Вплив іонів міді, кадмію та заліза на активність та ізоферментний спектр гваякол пероксидази тютюну - Биология и естествознание курсовая работа

Главная

Биология и естествознание
Вплив іонів міді, кадмію та заліза на активність та ізоферментний спектр гваякол пероксидази тютюну

Дія стресу, викликаного іонами важких металів. Дослідження змін активності гваякол пероксидази та ізоферментного спектру гваякол пероксидази рослин тютюну в умовах стресу, викликаного важкими металами. Роль антиоксидантної системи в захисті рослин.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Міністерство освіти, науки, молоді та спорту України
Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича
факультет біології, екології та біотехнології
кафедра молекулярної генетики та біотехнології
Вплив іонів міді, кадмію та заліза на активність та ізоферментний спектр гваякол пероксидази тютюну
Науковий керівник к.б.н., доцент І.І. Панчук
молекулярної генетики та біотехнології
доктор біологічних наук, професорР.А. Волков
1.1 Вплив важких металів на рослинний організм
1.2 Роль антиоксидантної системи в захисті рослин
1.2.1 Загальна характеристика гваякол пероксидази
Розділ 2. Матеріали та методи дослідження
2.1 Рослинний матеріал та умови стресу, викликаного важкими металами
2.2 Визначення активності гваякол пероксидази
2.4 Визначення ізоферментного спектру гваякол пероксидази
2.5 Техніка безпеки праці в лабораторії
Розділ 3. Результати та їх обговорення
3.1 Зміна активності гваякол пероксидази рослин N. tabacum за дії стресу, викликаного іонами важких металів
3.2 Ізоферментний спектр водорозчинної фракції гваякол пероксидази за дії стресу, викликаного іонами важких металів
В природних умовах на рослинні організми постійно діють біотичні та абіотичні стресові фактори довкілля. Це кліматичні та едафічні умови - надмірна кількість води, високі і низькі температури, дисбаланс поживних речовин та мінеральних елементів тощо. Крім природних чинників існують такі, що спричинені діяльністю людини - антропогенні фактори. Серед них - накопичення іонів важких металів, вплив яких на рослинний організм є важливим для вивчення [22, 25, 30].
Важкі метали (ВМ) - одні з основних хімічних забруднювачів довкілля через їх швидке накопичення у ґрунті та легкодоступність для рослин. Надлишкове надходження металів в екосистеми в результаті антропогенного впливу часто призводить до незворотних змін та порушення життєвоважливих функцій у більшості організмів [3]. Тому за останні роки підвищилась зацікавленість у вивченні їх впливу на рослинний організм. Іони металів необхідні для росту і розвитку рослинного організму, але в надмірних кількостях токсично впливають на нього. Цим вони зумовлюють зміни на всіх рівнях метаболізму, зокрема сприяють утворенню активних форм кисню (АФК). Такі процеси провокують відповідь антиоксидантної системи, яка складається з ферментативної та неферментативної ланок. Пероксидази та глутатіон редуктаза належать до ферментативної ланки захисту - відповідно знешкоджують пероксид водню та відновлюють окиснений глутатіон [24]. До неферментативної ланки належать аскорбат та глутатіон, що виконують функцію антиоксидантів [43]. Аскорбат знешкоджує супероксид аніон шляхом перетворення його у пероксид [27, 35], а глутатіон відновлює дисульфідні зв`язки у білках та здійснює детоксикацію гідропероксидів [15].
Для вивчення механізмів відповіді рослинної клітини на дію ВМ важливо оцінити різноманітні показники оксидативного стресу, такі як вміст відновленого і окисленого аскорбату, глутатіону, а також активність гваякол пероксидази і глутатіон редуктази.
Тому метою даної роботи було дослідити зміни активності гваякол пероксидази та ізоферментного спектру гваякол пероксидази рослин тютюну в умовах стресу, викликаного ВМ.
Відповідно до поставленої мети було сформовано ряд наступних завдань:
1. Визначення відносної активності водорозчинної фракції гваякол пероксидази Nicotiana tabacum W38 контрольних та стресованих рослин тютюну.
2. Визначення відносної активності солерозчинної фракції гваякол пероксидази Nicotiana tabacum W38 контрольних та стресованих рослин тютюну.
3. Порівняння ізоферментного спектру гваякол пероксидази Nicotiana tabacum W38 за дії іонів міді, кадмію, заліза та за нормальних умов.
