Восстановительное метиламинирование

______________

✅ ️Наши контакты (Telegram):✅ ️

✅ ️ ▲ ✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ✅ ️

______________

Справочник химика 21

Восстановительное метиламинирование

N- метилированные аминокислоты встречаются в природе в различных биологических соединениях. Благодаря этим характеристикам N- метилированные аминокислоты вызывают все больший интерес со стороны фармацевтической промышленности. Синтез N- метилированных аминокислот химическим и биокаталитическим подходами известен, но часто демонстрирует неполную стереоселективность, низкий выход или дорогостоящую регенерацию кофактора. До сих пор одностадийный процесс ферментации от сахаров еще не был описан. Здесь была разработана одностадийная конверсия сахаров и метиламина в N- метилированную аминокислоту N- метилаланин. Цельный клеточный биокатализатор был получен из пирувата, чрезмерно продуцирующего штамм C. В качестве доказательства концепции титры N- метилаланина 31, 7 г л -1 с выходом 0, 71 г на г глюкозы были достигнуты при культивировании с подпиткой. Штамм C. N- алкилирование аминокислот происходит у бактерий и эукариот. В листьях зеленого чая было показано, что N 5 -этилированное производное L-глутамина теанин отвечает за их вкус умами 1, 2. N- метилированные аминокислоты также обнаружены в депсипептидах, которые используются в качестве лекарственных средств, например ванкомицин, актиномицин D и циклоспорин. Соответственно, замена саркозина остатком N- концевого глицина на аналог ангиотензина II усиливает активность in vivo как потенциальный результат более длительного периода полужизни против протеолитической деградации 6. Известно, что подобно -пролину, N- метилированные аминокислоты стабилизируют дискретные конформации пептидов, как показано для обмена l-пипеколовой кислоты на N- метилаланин в ингибиторе АТФазы эфрапептин С 7. У некоторых бактерий использование монометиламина ММА может привести к образованию N- метилированных аминокислот. Некоторые бактерии, которые могут расти с уменьшенными углеродными субстратами без углерод-углеродных связей, таких как метан или метанол, могут использовать ММА в качестве единственного источника углерода. N- метилированная аминокислота N- метилглутамат встречается в качестве промежуточного звена так называемого катаболического пути монометиламина у представителей этих метилотрофных бактерий, например, Methylocella silvestris, Methyloversatilis universalis или Methylobacterium extorquens 8, 9, 10, Был выделен фермент, который катализирует восстановительное метиламинирование пирувата до NMeAla в присутствии ММА и назван N- метилаланиндегидрогеназой рис. По своей нативной функции восстановления пиперидинкарбоксилата в дополнение к асимметричному синтезу хиральных аминов этот фермент относится к классу иминредуктаз IRED 14, Соответствующий ген dpkA из Pseudomonas putida ATCC был идентифицирован, и характеристика кодируемого фермента выявила несколько расслабленный субстратный спектр. Схематический обзор реакции, катализируемой DpkA A , и ее интеграции в центральный углеродный обмен в C. Делеции генов для улучшения продукции пирувата показаны черными стрелками с красными двойными полосами: делеция aceE кодирующая PDHE1p, субъединица E1p PDHC и pqo кодирующая пируват-хинон оксидоредуктаза, PQO и оба гена, кодирующие оба основных фермента для Подача 1-аланина пируват-аминотрансферазами alaT и avtA, кодирующими аланинаминотрансферазу AlaT и валин-пируват-аминотрансферазу AvtA, соответственно была удалена. Ферменты, выделенные красным фоном, указывают на отсутствующие или подавленные ферменты. Хотя образование N- алкилированных аминокислот, таких как NMeAla, было показано во время характеристики NMAADH 16 , 17 , 18 , эффективное производство с помощью биокатализа или ферментации еще не было описано. Биокаталитические подходы могут давать преимущества по сравнению с химическими методами, такими как N- алкилирование аминокислот или асимметричный синтез Штрекера, поскольку химические методы могут использовать опасные химические вещества, дают только неполную стереоселективность и низкие выходы, в то время как могут происходить побочные реакции, такие как диметилирование аминогруппы 20 ,. Ферментативная продукция аминокислот, главным образом l-глутамата и l-лизина, происходит в масштабе миллиона тонн В течение более пятидесяти лет C. Помимо усилителя аромата l-глутамата 24 и кормовой добавки l-лизина 25 , другие аминокислоты и родственные соединения могут быть эффективно получены путем ферментации на основе глюкозы и аммония с использованием рекомбинантных штаммов C. Метаболическая инженерия C. Здесь мы описываем одностадийное получение N- метилированной аминокислоты NMeAla из глюкозы и метиламина с помощью недавно сконструированного