Виго бесплатные пробы Амфетамин, амф
Виго бесплатные пробы Амфетамин, амфВиго бесплатные пробы Амфетамин, амф
__________________________________
Гарантии! Качество! Отзывы!
__________________________________
✅ ️Наши контакты (Telegram):✅ ️
✅ ️ ▲ ✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ✅ ️
__________________________________
⛔ ВНИМАНИЕ!
📍 ✅ Используйте ВПН (VPN), если ссылка не открваеться!
Виго бесплатные пробы Амфетамин, амф
📍 В Телеграм переходить только по ссылке что выше! В поиске тг фейки!
__________________________________
Виго бесплатные пробы Амфетамин, амф
Вы точно человек? Пользовательское соглашение Политика конфиденциальности.
Виго бесплатные пробы Амфетамин, амф
Пластинчатый анализ для измерения эндогенного высвобождения моноаминов в острых срезах мозга
Виго бесплатные пробы Амфетамин, амф
Вы точно человек?
Мефедрон, меф Сумбаванга купить
Виго бесплатные пробы Амфетамин, амф
Купить Героин, Метадон Бристоль телеграм бот
Пластинчатый анализ для измерения эндогенного высвобождения моноаминов в острых срезах мозга
Этот метод вводит простую технику обнаружения эндогенного высвобождения моноаминов с использованием острых срезов мозга. Установка использует луночную пластину, содержащую держатель ткани для высвобождения моноамина. Высвобождаемый моноамин анализируется методом ВЭЖХ в сочетании с электрохимическим обнаружением. Кроме того, этот метод обеспечивает метод скрининга для обнаружения лекарств. Моноаминовые нейротрансмиттеры связаны с многочисленными неврологическими и психическими заболеваниями. Животные модели таких состояний показали изменения в динамике высвобождения и поглощения моноаминных нейротрансмиттеров. Технически сложные методы, такие как электрофизиология, циклическая вольтаметрия быстрого сканирования FSCV , визуализация, микродиализ in vivo, оптогенетика или использование радиоактивности, необходимы для изучения функции моноаминов. Метод, представленный здесь, представляет собой оптимизированный двухэтапный подход к обнаружению высвобождения моноаминов в острых срезах мозга с использованием луночной пластины, содержащей тканевые держатели для изучения высвобождения моноаминов, и высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с электрохимическим обнаружением ВЭЖХ-ECD для измерения высвобождения моноамина. Вкратце, участки мозга крыс, содержащие области, представляющие интерес, включая префронтальную кору, гиппокамп и дорсальный стриатум, были получены с использованием тканевого слайсера или вибратома. Эти области, представляющие интерес, были рассечены из всего мозга и инкубированы в насыщенном кислородом физиологическом буфере. Жизнеспособность исследовали на протяжении всего экспериментального временного хода с помощью анализа 3- 4,5-диметилтиазолил -2,5-дифенилтетразолия бромида МТТ. Остро рассеченные области мозга инкубировали в различных условиях наркотиков, которые, как известно, индуцируют высвобождение моноамина через транспортер амфетамин или через активацию экзоцитотического везикулярного высвобождения KCl. Здесь базальное высвобождение моноамина обнаруживается методом ВЭЖХ из острых срезов мозга. Эти данные подтверждают предыдущие результаты in vivo и in vitro, показывающие, что AMPH и KCl индуцируют высвобождение моноаминов. Этот метод особенно полезен для изучения механизмов, связанных с моноаминным транспортер-зависимым высвобождением, и дает возможность быстро и недорого экранировать соединения, влияющие на высвобождение моноаминов. Множество неврологических и психиатрических заболеваний связано с дисрегуляцией или недостаточным поддержанием моноаминового нейромедиатора дофамин \\\\\[DA\\\\\], серотонин \\\\\[5-HT\\\\\], норадреналин \\\\\[NE\\\\\] гомеостаза1,2,3. Эти состояния включают, но не ограничиваются ими, депрессию1,2 , шизофрению2 , беспокойство2 , зависимость4 , менопаузу5,6,7, боль8 и болезнь Паркинсона3. Например, несколько