Трансформация бактерий как основа генной инженерии и молекулярного клонирования - Биология и естествознание реферат

Главная

Биология и естествознание
Трансформация бактерий как основа генной инженерии и молекулярного клонирования

Понятие и задачи генной инженерии и молекулярного клонирования. Характеристика векторов на основе плазмид, бактериофагов и космид. Биотехнологические манипуляции с кишечной палочкой, этапы ее трансформации. Применение трансформированных микроорганизмов.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Министерство образования и науки РФ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования
ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Трансформация бактерий как основа генной инженерии и молекулярного клонирования
1. Генная инженерия. Молекулярное клонирование
3. Escherichia coli (E. coli) - основная модель биотехнологических манипуляций
4. Основные этапы трансформации E. Coli
5. Практическое применение трансформированных микроорганизмов
Основой микробиологической, биосинтетической промышленности является бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых - способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение - аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту. Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно, смертельных для других видов микроорганизмов.
Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку - от обработки сильнодействующими ядами, до радиоактивного облучения. Цель этих приёмов одна - добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат - получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии и широко применяется в современной биотехнологии.
Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использованного наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля.
Для осуществления модификаций в геноме микроорганизма недостаточно одних только ферментов рестрикции. Во-первых , водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, недостаточно прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Необходим какой-то инструмент для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы. Таким инструментом является ДНК-лигаза бактериофага Т4. Этот фермент катализирует образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые уже удерживаются вместе благодаря спариванию липких концов. Кроме того, ДНК-лигаза Т4 «сшивает» тупые концы, которые сближаются друг с другом после того, как объединяемые фрагменты связываются с ферментом. Во-вторы х , объединение разных молекул ДНК само по себе бесполезно, если вновь образованные комбинации (рекомбинантные ДНК) не будут реплицироваться в клетке-хозяине. Таким образом, если одна масть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, то другая должна содержать информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. Чтобы решить эту проблему, используют клонирующие векторы. В-третьих , при рестрикции ДНК образуется смесь разнообразных фрагментов, и после их легирования с векторной ДНК образуется множество различных комбинаций. Необходимо уметь распознавать тереципиентные клетки, которые содержат ДНК с нужной нуклеотидной последовательностью.
Структура знаменитой плазмиды PBR322. В свое время это была, пожалуй, самая популярная плазмида во всём научном мире, а потом она стала основой для множества плазмид нового поколения.
В этой плазмиде есть участок начала репликации ( ori ), благодаря которому она может размножаться в клетках бактерии E. Coli ; гены устойчивости к двум антибиотикам - ампициллину ( amp ) и тетрациклину ( tet ); а также множество сайтов рестрикции (на самом деле их больше сорока, но здесь представлены только четыре - Eco RI, Sal I, Pst I, Bam HI . Некоторые сайты рестрикции находятся в генах устойчивости к ампициллину или тетрациклину, в результате чего и тот и другой сайт можно использовать в качестве второго селективного маркера.
С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т. п. н. Однако при создании геномных библиотек часто приходится работать с более крупными фрагментами. Для этого были разработаны векторы на основе бактериофага л Е. со li .
После проникновения в клетку события могут развиваться по двум сценариям. Если реализуется литический цикл, то фаг начинает интенсивно размножаться и примерно через 20 мин клетка разрушается (лизирует) с высвобождением до 100 новых фаговых частиц. При альтернативном варианте развития событий фаговая ДНК включается в хромосому Е. coli как профаг и реплицируется в клетке вместе с нормальными бактериальными генами (состояние лизогении).
Однако при недостатке питательных веществ или иных неблагоприятных обстоятельствах интегрированная фаговая ДНК высвобождается, и запускается литический цикл развития. Размер ДНК фага л составляет примерно 50т. п. н., причем значительная ее часть (около 20 т. и. н.) несущественна для размножения фага и отвечает за его встраивание в хозяйскую ДНК. В связи с этим возникла идея, что ее можно заменить фрагментом другой ДНК эквивалентного размера. Образующаяся рекомбинантная молекула будет реплицироваться в клетке как ДНК «рекомбинантного» фага л, «вставшего» на литический путь развития.
Чтобы понять, как функционирует векторная система на основе фага л, необходимо рассмотреть молекулярные аспекты литического цикла развития. Инфекционная фаговая частица имеет головку, в которой заключена плотно упакованная ДНК длиной примерно 50 т. п. н., и отросток с отходящими от него тонкими белковыми нитями (фибриллами). Сборка головки отростка и упаковка ДНК четко скоординированы. ДНК фага л - это линейная двух цепочечная молекула длиной 50 т. п. н. с одноцепочечными 5'-«хвостами» из 12 нуклеотидов. Их называют липкими (cos) концами, поскольку они взаимно комплементарны и могут спариваться друг с другом. После того как фаговая ДНК проходит через отросток и попадает в Е. coli , cos-концы соединяются с образованием кольцевой молекулы. На раннем этапе литического цикла в результате репликации кольцевой молекулы ДНК образуется линейная молекула, состоящая из нескольких сегментов длиной 50 т. п. н.
Каждый из таких сегментов упаковывается в белковую головку, к последней присоединяется уже собранный отросток и образуется новая фаговая частица . При упаковке молекулы ДНК длиной менее 38 т. п. н. получается неинфекционная фаговая частица, а фрагменты длиной более 52 т. п. н. не умещаются в головку. Сегменты длиной 50 т. п. н. в линейной молекуле ДНК разделены cos-сайтами, и именно по этим сайтам разрезается молекула, когда очередной сегмент заполняет головку. Разрезание осуществляет фермент, находящийся у входа в головку.
В результате исследований по изучению сборки фага л была разработана система упаковки молекул ДНК in vitro с образованием инфекционных фаговых частиц. Смешав в пробирке очищенные пустые головки, фаговую ДНК и собранные отростки, можно получить инфекционные фаговые частицы.