цельноклеточного биокатализатора C. Этот штамм, продуцирующий пируват, названный ELB-P, способен выделять до 17, 6 г L -1 пирувата с низким образованием побочных продуктов в встряхиваемых колбах Для достижения высоких титров пирувата геном этого штамма несет делеции генов, кодирующих пируватпревращающие ферменты. Начиная с гена пируватдегидрогеназы aceE, кодирующего субъединицу E1p штамма 32 , который накапливает высокие титры пирувата 33 , дополнительной делеции гена пируватхиноноксидоредуктазы pqo 34 и делеции С-концевого регуляторного домена ацетогидроксикислоты ген синтазы ilvN 35, 36 дополнительно увеличил доступность пирувата. Чтобы предотвратить восстановление пирувата до молочной кислоты, ldhA NAD-зависимая l-молочная кислота-дегидрогеназа 35 была удалена. Кроме того, образование побочного продукта 1-аланина было уменьшено путем делеции гена аланинаминотрансферазы alaT и гена валинпируватаминотрансферазы avtA 37 рис. Здесь было сконструировано производное C. Чтобы определить, является ли C. Чтобы проверить, способен ли C. Этот эксперимент по росту показал, что C. Возможные эффекты, связанные с токсичностью субстрата или продукта, были обнаружены в экспериментах по росту с C. Скорость роста уменьшалась при более высоких концентрациях примерно до половины максимальных скоростей при 1, 8 мММА и 0, 4 мкМ NMAAla соответственно рис. Чтобы определить, влияет ли ММА на глобальную экспрессию генов в C. Обнаружение того факта, что очень немногие гены изменяют экспрессию и ни один из них не обладает функцией метаболизма азота дополнительная таблица , указывает на то, что ММА не вызывает специфического ответа генной экспрессии. Скорости роста C. Половинные максимальные темпы роста были получены путем экстраполяции. Неочищенные экстракты клеток, несущих либо пустой вектор, либо вектор экспрессии dpkA, анализировали на предмет восстановительного N- метилирования пирувата. Как предполагалось, никакой активности не было обнаружено для C. Этот результат указывает на функциональную экспрессию dpkA из P. Чтобы протестировать штамм C. ВЭЖХ-анализ супернатантов после культивирования в течение 72 ч показал, что C. Культуральные супернатанты собирали после инкубации в течение 72 часов и анализировали с помощью ВЭЖХ. A Концентрации даны как средние значения со стандартным отклонением трех повторностей. B Для оценки судьбы углерода из глюкозы и ацетата в качестве субстрата нанесены их концентрации в граммах углерода на литр. График концентрации углерода на литр образованной биомассы зеленый и образующихся продуктов: l-аланин синий , l-валин черный , пируват серый и NMeAla красный. Содержание углерода в грамм на литр CO 2 и неизвестных побочных продуктов изображено в открытых колонках. Образование l-аланина в качестве побочного продукта может происходить из-за высоких концентраций сульфата аммония и мочевины, присутствующих в качестве источников азота в минимальной среде CGXII. В последнем случае образование побочного продукта 1-аланина было уменьшено, однако увеличение концентрации пирувата и снижение концентрации NMeAla в супернатантах указывало на неполное восстановительное N- метиламинирование пирувата до NMeAla рис. Впоследствии концентрация ММА была увеличена до 10, 9 г л -1, и, кроме того, концентрация глюкозы была снижена до 20 г л Чтобы получить представление о судьбе углерода из глюкозы и ацетата в качестве субстрата, были нанесены концентрации углерода, присутствующего в биомассе и образовавшихся продуктах рис. В то время как E. Таким образом, после уравновешивания концентраций источников азота и углерода для роста сульфата аммония, мочевины и ацетата с субстратами для производства глюкозой и ММА NMeAla получали путем ферментации с использованием штамма C. Для более высокой плотности клеток и более высоких производственных титров культивирование с подпиткой осуществляли с двумя независимыми фазами питания фиг. Первый питающий раствор содержал ацетат и был связан с сигналом относительного насыщения растворенным кислородом rDOS с целью увеличения концентрации биокатализатора и улучшения связанной с ростом продукции NMeAla. Вторая фаза кормления началась через 22 часа с начальной подачи мл, после чего последовала линейная подача 12, 3 мл ч -1 глюкозы и ММА соотношение 1: 3 для ускорения производства NMeAla, не связанного с ростом. Выход 0, 48 г NMeAla на г ацетата и глюкозы был достигнут. Принимая во внимание, что рост C. Побочный продукт 1-аланин и предшественник пируват накапливались только до низких концентраций 0, 5 г л -1 и 2, 1 г л -1 соответственно. Таким образом, ферментативное получение NMeAla в периодическом процессе с подпиткой привело к повышению конечного титра, объемной производительности и выхода по сравнению с экспериментами во встряхиваемой колбе. Периодическое