1.1 Вплив важких металів на рослинний організм
В природі рослини знаходяться під впливом різноманітних стресових чинників [23], джерелом яких є зміни умов довкілля [19], такі як посуха, високі та низькі температури, затоплення, нестача чи надлишок мінеральних речовин, зокрема іонів металів [31], засолення, низькі температури, інтенсивне освітлення [22] тощо. Останнім часом у зв`язку з бурхливим промислово-технологічним прогресом у біосфері відбувається накопичення важких металів [6]. Стрес, викликаний іонами ВМ, впливає на габітус, анатомо-морфологічні, молекулярно-фізіологічні характеристики та розвиток рослин [23].
Важкими металами умовно називають хімічні елементи з атомною масою більше 50 а.о.м., які володіють властивостями металів та металоїдів. З хімічної точки зору термін «важкі метали» використовується для елементів густиною більше 5 г/см 3 [29]. До ВМ належать: свинець, мідь, цинк, нікель, кадмій, кобальт, стибій, олово, бісмут, ртуть, платина, срібло, вольфрам, залізо, золото, марганець. До екологічно значущих важких металів відносять: свинець, кадмій, ртуть, стибій, марганець, нікель, кобальт, цинк, мідь, залізо, молібден [4].
Більшість ВМ життєво необхідні (есенціальні) для живих організмів. До них належать такі важкі метали як марганець, нікель, мідь, кобальт і цинк, які разом із залізом і молібденом входять до складу ферментів або їх активаторів [4]. У невеликих концентраціях вони необхідні для нормальної життєдіяльності рослин як мікроелементи. Мікроелементи беруть участь в ключових метаболічних процесах, активують багато ферментів, здійснюють перенесення електронів в енергоспряжених мембранах хлоропластів та мітохондрій у складі металоензимів [3].
Але підвищені концентрації ВМ у навколишньому середовищі можуть призводити до малоспецифічних фізіологічних і біохімічних змін [3]. Дослідження показують, що вплив іонів ВМ викликає підвищення активності ферментативної антиоксидантної системи [43]. Загальними проявами стресу, викликаного надлишком ВМ, визначають:
· утворення активних форм кисню [3];
Рослини можуть і пристосовуватись до змінених умов зростання. Так, відомо, що, не маючи механізмів специфічного захисту до металів, протягом еволюції рослини розвинули стійкість до токсичної дії металів. На сьогодні відомі конститутивні механізми, які забезпечують стійкість до важких металів (білки теплового шоку - БТШ, ліганди, фітохелатини, металотіонеїни та ін.), які надають рослинам змогу акумулювати токсичні елементи в метаболічно інертних органах і органелах, або хелатувати, тобто переводити їх у фізіологічно безпечні форми. Проте універсального механізму, який би забезпечував стійкість рослини до кількох ВМ, не існує [5].
Кадмій. Кадмій - один з найбільших токсичних полютантів, знайдених у повітрі, воді та грунті, що не є есенціальним для рослин. Цей метал впливає на фотосинтезуючий, дихальний та азотний обмін, і як наслідок - зниження біомаси, пригнічення росту кореня, пагона, та навіть смерть рослини [33]. Кадмій зумовлює виникнення жовтих та коричневих плям на листках рису [15]. Це мобільний метал, який здатний до накопичення не лише в коренях та листках, а й у зерні [3]. Так, з літератури відомо, що протягом стресу кадмій інтенсивніше накопичується в молодих листках кукурудзи. В коренях накопичення відбувається повільніше, але концентрація металу набагато більша [4].
Кадмій пригнічує ростові процеси значно більше, ніж Zn 2+ і Pb 2+ , оскільки за хімічним властивостями подібний до цинку і завдяки цьому заміщує його в металобілкових комплексах ферментів, інгібуючи їхні функції [4]. Відомо, що за впливу концентрацій кадмію 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5 мМ на проростки рапсу (Brassica napus) спостерігалось значне пригнічення їх росту порівняно з контрольними (не піддавались впливу металу), а на 4 тиждень досліду - загибель усіх піддослідних рослин [5].