крысиных моделей менопаузы показали, что дисрегуляция или уменьшение моноаминов в гиппокампе, префронтальной коре и полосатом теле может быть связана как с депрессией, так и с когнитивным снижением, что наблюдается у женщин, испытывающих менопаузу. Дисрегуляция моноаминов в этих моделях была широко изучена с использованием ВЭЖХ-ECD, хотя в исследованиях не проводилось различия между измеренным содержанием нейротрансмиттеров и высвобождением нейротрансмиттеров5,6,7. И наоборот, данные свидетельствуют о том, что эти транспортеры способны высвобождать или выбрасывать моноамины, поскольку наркотики злоупотребления, такие как амфетамин AMPH и 3,4-метилендиоксиметамфетамин MDMA , как известно, высвобождают DA и 5-HT, соответственно, через их транспортные системы12,13,14,15,16, Таким образом, правильное механистическое понимание динамики высвобождения моноаминов имеет решающее значение для разработки конкретных и целевых фармакотерапий. Для изучения высвобождения моноаминов был использован широкий спектр методов, таких как циклическая вольтамперметрия с быстрым сканированием FSCV 18 , микродиализ in vivo13 , визуализация19 , преинкубация с радиомаркированными моноаминами20, оптогенетика и, в последнее время, генетически закодированные флуоресцентные датчики и фотометрия21, FSCV и микродиализ in vivo являются основными методами, используемыми для изучения высвобождения моноаминов. FSCV используется для изучения стимулированного экзоцитотического высвобождения, в первую очередь, DA в острых срезах мозга и in vivo Микродиализ in vivo в сочетании с ВЭЖХ измеряет изменения уровней внеклеточных нейротрансмиттеров с помощью зонда, помещенного в интересующую область мозга13, Примечательно, что оба метода позволяют проводить прямое измерение высвобождения моноаминов. Благодаря недавнему прогрессу оптогенетики исследования демонстрируют обнаружение высвобождения 5-HT и DA за короткий промежуток времени с изысканной специфичностью клеточного типа21, Однако эти стратегии требуют сложных и дорогостоящих методов и оборудования и косвенно измеряют высвобождение моноаминов, в частности, через связывание моноаминов с рецепторами. Кроме того, радиомаркированные моноамины также используются для изучения динамики моноаминов. Радиомаркированные моноамины могут быть предварительно загружены в различные модельные системы, такие как гетерологичные клетки, сверхэкспрессирующие каждый транспортер моноаминов20,33,34,35,36,37,38,39,40 , первичные нейроны20 , синаптосомы33,39,41 , 42 , и острые мозговые срезы43, Однако радиоактивность представляет потенциальный вред для экспериментатора, и меченые тритием аналиты могут не точно повторять эндогенную динамику моноаминов45, Суперфузионные системы в сочетании с автономными методами обнаружения, такими как ВЭЖХ-ECD, позволили обнаруживать моноамины из нескольких тканевых источников. Здесь этот протокол обеспечивает как оптимизированный и недорогой, простой и точный метод с использованием острых срезов мозга для непосредственного измерения эндогенного базального и стимулированного высвобождения моноаминов. Острые срезы мозга позволяют проверять механистические гипотезы, прежде всего потому, что они сохраняют in vivo анатомическую микросреду и поддерживают неповрежденные синапсы47,48,49,50,51, Суперфузионные системы имеют решающее значение для продвижения понимания в этой области механизмов высвобождения нейротрансмиттеров, включая моноамины. Однако эти системы относительно дороги, а количество камер, доступных для анализа тканей, колеблется в пределах Для сравнения, метод, представленный здесь, является недорогим, позволяет измерять 48 образцов тканей и может быть усовершенствован для использования до 96 образцов тканей. Каждая скважина в луночной пластине содержит тканевые держатели, которые используют фильтры для отделения высвобождаемого продукта от ткани, а высвобождаемые моноамины затем собираются и анализируются с помощью ВЭЖХ-ECD. Важно отметить, что этот метод позволяет одновременно измерять высвобождение 5-HT, DA и NE из различных областей мозга, таких как префронтальная кора, гиппокамп и дорсальное полосатое тело после лечения фармакологическими агентами, которые модулируют высвобождение моноаминов. Таким образом, экспериментатор может ответить на несколько вопросов, используя недорогую многолуночную систему, которая увеличивает количество тестируемых образцов и тем самым уменьшает количество используемых животных. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Для реагентов и буфера, пожалуйста, обратитесь к Дополнительному файлу. Тем не менее, эта установка функциональна для различных точек развития, самок крыс и других видов. При использовании более мелкого животного, такого как мыши, экспериментатор может настроиться на оптимизацию протокола, используя различное количество срезов мозга или ударов по каждому условию. Буфер рассечения будет называться Буфером 1; буфер efflux будет называться буфером 2. Чтобы изготовить держатель, используйте прочный пластиковый стержень например, из скребка ячеек и супер приклейте к нему фильтрующие блоки микроцентрифуги без вставок-фильтров. Дайте высохнуть в течение дней. Время, необходимое для эксперимента по эндогенному высвобождению моноаминов, и концентрации амфетамина, флуоксетина и кокаина основаны на текущей литературе и предыдущих протоколах13,20, Этот метод описывает использование срезов мозга для измерения высвобождения эндогенных моноаминов с использованием ВЭЖХ с электрохимическим обнаружением на основе луночной пластины с внутренним тканевым держателем. Экспериментальная установка показана на рисунках 1 и 2. Первоначально для обеспечения жизнеспособности тканей к концу эксперимента проводили анализ МТТ 3- 4,5-диметилтиазолил -2,5-дифенилтетразолия бромид, тетразол. Острое, 20 мин, лечение отделов гиппокампа и префронтальной коры головного мозга АМФ вызывает значительное повышение внеклеточных уровней каждого моноамина рисунок 4A,B. AMPH 30 мкМ увеличивал уровень внеклеточного 5-HT из срезов гиппокампа и префронтальных срезов коры в и 64 раза, внеклеточных NE в 19 и 8 раз, а внеклеточных DA в 8 и 7 раз соответственно. Аналогичные эксперименты проводились в присутствии флуоксетина 10 мкМ , селективного ингибитора обратного захвата серотонина. Все экспериментальные условия выполнялись в трех экземплярах. Далее измеряли высвобождение моноаминов из 2 мм дорсальных полосатых пуншей. Острое, 20 мин, лечение дорсальных стриатальных пуншей АМФ 10 мкМ вызывает кратное повышение внеклеточных уровней DA рисунок 4C по сравнению с базальными уровнями. Обнаружение DA было сосредоточено в дорсальном полосатом теле из-за более низких базальных уровней 5-HT и NE, о которых ранее сообщалось в этом регионе62, Инкубация дорсальных стриатальных пуншей с кокаином 40 мкМ , блокатором моноаминового транспортера, привела к значительному ингибированию AMPH-индуцированного внеклеточного DA по сравнению с ударами, инкубированными исключительно с AMPH рисунок 4C. Наконец, чтобы продемонстрировать экзоцитотическое высвобождение моноаминов, участки мозга инкубировали с KCl 40 мМ. Увеличение концентрации внеклеточного KCl для вызвать деполяризацию мембраны путем инкубации с 40 мМ KCl достаточно, чтобы индуцировать экзоцитотическое высвобождение моноаминов по сравнению с контрольными условиями рисунок 5. Ни флуоксетин, ни кокаин не блокируют повышение внеклеточных уровней моноаминов, вызванное деполяризацией мембраны KCl. Рисунок 1 : Острый срез мозга крысы и подготовка к разделению. А Мозг крысы помещается в мозговую матрицу. Превосходный разрез обозначает верхнюю часть оптической хиазма; нижний разрез составляет 3 мм сзади основания гипоталамуса. Разрезы были сделаны для удаления гиппокампа и полосатого тела, а также для обеспечения горизонтального основания для