН 2 О, вновь переносили в 50% -ный раствор этилового спирта, отмывали два раза по 5 мин в б/дН 2 О. Воду сливали и гель заливали свежеприготовленным раствором аммиачного серебра. Для получения 100 мкл красящего раствора (0,36-0,4) г азотнокислого серебра растворяли в 50 мл б/дН 2 О, добавляли 100 мкл 45% -ного NaOH и титровали до полного растворения коричневого осадка 10% -ным раствором свежеприготовленного аммиака (не более 2 мл!), доводили общий объем до 100 мл б/дН 2 О. Окрашивание вели не более 15 мин при постоянном встряхивании, чтобы серебро не успело осесть на поверхность геля. Гель переносили в б/дН 2 О и промывали пять раз по 1 мин. Заливали свежее приготовленным раствором проявителя, содержащим 0,038% формальдегида / 0,005% лимонной кислоты. Если белковые полосы не проявлялись, гель отмывали в 0.5% растворе красной кровяной соли, промывали в б/дН 2 О, пока гель не станет прозрачным, и повторяли процедуру окрашивания серебром. Время появления полос (6 мин). Гель промывали в б/дН 2 О в течение 2 ч, сменяя воду каждые 5 мин.
1 - белковый экстракт гранул на интермитирующей стадии;
2 - белковый экстракт гранул на персистирующей стадии;
68кДа-БСА, 45кДа - ЯА, 29кДа - карбоангидраза: (окрашивание нитратом серебра);
Рис. 3. Электрофореграмма белков гранул лимфоцитов в полиакриламидном геле.
Дорожки 1 и 2 - образцы экстракта гранул, 3 - маркеры.
Молекулярные массы белков из секреторных гранул составляют: 66 069, 63 095, 50 108, 68 000, 60 255 Да.
Общая характеристика B-лимфоцитов. Характеристика субпопуляций, рецепторы и маркеры В-лимфоцитов. Антигенраспознающие рецепторы B-клеток: общая характеристика. Субпопуляции В-лимфоцитов, распознание антигенов рецепторами иммуноглобулиновой природы. реферат [495,4 K], добавлен 02.10.2014
Метод пульс-электрофореза для разделения ДНК индивидуальных хромосом. Выделение ДНК из клеток, лишенных клеточной стенки и измерение конечной концентрации ДНК. Выделение ДНК из культивируемых клеток: лимфоцитов, прокариот, грибов и растительных клеток. контрольная работа [576,0 K], добавлен 11.08.2009
Основные функции иммунной системы. Генез Т- и В-лимфоцитов. Общие закономерности нарушений иммунной системы. Способность организма отвечать на действие антигена клеточными и гуморальными реакциями. Процессы развития патологических процессов в организме. реферат [391,2 K], добавлен 23.09.2014
Первичные (центральные) и вторичные (периферические) органы иммунной системы. Ведущая роль вилочковой железы (тимуса) в регуляции популяции Т-лимфоцитов. Костный мозг как орган иммунной системы. Контроль селезенки за цитологическим составом крови. реферат [17,7 K], добавлен 29.10.2011
Анализ регуляторной, терморегуляторной, дыхательной, гомеостатической, питательной и защитной функций крови. Исследование форменных элементов крови. Химический состав тромбоцитов. Характеристика сферы действия лейкоцитов. Место лимфоцитов в системе крови. презентация [630,7 K], добавлен 27.01.2016
Морфологическая разнообразность лимфоцитов, экспрессирование ими особых у каждой субпопуляции поверхностных маркеров. Различие Т-клеток по своим антигенраспознающим рецепторам. Дифференцировка В-клеток, активация Т и В-клеток, вызывающая синтез маркеров. реферат [17,0 K], добавлен 26.09.2009
Специфичность и ее значение, взаимодействие антигена и антитела. Основные элементы иммунной системы организма, селекция антител, структура белковой молекулы. Теория "клональной селекции", возникновение разнообразия лимфоцитов или их предшественников. реферат [21,8 K], добавлен 05.06.2010
Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д. PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах. Рекомендуем скачать работу .

© 2000 — 2021



Выделение секреторных гранул из лимфоцитов курсовая работа. Биология и естествознание.
С Давыдов Духовно Музыкальные Сочинения Ноты Скачать
Сочинение По Обществознанию В Чем Смысл Жизни
Реферат: Becks Musical Genius Essay Research Paper Music
История Развития По Реферат
Сочинение Я Хочу Стать Художником
Реферат: Сучасна екологічна криза в контекст християнського світогляду
Контрольная работа: Порядок складання позовної заяви та касаційної скарги
Бесплатные Школьные Сочинения
Курсовая работа по теме Анализ финансового состояния ОАО 'Производственный холдинг 'Здрава'
Курсовая работа по теме Виды и свойства алгоритмов. Решение задачи Майхилла (о стрелках)
Реферат: Концепции развития современных технологий
Контрольная работа по теме Особенности коневодства в современной России
Контрольная работа по теме Демократия и гражданское общество
Реферат: Геоэкологические условия размещения агрогородков Гомельской области
Изложение: Как отследить задержки в работе ЭД-системы
Реферат: Выбор материалов и режимов термической обработки в зависимости от условий работы деталей и элеме
Этический Кодекс Организации Курсовая
Реферат: Тематические группы наречий в произведениях официального делового стиля
Сочинение Сила Природы Пример Из Литературы
Конфликты в группе
Чрезвычайные ситуации природного характера - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда презентация
Принцип действия ядерного реактора. Критерии оценки аварий на АЭС - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда реферат
Проектирование и расчет баз газодымозащитной службы по обслуживанию противогазов - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда контрольная работа