Кадмій знижує поглинання кисню клітинами кореня та ізольованими клітинами тютюну. Він пригнічує транспорт електронів та протонів у мітохондріях, що може призводити до порушення роботи електрон-транспортного ланцюга. Фотосинтез також чутливий до дії кадмію, оскільки хлорофіл є мішенню для впливу іонів цього металу - кадмій здатний заміщувати магній в молекулі порфірину [20]. Також цей метал інгібує активність ключових ферментів гліколізу та пентозофосфатного окиснювального шляху, порушує водний баланс рослини. Викликає оксидативний стрес у рослинах шляхом генерування вільних радикалів та активних форм кисню [33].
Встановлено, що одноденний стрес кадмієм лише дещо зменшує активність гваякол пероксидази та глутатіон редуктази в коренях кукурудзи [33, 40]. Також цей метал може індукувати пошкодження хромосом, але ця його здатність менша порівняно зі свинцем, який вважається менш отруйним для клітин. Показано, що обробка насінин Crepis capillaries 0.01 М розчином CdCl 2 протягом години підвищувала частоту перебудов хромосом на 1.69% порівняно з контролем, а 27-годинна експозиція за тієї ж концентрації - лише на 0.21 %. Відома також здатність цього металу підвищувати частоту утворення мікроядер за поділу клітин коренів Vicia faba та Allium cepa за дії концентрацій 5 та 50 мкМ розчину CdCl 2 протягом 24 годин [4].
Мідь. Мідь посідає особливе місце серед інших металів - є обов'язковим елементом для росту і розвитку рослин, водночас її солі є відомими токсикантами. Як і інші есенціальні метали, мідь необхідна в невеликих кількостях, відіграючи вирішальну роль в процесах росту та розвитку рослин, оскільки є кофактором багатьох ферментів і бере участь в утворенні їх конформації [11, 18, 26, 39, 43].
Попри її фізіологічно зумовлену необхідність підвищення вмісту міді становить небезпеку для рослинного організму та його нормального функціонування тим, що може викликати руйнування ліпідів та білкових складових мембран. Останнім часом вона стає все більш небезпечною через інтенсивне використання її у фунгіцидах, пестицидах, добривах тощо [11, 18, 26, 39, 43].
Як і будь-який інший важкий метал, купрум токсичний навіть за низьких концентрацій. Відомо, що вплив міді викликає зменшення площі листової пластинки, сухої маси кореня та пригнічення росту рослин томату. Зміни у морфології кореня, такі як уповільнене видовження та збільшене формування бічних коренів також пов'язане з різким зменшенням активності оксидази індолілоцтової кислоти під дією високих концентрацій міді [11, 18, 26, 39, 42, 43].
Токсична дія міді проявляється в ультраруйнуванні структури та впливі на біохімічні процеси (зміни в перенесенні електронів в електрон-транспортному ланцюгу, пошкодження мембран тилакоїдів тощо). Це - перехідний метал, який бере участь в окисно-відновних реакціях. У надлишку вона може спричинити оксидативний стрес завдяки тому, що пошкоджує біомакромолекули шляхом зміни їх окисно-відновного потенціалу, виснажує пул глутатіону. Також порушує сульфгідрильний гомеостаз - вільні іони металу можуть незворотньо зв'язувати SH-групи каталітичних центрів ферментів. Зумовлює зміни проникності мембран, структури хроматину, синтезу білків, активності ферментів (зокрема, підвищує активність супероксиддисмутази, каталази, гваякол пероксидази). Також викликає пероксидне окиснення ліпідів та активує старіння клітин. Проявляє порівняно низьку мутагенну активність [11, 18, 26, 39, 43].
Показано, що в персика (P. сerasifera) під дією 100 µМ міді відбувалось суттєве підвищення активності каталази та супероксиддисмутази - активація їх генів. Це свідчить про те, що P. сerasifera є толерантним відносно купруму - здатний мобілізувати такі компоненти антиоксидантного захисту як каталаза та супероксиддисмутаза для пом'якшення негативного впливу надлишку міді [26].
Вплив іонів купруму протягом 8 днів за концентрації 50 µМ значно пригнічує активність гваякол пероксидази та аскорбат пероксидази у листках і коренях томату. Це компенсується підсиленням активності супероксиддисмутази та каталази [18].
Залізо. Залізо - есенціальний елемент для всіх рослин, оскільки виконує багато важливих біологічних функцій у клітинних процесах. Так, цей метал бере участь у процесі фотосинтезу, розвитку хлоропластів, входить до складу каталітичної групи багатьох клітинних редокс-систем, таких як гемопротеїни (цитохроми, каталаза, пероксидаза) і залізосірковмісні протеїни (фередоксин, аконітаза, супероксиддисмутаза), каталізує початкові етапи синтезу хлорофілу [3,28, 32].