надежного приклеивания образца к компрессому или вибратому перед нарезкой. Б-Д Суперклей распределяли по основанию сцены, наклеивали мозги, сразу же покрывали агарозой, а агарозу затвердевали с помощью замороженного зажима в D. Е-Ф Компрессом использовали для изготовления мкм срезов для мозга крысы, а срезы помещали в кислородный буфер до использования. G Секции были размещены на слайде и сделаны 2-миллиметровые удары спинного полосатого тела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2 : Экспериментальная установка для эксперимента с эффлюксом. A Камера эффлюкса состоит из луночной пластины для культивирования тканей и лотка для держателя ткани, соединенного с карбогенной линией. B Диаграмма, показывающая экспериментальный дизайн эндогенного эксперимента по оттоку моноаминов, в котором представлены активация ткани B1 , предварительная инкубация с ингибиторами моноаминового транспортера B2 , эксперимент с выбросом B3 и окончательная обработка образца B4-B5. C На левой панели изображен экспериментатор, загружающий перфусат в ВЭЖХ в рамках подготовки к автоматическому впрыску. На правой панели показана репрезентативная хроматограмма, обозначающая моноаминные стандартные пики. Площадь под кривой AUC измеряется для каждого моноаминового стандарта и образцов мозга. После калибровки AUC, измеренная для каждого образца мозга, преобразуется в концентрацию nM. Рисунок 3 : Острые срезы мозга были жизнеспособны к концу эксперимента. Результат анализа MTT показал, что к концу 6 ч образцы тканей все еще были жизнеспособными. P t-тест. Рисунок 4 : Амфетамин индуцирует высвобождение моноамина в острых срезах мозга из гиппокампа, префронтальной коры и ударов дорсального полосатого тела. Флуоксетин значительно ингибирует высвобождение 5-НТ, но не оказывает влияния на высвобождение DA или NE в этих регионах. В обеих областях мозга предварительная обработка флуоксетином 10 мкМ не влияет на влияние KCl на высвобождение внеклеточного моноамина. Дополнительный файл: Рецепты буферов и растворов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Измерения высвобождения моноаминов проводились в течение многих лет в ряде систем, таких как гетерологичные клетки, нейронные культуры, синаптосомы мозга, острые срезы мозга ex vivo и целые животные13,20,41,42,58,64,65,66,67, Такие препараты позволили области неврологии исследовать основные механизмы высвобождения нейротрансмиттеров, которые могут привести к открытию новых фармакологических агентов для неврологических и психических расстройств, где моноамины играют определенную роль. Кроме того, препараты ex vivo для острых срезов головного мозга широко используются в сочетании с электрофизиологическими, фармакологическими, генетическими, молекулярными, иммуноцитохимическими и другими подходами18,24,25,47,50,51,59,69,70 , так как они сохраняют тканевую архитектуру, а также сохраняют как нейронную активность, так и синаптические связи. Таким образом, срезы мозга предлагают исключительные преимущества по сравнению с другими моделями in vitro, такими как гетерологичные системы, первичные культивируемые нейроны и синаптосомы. В значительной степени их преимущество заключается в том, что эти системы могут воспроизводить многие аспекты среды in vivo. Электрофизиологические, оптогенетические, флуоресцентные датчики и вольтаметрические подходы предлагают изысканное временное и пространственное разрешение для изучения механизмов, связанных с высвобождением моноаминов, в частности DA. Однако основная предпосылка для использования этих подходов заключается в том, что электрическая или светоиндуцированная стимуляция нейронов индуцирует классическое и хорошо документированное кальций-зависимое экзоцитотическое везикулярное высвобождение нейротрансмиттеров18,21,22,24,27, Одним из наиболее заметных ограничений этих подходов является то, что моноамины, высвобождаемые через альтернативные