Задача исследователя состоит втом, чтобы заменить этот центральный участок нуклеотидной последовательностью длиной примерно 20 т. п. н. нужной ДНК. ДНК, предназначенную для клонирования, тоже расщепляют на фрагменты размером от 15 до21 т. п. н. Оба препарата - фаговую и чужеродную ДНК - объединяют и добавляют ДНК - лигазу. Фрагменты ДНК длиной 50 т. п. н. упаковываются в головки, к ним присоединяются отростки и образуются инфекционные фаговые частицы. Фрагменты большего (>52 т. л. н.) или меньшего (<38 т. п. н.) размера упаковываться не могут.
1. Амплификация интересующего участка гена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)- экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях ( in vitro ). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК.
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
· ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
· Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
· Термостабильная ДНК-полимераза - фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов - Thermusaquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcusfuriosus (Pfu-полимераза), Pyrococcuswoesei (Pwo-полимераза) и другие.
· Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
· Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
· Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции - рН, ионную силу раствора.
Электрофорез ДНК - это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.
К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель (например, динитрофенол, бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс.
После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.
Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, «линейка»), содержащий линейные фрагменты ДНК известной длины.
Выделение продуктов из геля осуществляется, сначала механическим выделением необходимого участка агарозного геля, в котором заключена ДНК, а затем с помощью специальных наборов («ЕВРОГЕН», «Glassmilk», и т.д.) проводится экстракция ДНК.
3. Лигирование ампликона в вектор (обычно плазмида)- образование фосфодиэфирной связи между двумя основаниями одной цепи ДНК, разделенных разрывом, с помощью фермента ДНК-лигазы. ДНК-лигазы абсолютно необходимы в процессах репарации ДНК и в процессах репликации - при удвоении цепи ДНК. Лигирование применяют в молекулярной биологии для соединения каких-либо молекул ДНК.
Сначала проводится рестрикция образца ДНК и плазмиды одной и той же рестриктазой (по липким или тупым концам), затем посредством водородных связей липкие концы плазмиды и образца ДНК «захлопываются» но остается разрыв на векторе, поскольку нуклеотиды сами не способны образовывать фосфодиэфирные связи. Для этого добавляется фермент ДНК-лизага, которая образует фосфодиэфирные связи в новой гибридной молекуле ДНК. Теперь мы имеем готовый вектор.
4. Трансформация полученным вектором E . C oli
Трансформация - то перенос вектора в клетки специального штамма E. coli
Трансформация состоит из двух частей это получение компетентных клеток с ночного высева бактерий с суспензионную среду и непосредственно трансформация. Между этими двумя этапами часто используют недлительную заморозку в жидком азоте или холодильнике на -80, что улучшает производительность. Получение компетентных клеток проходит в несколько этапов, суть которых заключается сначала в отделении клеток от среды LB, а затем в помещении в раствор хлорида кальция с 10мМ TrisHcl и 60% раствор глицерина. На всех этапах используют центрифугирование на низких оборотах(4600об/мин). Непосредственно трансформация осуществляется действием на клетки теплового шока, после добавления раствора плазмиды, смесь охлаждают до +4 градусов, а затем на 2 минуты помещают на водяную баню на +42 градуса. В это время клетка «захватывает» плазмиды, и после добавления среды LB полученную смесь инкубируют в термостате около часа на +37 градусов. После этого происходит растирание клеток на твердую среду, в которую заранее был добавлен антибиотик.
5. Отбор клонов (бактерии, содержащие вставку в плазмиде искомой последовательности)
Отбор клонов осуществляется реакцией ПЦР на исследуемые вставки. Детекция амплифицированного ПЦР-продукта осуществляется так же с помощью электрофореза. При наличии необходимой вставки, ПЦР продукты используются в дальнейшем при реакции секвенирования.
6. Секвенирование - определение последовательности ДНК исследуемого ПЦР-продукта.
1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. - М.: Мир, 2002. - 589 с, ил.
2. Рыбчин В. Н. Основы генетической инженерии. 2-е изд., перс роб идол.: Учебник для вузов. СПб.: Изд-во СП61ТУ, 2002. 522 с.
3. Сартакова О.Ю. Основы микробиологии и биотехнологии. Часть 1: Уч. Пособие. / Алтайский государственный технический университет им. И.И.Ползунова - Барнаул. Изд-во АГТУ, 2001. - 64 с.
Основы и техника клонирования ДНК. Этапы генной инженерии бактерий. Развитие генетической инженерии растений. Генетическая трансформация и улучшение растений с помощью агробактерий, источники генов. Безопасность генетически модифицированных растений. реферат [26,3 K], добавлен 11.11.2010
Достижения генной инженерии. Понятие и сущность клонирования. Клонирование животных. Репродуктивное и терапевтическое клонирование. Проблемы клонирования человека: этическая (религиозная), правовая, моральная. Возможные последствия клонирования человека. доклад [28,1 K], добавлен 21.01.2008
Сущность генной и клеточной инженерии. Основные задачи генной модификации растений, анализ вредности их употребления в пищу. Особенности гибридизации растительных и животных клеток. Механизм получения лекарственных веществ с помощью генной инженерии. презентация [615,8 K], добавлен 26.01.2014
Использование клеток, не существовавших в живой природе, в биотехнологических процессах. Выделение генов из клеток, манипуляции с ними, введение в другие организмы в основе задач генной инженерии. История генной инженерии. Проблемы продуктов с ГМО. презентация [2,2 M], добавлен 21.02.2014
Расщепление цепей ДНК эндонуклеазами рестрикции. Осуществление молекулярного клонирования ферментами ДНК-лигазы. Встраивание фрагмента ДНК в плазмидный вектор. Метод получения рекомбинантных плазмид. Основные этапы клонирования фрагментов чужеродной ДНК. презентация [242,3 K], добавлен 24.01.2016
Генная инженерия: история возникновения, общая характеристика, преимущества и недостатки. Знакомство с новейшими методами генной инженерии, их использование в медицине. Разработка генной инженерии в области животноводства и птицеводства. Опыты на крысах. курсовая работа [2,5 M], добавлен 11.07.2012
Использование генной инженерии как инструмента биотехнологии с целью управления наследственностью живых организмов. Особенности основных методов и достижений генной инженерии в медицине и сельском хозяйстве, связанные с ней опасности и перспективы. доклад [15,1 K], добавлен 10.05.2011
Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д. PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах. Рекомендуем скачать работу .