Водночас ферум належить до ВМ і за низьких концентрацій може бути токсичним для рослин. Токсичність його пов'язана з високим рівнем поглинання коренями Fe 2+ та транспортом у листки з висхідним током. У соняшника може виникати хлороз, викликаний заміною феруму іншими ВМ в активних центрах ферментів, зокрема міддю та кадмієм [26].
Надлишок іонів цього металу викликає утворення вільних радикалів. Відомо, що надлишок заліза викликає пригнічення процесів фотосинтезу в тютюну та сої внаслідок оксидативного стресу. В свою чергу, відбувається підвищення активності аскорбат пероксидази. Також за дії цього металу збільшується концентрація пероксиду водню, фенольних сполук та зменшується кількість хлорофілу і розчинних білків. У рису надлишок заліза викликає накопичення його в коренях, зменшення вмісту хлорофілів, розчинних білків, підвищену активність каталази, пероксидази [28].
Відомо, що іони заліза, вивільняючись з активного центру ліпоксигенази при виході поліненасичених жирних кислот зі складу мембрани, можуть знижувати активність антиоксидантних ферментів. Також іони цього металу можуть спричинювати акумуляцію пероксиліпідів у рослин [38]. Нестача заліза викликає інгібування синтезу хлорофілу, зменшення активності каталази та аскорбат пероксидази в рослин огіркової трави (Borago officinalis) [32].
Тобто ВМ індукують оксидативний стрес в клітинах та тканинах наступними шляхами:
1) переносять електрони в одноелектронних реакціях, які стимулюють утворення вільних радикалів. Т.з. перехідні метали (Fe, Cu, Mn та ін.), які мають неспарені електрони на їхніх орбіталях, приймають та віддають такі електрони на кисень, що провокує утворення АФК, їх взаємоперетворення та оксидоредукцію;
2) порушують метаболічні шляхи, особливо в тилакоїдних мембранах, як наслідок - утворюються вільні радикали та АФК;
3) змінюють активність антиоксидантних ферментів (пероксидази, каталази, супероксиддисмутази), які знешкоджують АФК;
4) накопичення ВМ зменшує пул низькомолекулярних антиоксидантних сполук, таких як глутатіон, який використовується для утворення фітохелатинів [29].
Відомо, що гомеостаз клітини підтримується рівновагою між численними метаболічними шляхами, які проходять у різних органелах. Різні стресові фактори можуть порушити цю рівновагу, що призводить до оксидативного стресу та як наслідок - надпродукції активних форм кисню [6, 23]. Вони виникають внаслідок переходу атомів кисню у збуджений стан або в окисно-відновних реакціях (ОВР). АФК утворюються в реакціях одно-, дво- та триелектронного відновлення кисню в результаті спонтанного та ферментативного окиснення, а також у фотоіндукованих реакціях. АФК поділяються на: вільнорадикальні частинки (супероксидний аніон-радикал (О 2 •- ), гідроксильний радикал (ОН • ), пероксидні радикали (RO 2 • ) та ін.) та нейтральні молекули (пероксид водню (Н 2 О 2 ), синглетний кисень ( 1 О 2 ), озон (О 3 ) та ін.) [6].
За нормальних умов АФК постійно генеруються у хлоропластах, мітохондріях, мікросомах та плазматичній мембрані рослинної клітини [25]. Це - токсичні вторинні продукти аеробного метаболізму. Водночас вони виступають регуляторами росту, розвитку і захисту: здійснюють контроль та регулюють всі біологічні процеси в клітині - ріст, клітинний цикл, апоптоз, гормональну передачу сигналів, дихання, утворення АТФ, фотосинтез тощо [6].
Посилення утворення АФК - одна з неспецифічних реакцій живих організмів на дію біотичних та абіотичних стресових факторів. За дії абіотичних чинників вони пошкоджують важливі клітинні компоненти, такі як ДНК, білки та ліпіди: АФК викликають окислювальні пошкодження білків, що проявляється в окисненні -SH груп і FeS-центрів ферментів, появі фрагментації пептидних ланцюгів і підвищенні чутливості білків до протеаз. Вільні радикали здатні прямо взаємодіяти з ДНК, викликаючи пошкодження азотистих основ, дезоксирибози та появу нових ковалентних зв`язків (зшивок). Непряма дія активних форм кисню полягає у їх утворенні під час виходу з різних компартментів іонів кальцію та активації ними нуклеаз. Загальновідомим є те, що надлишок вільних радикалів кисню ініціює програму апоптозу клітини. Також вони відіграють роль сигнальних молекул, які активують гени ферментів, що беруть участь в захисних реакціях клітини [6].