механизмы то есть невезикулярное высвобождение , не обнаруживаются этими методами. Радиомаркированные молекулы нейротрансмиттеров также использовались для изучения высвобождения моноаминов, но этот подход имеет значительные ограничения. Клетки или образцы тканей загружены нефизиологическими концентрациями меченых нейротрансмиттеров, которые не точно повторяют нативную среду20,42, Интересно, что несколько исследований документируют использование срезов мозга в суперфузионных системах для изучения эндогенного высвобождения моноаминов53,54, Представленный в настоящее время способ может быть использован для изучения опосредованного транспортером высвобождения моноаминов из нативной ткани. Это позволяет экспериментатору преодолеть ограничения тритиированных нейротрансмиттеров. Кроме того, этот подход обеспечивает простую настройку для более точного измерения эндогенного высвобождения моноаминов путем прямого обнаружения моноаминов, а не косвенного измерения при использовании флуоресцентных датчиков или радиомаркированного моноамина. Хорошо известно, что амфетамин действует как агент высвобождения моноаминового транспортера в префронтальной коре71 , дорсальном стриатуме56,72 и гиппокампе39 в областях мозга. Эти результаты были подтверждены с использованием этой луночной пластинчатой системы. Кроме того, этот метод может оказаться дополнением к используемым в настоящее время методам, которые измеряют общее содержание моноаминов с использованием ВЭЖХ-ECD, но не исследуют высвобождение моноаминов5,6,7. Этот метод обеспечивает новый аэратор, предназначенный для измерения эндогенного высвобождения моноаминов из острых срезов мозга с использованием ВЭЖХ в сочетании с электрохимическим обнаружением. При использовании этого метода крайне важно, чтобы ткани мозга оставались холодными в насыщенном кислородом буфере во время эксперимента, чтобы предотвратить ухудшение. Кроме того, крайне важно, чтобы используемые ткани активировались в буфере, содержащем паргилин, для предотвращения деградации моноамина. Кроме того, экспериментатору, возможно, придется устранить несколько аспектов этого метода. Во-первых, в зависимости от точки развития или вида животного, может потребоваться создать меньшие или большие секции или использовать больше или меньше секций, срезов или ударов для каждого условия. Во-вторых, в зависимости от интересующей области мозга, будет различное количество каждого нейротрансмиттера. В-третьих, хотя крайне важно обеспечить постоянное пузырьки кислорода, когда это отмечено, экспериментатор должен быть осторожен, чтобы не обеспечить избыточную оксигенацию, поскольку это может привести к случайному удалению ткани из скважины. Наконец, поскольку существуют различные типы устройств ВЭЖХ и различные разделительные колонны, экспериментатор должен будет определить, основываясь на литературе, какое устройство или колонка будут работать лучше всего для их эксперимента. Хотя этот метод предоставляет экспериментатору возможность быстро и точно получать ex-vivo данные о высвобождении эндогенных моноаминов, существуют ограничения, которые необходимо иметь в виду. Поскольку это подход ex vivo, сети и соединения разрываются, поэтому срезы или удары не являются репрезентативными для неповрежденной системы. Другим важным ограничением этого подхода является отсутствие временного и пространственного разрешения, поскольку высвобождение моноаминов измеряется во временной шкале минут и из совокупности мест высвобождения. Будущая доработка подхода может позволить оптимизировать разрешение времени и пространства. В дополнительных экспериментах также будут изучены механизмы, связанные с событиями высвобождения. Продемонстрировав обоснованность нынешнего метода, будущие эксперименты потребуют вскрытия молекулярных событий, приводящих к высвобождению моноаминов. Поскольку региональное распределение моноаминов и их транспортеров является