культивирование с кормом C. Использовали ферментер с начальным объемом 4 л. Первая фаза подачи ацетат калия была связана со значением rDOS. Было показано формирование биомассы черные открытые квадраты , концентрации NMeAla красные круги , l-аланина синие квадраты , пирувата серые квадраты , ацетата зеленые треугольники с заливкой и глюкозы зеленые открытые треугольники. Объем обоих каналов показан черными линиями. Все указанные концентрации и образование биомассы были связаны с начальным объемом. Устойчивое производство из сахаров, которые конкурируют в использовании в питании человека и животных, должно сопровождаться производственными процессами на основе сырья второго поколения, такого как лигноцеллюлозные гидролизаты. Ферментативная продукция аминокислот обычно основана на глюкозе, присутствующей в патоке или полученной из крахмала гидролизом. Непосредственное использование крахмала, а также пентозных сахаров ксилозы и арабинозы, которые могут быть получены гидролизом лигноцеллюлозы, требует метаболической инженерии C. На основе этих стратегий были сконструированы и протестированы штаммы C. Гетерологичная экспрессия оперона утилизации арабинозы araBAD из E. Эффективное использование лигноцеллюлозной пентозы и сахарозной ксилозы было обеспечено благодаря экспрессии гена ксилозоизомеразы xylA из Xanthomonas campestris в сочетании со сверхэкспрессией гена эндогенной ксилулокиназы xylB В совокупности было показано эффективное производство NMeAla из трех альтернативных видов сырья. Производство NMeAla из альтернативных источников углерода. Концентрации были определены через 72 часа и приведены как средние значения со стандартными отклонениями трех повторностей. Титры N- метилаланина 31, 7 г л -1 с выходом 0, 71 г на г глюкозы были достигнуты при культивировании с подпиткой. Описанные штаммы C. Ди- N- метилаланин, частый побочный продукт химического метилирования l-аланина, не наблюдался. Тем не менее, пируват и L-аланин накапливались как второстепенные побочные продукты. Таким образом, в C. Отмена экспорта пирувата и 1-аланина была невозможна, поскольку системы экспорта не были определены. Как и в случае с l-аланином, система экспорта для NMeAla неизвестна. Учитывая их сходную структуру, возможно, что и 1-аланин, и NMeAla экспортируются одной и той же неизвестной экспортной системой. Альтернативно, NMeAla может быть субстратом экспортной системы C. Регулятор транскрипции Lrp активирует транскрипцию brnFE при повышенных внутриклеточных концентрациях аминокислот с разветвленной цепью и l-метионина Поскольку N- метилирование увеличивает липофильность 55, 56 , диффузия более липофильного NMeAla через цитоплазматическую мембрану C. Однако диффузия аминокислот через цитоплазматические мембраны бактерий не может объяснить транспортные процессы против градиентов концентрации, которые требуют активных транспортных систем. Это относится не только к заряженным аминокислотам, таким как l-лизин 57 , но также и к незаряженным аминокислотам, таким как l-изолейцин 51, Дальнейшая работа должна будет разгадать экспортные системы NMeAla, l-аланина и пирувата в C. Напротив, поглощение ММА в клетке C. Примечательно, что в качестве зонда для поглощения аммония для определения скоростей поглощения был использован меченный 14 C MMA. Поглощение аммония кишечными бактериями, такими как кишечная палочка, действует по сравнимому механизму, как показано для белка кишечной палочки AmtB Таким образом, как показано для экспрессии других генов в рекомбинантном C. Было показано, что NMAADH DpkA, используемый здесь для восстановительного N- метилирования пирувата, является частью пути деградации d-лизина в псевдомонадах, где он действует как иминредуктаза IRED , восстанавливая свой природный субстратный пиперидинкарбоксилат IRED, которые катализируют асимметричное восстановление прохиральных иминов до хиральных аминов с использованием NAD P H в качестве источника гидрида, приобретают все больший интерес к биоорганической химии 65, 66, 67, GF 69 и R -селективный IRED из Streptosporangium roseum 70 также катализируют асимметричное восстановительное аминирование из подходящих предшественников кетона и амина. Ожидается, что последняя реакция будет проходить через имин либо в растворе, либо в активном центре фермента. Структурно-функциональный анализ DkpA и других IRED для улучшения асимметричного восстановительного аминирования из подходящих предшественников кетона и амина еще не был описан, но он был бы полезен для увеличения восстановительного N- метиламинирования пирувата до NMeAla с помощью DkpA или производных вариантов. Этот подход был успешно применен к P оксидоредуктазе BM3 из B. Здесь мы разработали ферментативный путь к N- метилированной аминокислоте NMeAla. Биокаталитический путь основан на дегидрогеназе