Рослина здатна утилізувати АФК, включаючи їх в різноманітні метаболічні процеси, наприклад, під час утворення лігніну, опадання листя та квіток, старіння клітин, дозрівання плодів та цвітіння [19]. Також рослинні організми захищаються тим, що переводять вільні радикали в менш активні форми [22].
Згідно відомостей з літератури, причиною оксидативного стресу є не стільки продукція АФК, скільки порушення часово-просторового балансу між їх генерацією та видаленням [6].
1.2 Системи антиоксидантного захисту рослин
Життя в аеробних умовах вимагало створення системи захисту від змін, викликаних абіотичним стресом. Протягом еволюції рослини розвинули складну стрес-специфічну антиоксидантну систему для підтримання балансу та ефективного функціонування клітини [17, 34].
Компоненти антиоксидантної системи, пов`язані з контролем рівня АФК, чутливі до змін клітинного окисно-відновного балансу та здатні активувати необхідні метаболічні процеси [25]. Відомо, що існує дві ланки антиоксидантної системи: ферментативна та неферментативна. Супероксиддисмутаза, пероксидази (аскорбат-, глутатіон-, гваякол-), каталаза, глутатіон редуктаза, ферменти, що окиснюють та відновлюють аскорбат - до ферментативної. Токофероли, флавоноїди, каротиноїди, глутатіон та аскорбінова кислота належать до неферментативної ланки антиоксидантної системи. Обидві складові системи антиоксидантного захисту ефективно регулюють концентрацію АФК у клітині та організмі в цілому [10, 13, 19, 21, 23, 26].
Глутатіон редуктаза (GR, NADPH-залежна глутатіон оксидоредуктаза; ЕС 1.6.4.2.) - фермент, який відновлює глутатіон за рахунок окиснення НАДФН + .
GSSG + 2 H + + 2 NADPH -> 2 GSH + 2 NADH +
NADPH регенерує з допомогою глюкозо-6-фосфат дегідрогенази та ізоцитрат дегідрогенази, які каталізують окиснення. В цьому випадку NADPH виступає ко-субстратом. Коли глутатіон редуктаза не здатна впоратися з надлишком глутатіону дисульфіду в клітині, клітина може активно утилізувати його за рахунок енергії АТФ. Також цей фермент включений до циклу знешкодження АФК у хлоропластах, які є дуже чутливими до оксидативного стресу [E. Kulikowska-Karpiсska, 2004; Suk-Yoon Kwon, 2001]. Глутатіон редуктаза та аскорбат формують аскорбат-глутатіоновий цикл - один з шляхів знешкодження пероксиду водню [23].
В A. thaliana було ідентифіковано два гени - gr 1 і gr 2, які кодують цитозольну та пластидну ізоформи глутатіон редуктази відповідно [21].
За дії теплового стресу (45С та вологості 30% протягом п'яти днів) активність GR зростала на 52.36% у термотолерантних проростків Brassica juncea, в той час як у чутливих до дії високих температур рослин цей показник становив всього 33.73% [36].
У листках дині (Cucumis melo L.) за дії сольового стресу також зростає активність GR [41].
Глутатіон (д-глутамілцистеїнілгліцин) - трипептид, у якого при розчиненні у воді підсилюються відновні властивості, що зумовлено наявністю тіольної групи. Синтезується з глутаміну, цистеїну та гліцину. В клітині глутатіон присутній у високих концентраціях в цитоплазмі, мітохондріях та ядрі (5-10 мМ), а в ендоплазматичному ретикулумі менше - всього 2 мМ. У мітохондріях глутатіон - основна складова з інших компонентів неферментативної антиоксидантної системи. Більше 99% глутатіону в клітині знаходиться у відновленій формі (GSH), і лише незначна частина - в окисненій (дисульфід, GSSG) [24].
Відновлений глутатіон (г-Glu-Cys-Gly, GSH) - завдяки унікальному окисно-відновному потенціалу та нуклеофільним властивостям здатний захищати клітину від токсичного впливу ксенобіотиків, вільних радикалів, засолення, закислення та ВМ (мідь, срібло, цинк, хром), з якими утворює стійкі комплекси - фітохелатини, таким чином нівелюючи прояв токсичності ВМ [15, 24].
Відомо, що генетично модифіковані рослини A. thaliana зі зниженим вмістом глутатіону, були більш чутливими до дії Cd через їх обмежену здатність до утворення фітохелатинів. Основна властивість глутатіону - знешкодження активних електрофільних сполук та роль своєрідного внутрішньоклітинного «відновного буферу» [15, 24].
Глутатіон - важливе джерело небілкових тіолів для рослинної клітини, тому відіграє вирішальну роль у її життєдіяльності. Цей трипептид - частина антиоксидантного аскорбат-глутатіонового циклу, який допомагає попередити або мінімізувати шкоду, спричинену АФК. Функція знешкодження АФК включає окиснення тіольних груп, переважно утворюючи глутатіон дисульфід (GSSG). Глутатіон бере безпосередню участь у реакції знешкодження та видалення ліпідних пероксидних радикалів у реакції нуклеофільного атакування гідропероксидів глутатіон-S-трансферазою [38]. Також бере участь у підтримці тіольних груп білків у відновленій формі, що важливо для збереження активності білків. Глутатіон може впливати на окисно-відновні умови певних білків через не ензиматичний обмін SH/SS груп. Тобто він поєднує ензиматичний та неензиматичний захист клітинних структур від окиснення [24].
L-аскорбінова кислота (вітамін С, аскорбат - AsA) - ендіольна форма д-лактону 3-кето-гулонової кислоти. Молекула кислоти складається з ендіольної групи [-(OH)=C(OH)-], відповідальної за окисно-відновні властивості. Вона володіє сильними кислотними властивостями, тому є важливим антиоксидантним фактором у водному середовищі [24].
Аскорбінова кислота - нестабільна сполука, чутлива до нагрівання, особливо в присутності кисню, та ВМ (заліза, міді). Вона окиснюється до L-дегідроаскорбату з допомогою вільнорадикального L-монодегідроаскорбату:
L-аскорбінова кислота - вільний аскорбільний радикал - L-дегідроаскорбат
У водному розчині молекула кислоти дуже нестабільна - лактонне кільце може спонтанно розгортатися, утворюючи дикетогулонову кислоту, гідроліз якої спричинює втрату активності. Дегідроаскорбат ефективно захищає мембранні ліпіди від переокиснення міддю [24].
Основна функція аскорбінової кислоти - участь в реакціях гідроксилювання, наприклад, гідроксилази, яка є кофактором у синтезі колагену і вимагає наявності аскорбату. В організмі рослин аскорбат відіграє роль антиоксиданту, що реагує з АФК та попереджує пошкодження ДНК. Разом з цитохромами а і с, піримідинами та флавіновими нуклеотидами, глутатіоном аскорбат формує відновну систему, яка регулює окисно-відновний потенціал клітини. Необхідний для регенерації б-токоферолу [24, 35].
Показано, що за низької концентрації (50 мМ) та присутності іонів транзитних металів аскорбат проявляє пероксидні властивості через встановлення оптимального співвідношення Fe 3+ /Fe 2+ та Cu 2+ /Cu + , відновлення яких підтримує перекисне окиснення НАДФН + -залежних ліпідів. За вищої концентрації аскорбат інтенсивно відновлює Fe 3+ до Fe 2+ , чим інгібує перекисне окиснення НАДФН + -залежних ліпідів [24]. Серед антиоксидантів аскорбат - ключова сполука у механізмі знешкодження АФК, особливо пероксиду водню. Реакція аскорбінової кислоти з Н 2 О 2 може відбуватись прямо або каталізуватись APX. Відновлення її каталізується прямо відновленим фередоксином фотосистеми I та монодегідроаскорбат редуктазою (MDHAR), дегідроаскорбат редуктазою (DHAR) та GSH [23].
Тому аскорбат - важливий антиоксидант, що функціонує як термінальний антиоксидант аскорбат-монодегідроаскорбатної пари через його окисно-відновний потенціал, який є набагато меншим за потенціали більшості вільних радикалів. В оброблених тріазолом рослинах у листках та коренях збільшувався вміст аскорбату [37].