тремя независимыми событиями, будущие эксперименты должны включать более обширную фармакологию и исследование с течением времени, поскольку различные условия лечения могут потребовать более короткого или более длительного времени инкубации. Например, основываясь на региональном распределении или типе используемой ткани, дальнейшие эксперименты могут использовать более специфические фармакологические блокаторы для NET, SERT или DAT, такие как дезипрамин, флуоксетин и GBR, соответственно. Кроме того, хотя ткань оставалась жизнеспособной на протяжении всего эксперимента, экспериментатор не может исключить возможность того, что функция переносчика моноаминов могла быть затронута в течение всего процесса. Несмотря на такие ограничения, текущий метод обеспечивает фундаментальную процедуру, которой можно в дальнейшем манипулировать для исследования высвобождения моноаминов. В целом, этот метод обеспечивает простую, высокую пропускную и недорогую двухэтапную процедуру для оценки одновременного высвобождения моноаминов из нейронов взрослых грызунов с использованием острых срезов мозга ex vivo из разных областей мозга. В идеале этот метод может быть объединен с протоколами in vivo, и он предоставляет предварительные данные, что позволяет экспериментатору уменьшить количество животных, необходимых в моделях in vivo, как рекомендовано в «трех R» Замена, Сокращение и Уточнение благополучия животных. Таким образом, возможно реализовать эту платформу ex vivo для скрининга потенциально терапевтических молекул с целью открытия новых фармакологических агентов для лечения состояний, связанных с дерегуляцией в моноаминовом гомеостазе. Pino, J. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Neuroscience. Подготовьте буфер 1, как указано в дополнительном файле. Удалите 50 мл Buffer 1 и охладите на льду в небольшом стакане или чашке Петри. Этот буфер используется для удержания остро собранного всего мозга. Немедленно поместите мозг в ледяной насыщенный кислородом буфер 1 в контейнере с шага 1. Открытый изофлуран под дымовым капотом. Используя вибратом или компресстом, вырежьте мкм корональные участки мозга из каждой интересующей области рисунок 1. Пузырьковый буфер 1 должен присутствовать во время создания секций. Используя шпатель из нержавеющей стали, аккуратно и немедленно переложите срезы мозга в новую чашку Петри, наполненную ледяным кислородом буфером 1 рисунок 2. Далее рассекайте срезы мозга например, удары, вырезание , осторожно перемещая срезы на стеклянные слайды рисунок 1G с использованием атласа мозга крысы Например, определите дорсальный стриатум на основе его темной, полосатой структуры и идентифицируйте гиппокамп на основе его близости к коре и уникальной спиральной структуры. Правое и левое полушария могут быть разделены для использования в качестве контрольных и экспериментальных срезов рис. Здесь дорсальный стриатум был дополнительно рассечен на 2 мм перфораторы рисунок 1G. Используя пластиковую передаточную пипетку с отрезанным наконечником, переложите срезы или мозговые пунши в небольшие контейнеры, погруженные в насыщенный кислородом ледяной буфер 1 с пузырьками кислорода. Эти контейнеры могут представлять собой сетку из нержавеющей стали или небольшие чашки Петри, заполненные буфером рисунок 1H. Активация тканей Перенесите ткань мозга со стадии 1. Во время этой инкубации разбавьте препараты до нужной для эксперимента концентрации. Все препараты должны быть растворены в буфере 2, а концентрации основаны на текущей литературе. Убедитесь, что буфер перевозится минимально или вообще отсутствует, постукивая держателем по краю скважины до тех пор, пока в держателе не окажется лишний буфер. В экспериментах с фармакологическими агентами, такими как ингибиторы переносчика моноаминов, инкубировали образцы тканей с препаратами, разбавленными в оксигенированном буфере 2 например, 10 мкМ флуоксетина, 40 мкМ кокаина; см. Конечный объем в каждой скважине составит мкл. Вторая инкубация Переместите держатель с тканью в новый набор лунок, содержащих мкл общего буфера 2 с желаемой концентрацией каждого лекарственного средства или без нее. Убедитесь, что не осталось лишних остатков буфера. Каждое экспериментальное условие выполняется в трех экземплярах. Каждый препарат растворяют в насыщенном кислородом буфере 2. Растворить каждый препарат в насыщенном кислородом буфере 2 мкл. Во время этой второй инкубации в течение 20 мин собирают раствор из скважин из первой инкубации на стадии 2. Конечный объем образца составит мкл. Поддерживайте микроцентрифужные трубки на льду и маркируйте трубки No1. После второй инкубации через 20 мин переместите держатель ткани с участками мозга или ударами в пустой колодец и выдержите пластину на льду. Перенесите супернатант в микроцентрифужные трубки, содержащие 50 мкл 1 Н хлорной кислоты или фосфорной кислоты. Поддерживайте микроцентрифужные трубки на льду и маркируйте трубки No2. Добавьте 1 мл ледяного буфера 1 к каждой лунке, содержащей ткань. Соберите всю ткань с помощью небольшого пинцета и переложите в чистые микроцентрифужные трубки. Отбросьте 1 мл буфера 1 рисунок 2B4. Фильтрующие растворы получают из каждой инкубации с использованием микроцентрифужных фильтрующих трубок 0,22 мкм при 2 х г в течение 2 мин. Используют фильтрат для определения содержания моноаминов с помощью ВЭЖХ с электрохимическим детектированием рисунок 2В5. Анализ MTT60,61 используется для определения жизнеспособности тканей к концу эксперимента. Данный анализ основан на превращении желтой тетразолиевой соли МТТ 3- 4,5-диметилтиазолил -2,5-дифенилтетразолия бромид в фиолетовые кристаллы формазана жизнеспособными клетками с адекватным метаболизмом. После эксперимента поддерживают отдельную группу образцов тканей и разделяют их на две группы. Лечение Triton X приводит к гибели клеток. Поддерживают вторую группу в буфере 2 и не инкубируют в Тритоне Х контроль жизнеспособности тканей. Инкубировать образцы в течение 24 ч. Центрифугируйте трубки при 10 х г в течение 10 мин и измеряйте поглощение супернатанта мкл при нм и нм с помощью считывателя микропластин. ВЭЖХ-анализ моноаминов Количественная оценка высвобождения моноаминов из каждого экспериментального состояния с использованием ВЭЖХ-ECD в соответствии с предыдущими протоколами13,44 , используя столбец обратной фазы. Подготовьте мобильную фазу, необходимую для обнаружения. Состав подвижной фазы зависит от типа ВЭЖХ и используемой колонны. Загрузите 5 мкл каждого образца, включая стандарты нейротрансмиттеров, в ВЭЖХ для автоинъекции и обнаружения. Количество каждого добавленного образца зависит от типа используемой ВЭЖХ. Анализ содержания моноаминов с использованием стандартной кривой, состоящей из каждого моноамина дофамин: DA, норадреналин: NE и серотонин: 5-HT; Рисунок 2С. Используйте полученные хроматограммы для получения площади под кривой AUC на основе рекомендаций производителя. Микроцентрифужные трубки должны поддерживаться на льду во время гомогенизации для предотвращения деградации белка. Определить концентрацию белка в супернатантах, с бычьим сывороточным альбумином BSA в качестве стандарта. Нормализуйте содержание моноаминов в каждом образце мозга до общего содержания белка мкг , измеренного в мкл лизированной ткани мозга. Play Video. Cite this Article Pino, J. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close.
Вы точно человек?
Виго бесплатные пробы Амфетамин, амф
Закладки Мефедрон, меф купить Змеиногорск
Пластинчатый анализ для измерения эндогенного высвобождения моноаминов в острых срезах мозга
Мефедрон, меф Москва Алексеевский купить
Виго бесплатные пробы Амфетамин, амф
Закладки Лирика, амфетамин купить Саяногорск
Пластинчатый анализ для измерения эндогенного высвобождения моноаминов в острых срезах мозга
Виго бесплатные пробы Амфетамин, амф