N- метиламинокислоты NMAADH , которая интегрируется в центральный метаболизм пирувата, сверхпродуцирующего штамм C. Конечный титр NMeAla 31, 7 г л -1 был достигнут при периодической ферментации с подпиткой после уравновешивания соотношения основных субстратов глюкозы и ММА. Кроме того, было обеспечено производство NMeAla из альтернативных источников углерода, ксилозы, арабинозы и крахмала, что обеспечило основу для устойчивого производства NMeAla из сырья второго поколения. Штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 1. Предварительные культуры C. Для экспериментов по росту или ферментативному продуцированию клетки C. Система микроферментации Biolector m2p-labs, Аахен, Германия использовалась для определения поведения роста в присутствии ММА или NMeAla и тестов роста источника углерода и азота. Ферментацию C. РН поддерживался на уровне 7, 0. Вторая фаза кормления г л -1 глюкозы и 84 г л -1 ММА общий объем: мл начиналась вручную через 22 часа. Ферментер инокулировали добавлением мл культуры во встряхиваемой колбе, выращенной в описанной среде, с дополнительным 42 г L- 1 буфера MOPS. Стандартные молекулярно-генетические методы выполняли, как описано в Grenn and Sambrook, Трансформацию E. Ген dpkA амплифицировали из P. Для построения плазмиды экспрессии, несущей гены деградации арабинозы araBAD из E. Сконструированную плазмиду использовали для трансформации штаммов C. Клетки от до мг ресуспендировали в 1 мл мМ глицинового буфера рН 10 и обрабатывали ультразвуком UP S, Dr. Для определения активности восстановительного N- метиламинирования анализ проводили, как описано Анализ был выполнен по меньшей мере в трех экземплярах. Для обнаружения NMeAla и l-аланина образцы дериватизировали с помощью 9-флуоренилметилхлоркарбоната Fmoc-Cl в соответствии с опубликованными методами 82 с модификациями Детектирование проводили с помощью флуоресцентного детектора FLD GA, серия , Agilent Technologies с длиной волны возбуждения и эмиссии нм и нм соответственно. Детекцию флуоресцентных производных осуществляли с помощью флуоресцентного детектора с длиной волны возбуждения нм и длиной волны излучения нм. Концентрации, превышающие 0, 1 г л -1, были рассмотрены далее. Детектирование проводили с помощью детектора с диодной матрицей DAD, серия , Agilent Technologies при нм. Концентрации, превышающие 0, 5 г л -1, были рассмотрены далее. Для анализа транскриптома в присутствии ММА клетки C. РНК выделяли и транскриптомом Анализ с использованием микрочипов всего генома проводили, как описано ранее Все данные, сгенерированные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью и ее файлы дополнительной информации. Мы признаем поддержку сбора за обработку статей со стороны Deutsche Forschungsgemeinschaft и Фонда публикации открытого доступа Университета Билефельда. Отправляя комментарий, вы соглашаетесь соблюдать наши Условия и Принципы сообщества. Если вы обнаружили что-то оскорбительное или не соответствующее нашим условиям или правилам, отметьте это как неуместное. Главная Карьера и набор Британский журнал рака Биопленки и микробиомы Обзоры иммунологии Фальшивые сообщения Точка давления. Контрастные модели изменения признаков листьев среди и внутри видов во время смены тропических сухих лесов в Коста-Рике Новый вид 2D топологических изоляторов BiCN с гигантским зазором и его субстратными эффектами Научные доклады Одностадийный процесс получения N-метилированных аминокислот из сахаров и метиламина с использованием рекомбинантного Corynebacterium glutamicum в качестве биокатализатора Предметы Промышленная микробиология Метаболическая инженерия Аннотация N- метилированные аминокислоты встречаются в природе в различных биологических соединениях. Научные доклады Квантовая корреляция системы кубит-резервуар в диссипативных средах Международный журнал ожирения Качество жизни, связанное со здоровьем, у детей и подростков, страдающих ожирением Семейство р53 и запрограммированная гибель клеток Доказательства использования фосфоната в коралловых голобионтах Показатели митотической фигуры значительно завышены в образцах резекции инвазивных карцином молочной железы Нарушение образования нейтрализующих антител и высокая эффективность трансдукции после изолированной перфузии печени аденовирусными векторами MiRp, новая механо-чувствительная микроРНК, способствует дифференцировке остеобластов путем нацеливания на Hmga2 Антропология: Ледяной человек разморожен Модифицированные TiO2 FeS-наноструктуры с улучшенными электрохимическими характеристиками для литий-ионных аккумуляторов Опылители насекомых видят свет Copyright

Героин в Кирове

Гидра купить Скорость (Ск Альфа-ПВП) Карши

Восстановительное метиламинирование

Шиханы купить Триптамины

Купить онлайн закладку в Улан-Удэ

Купить Соль, кристаллы на Hydra Кызылорда