1.2.1 Загальна характеристика гваякол пероксидази
Гваякол пероксидаза належить до класу III - класичних пероксидаз рослин. Це гемвмісний глікопротеїн, що кодується величезною мультигенною родиною у рослин. Ці пероксидази глікозильовані, містять 4 дисульфідних зв'язки та 2 катіони кальцію на молекулу ферменту [2]. Залежно від характеру локалізації у рослинних клітинах розрізняють: розчинні (містяться у вакуолях та цитоплазмі), іонозв'язані (локалізовані в мембранах та клітинній стінці) та ковалентно зв'язані (знаходяться в основному в клітинній стінці) форми пероксидази. Кожна форма представлена численними ізоферментами. Пероксидази класу III кодуються великою кількістю генів - 73 генами в Arabidopsis thaliana L. та 138 генами в Oriza sativa L. [8].
Гваякол пероксидаза відіграє вирішальну роль у життєдіяльності клітини - бере участь у процесах, пов'язаних з лігніфікацією, розгалуженням полісахаридів клітинної стінки, окисненням фенольних сполук, видовженням клітин. Зміни (підвищення або зниження) активності цього ферменту можуть свідчити про зміни у процесах фотосинтезу, транспірації, дихання, газообміну [16].
За впливу холодового стресу +5С на 5-й день активність апопластичної POD набагато зростає у листках зимової пшениці [16].
Зростання активності розчинної пероксидази спостерігалося за короткочасного 42С теплового стресу у проростках сортів пшениці степового екотипу. Також відмічали підвищення термостабільності ферменту, пов'язане з індукованим синтезом нових ізоформ ферменту [8].
Підвищення активності гваякол пероксидази також може свідчити про наявність вільних іонів ВМ (Cu, Pb, Zn тощо), які не можуть зв'язатись з клітинними стінками чи накопичитись у вакуолях. Тобто активність POD може бути індикатором стресу, викликаного іонами ВМ та використовуватись для передбачення змін стану рослинного організму [16].
Дослідження показують, що 10-денний вплив 100 µМ концентрації міді викликає значне підвищення активності гваякол пероксидази у коренях Phaseolus vulgaris [43] та в стеблах проростків кукрудзи [13].
Рослини розвинули складні адаптивні механізми для захисту від негативного впливу іонів ВМ. Активну участь в механізмі захисту бере гваякол пероксидаза, механізми відповіді якої на стрес ВМ ми поставили за мету з'ясувати у цій роботі.
2.1 Рослинний матеріал та умови стресу, викликаного важкими металами
Рослинний матеріал та умови культивування
Дослідження проводились на рослинах Nicotiana tabacum лінії W38.
Для дослідження ролі гваякол пероксидази в умовах стресу, викликаного іонами міді, кадмію та заліза, використовували рослини Nicotiana tabacum лінії W38, вирощені у ґрунті за сталої температури + 26 0 С та 16-годинного світлового дня. Полив рослин здійснювали по мірі висихання ґрунту.
Для забезпечення швидкого проникнення іонів ВМ рослинам 5-6 тижневого віку, що росли на ґрунті, у воді гострим лезом відокремлювали надземну частину від кореневої і місцем зрізу занурювали у 0,5х MS, в яке додавали іони Cu 2+ або Cd 2+ або Fe 2+ до кінцевої концентрації 0.1, 0.5 та 5 мМ. Контролем слугували рослини, які поміщали у 0,5х MS без додавання металів. Стресову обробку рослин проводили у темряві протягом 2-х та 12-ти годин.
Після стресу рослини заморожували у рідкому азоті та зберігали в морозильній камері за температури -70 0 С для подальших досліджень.
2.2 Визначення активності гваякол пероксидази
Визначення активності гваякол пероксидази проводили за методом, описаним в літературі [12].
Для екстракції білку використовували екстракційний буфер, що містив: 50 мМ натрій-фосфатний буфер (рН 7.0), 0.25 мМ ЕДТА, 10% гліцерин, 2.5 мМ аскорбат. До екстракційного буферу додавали рослинний матеріал, розтертий у рідкому азоті, та центрифугували на центрифузі Biofuge pico при 14 000 g протягом 15 хв. Після центрифугування відбирали супернатант та до вимірювання активності зберігали на льоду. Осад ресуспендували у буфері, що містив: 1 М NaCl, 0.2 М натрій-фосфатний буфер (рН 7.0), дистильовану воду та інкубували за температури 30 0 С з постійним перемішуванням протягом 2-х годин. Після цього центрифугували на центрифузі Biofuge pico при 14 000 g протягом 15 хв і використовували супернатант для подальших досліджень.
Загальну активність гваякол пероксидази вимірювали спектрофотометрично за довжини хвилі л=470 нм. В реакційну пробу до 975 мкл реакційного буферу додавали 25 мкл білкового екстракту та спостерігали появу коричневого забарвлення. Активність ферменту виражали як зміну оптичної густини тетрагваяколу на 1 мг білка в пробі за 1 хв. Отримані результати перераховували у відсотки, приймаючи активність ферменту в інтактних рослинах за 100%. Кожний експеримент виконувався у 4 біологічних та 3 аналітичних повторностях. Одержані результати опрацьовували статистично з використанням критерію Стьюдента [7].
Кiлькiсть бiлку визначали спектрофотометрично за методом Бредфорда [14]. Для цього до 995 мкл реактиву Бредфорда додавали 5 мкл білкового екстракту та перемішували. Суміш інкубували протягом 10 хв та проводили вимiрювання за довжини хвилi 595 нм. Кількість білку в екстракті визначали за допомогою калібрувального графіка, побудованого зі стандартним розчином білку. Як стандарт, використовували бичачий сироватковий альбумiн.
2.4 Визначення ізоферментного спектру гваякол пероксидази
Виявлення ізоферментних спектрів гваякол пероксидази в ПААГ в нативних умовах проводили за загальноприйнятою методикою, описаною в літературі [1].
Гель для електрофорезу готували як вказано в таблиці 1.
Приготування ПААГ для проведення електрофорезу білків у нативних умовах
В кожну лунку гелю наносили в середньому по 10 мкг білку. Електрофорез проводили за напруженості протягом 3 годин. Після закінчення електрофорезу гелі протягом 15 хв інкубували в буфері, що містив 50 мМ натрій-ацетатний буфер (рН 5.0) та 0.08 М гваякол. Після цього гелі поміщали у 0.01% Н 2 О 2 .
В місцях локалізації гваякол пероксидази на гелі спостерігали появу коричневих смуг на прозорому фоні, що пов'язано з утворенням тетрагваяколу під дією ферменту.
2.5 Техніка безпеки праці в лабораторії
Вимоги безпеки під час виконання роботи
Під час роботи у лабораторії слід дотримуватись таких правил:
1) необхідно використовувати захисний одяг (лабораторний бавовняний халат, при необхідності гумові рукавички та окуляри або захисну маску; при роботі з др
Вплив іонів міді, кадмію та заліза на активність та ізоферментний спектр гваякол пероксидази тютюну курсовая работа. Биология и естествознание.
Дипломная работа по теме Процессуальные аспекты организации судебного разбирательства по уголовным делам
Реферат: Исторические личности России (Петр 1, Меньшиков, Румянцев, Суворов, Ушаков, Кутузов, Нахимов, Скобелев, Брусилов)
Курсовая работа по теме Эпоха Возрождения в Италии на примере картины Камбьязо Луки "Золотой век"
Управление Государственной Собственностью Курсовая
Преодоление Эссе
Диспепсия новорожденных телят
Курсовая работа по теме Концепция 'осевого времени' К. Ясперса
Диссертация Бизнес Информатика
Реферат По Физкультуре Виды Спорта 4 Класс
Историческое Сочинение Про Ивана Грозного
Оценка Предприятия Курсовая Работа
Реферат по теме Товарная экспертиза золота
Кредитная политика коммерческого банка основы формирования
Дипломная работа по теме Исследование и пути совершенствования кадровой политики ООО 'Компания Телеком Премьер'
Василий Шуйский Сочинение Егэ
Рефераты: Кулинария
Реферат: Антибиотики
Курсовая работа по теме Статистическое исследование рынка труда
Пример Сочинения Про Лето
Контрольная работа по теме Полномочия федеральных органов государственной власти в области местного самоуправления
Розрахунок сил та засобів для ліквідації пожежі на об'єкті - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда дипломная работа
Поражения электрическим током или молнией - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда контрольная работа
Проблемы возникновения пожаров на территории Ханты-Мансийского автономного округа - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда презентация