© 2000 — 2021



Трансформация бактерий как основа генной инженерии и молекулярного клонирования реферат. Биология и естествознание.
Курсовая работа: Учет расчетов с поставщиками и подрядчиками покупателями и заказчик
Реферат по теме Пищевые токсикоинфекции и токсикозы
Реферат: Палітыка расейскага самаўладдзя адносна яўрэйскай супольнасці Беларусі
Дипломная работа по теме Управление проектами с использованием компьютерной программной системы MS Project 2003 для Windows
Курсовая работа: Митний перевізник
Аттестационная Работа Врача Узи На 1 Категорию
Субъекты Оперативно Розыскной Деятельности Реферат
Реферат по теме Электромагнитные цепи
Курсовая работа по теме Анализ судебной практики по вопросу регулирования юридического лица
Реферат: Механические и хирургические методы контрацепции. Скачать бесплатно и без регистрации
Основные Этапы Профессиональной Пригодности Реферат
Мифология Древних Славян Реферат
Контрольная работа по теме Понятие экономического цикла
Дипломная работа по теме Система финансовых ресурсов экономических субъектов
Дипломная работа по теме Арбитражно-процессуальные сроки
Дипломная работа по теме Анализ деятельности Министерства социальных отношений Челябинской области по осуществлению социальной защиты инвалидов
Транспорт Дипломные Работы
Курсовая работа по теме Информационная система учета кадров предприятия ОАО 'Окприбор'
Кадровый потенциал
Курсовая работа по теме Будапештская операция
Рекордисти з швидкості і повільності пересування - Биология и естествознание реферат
Описание особенностей биологии редких видов рыб русла реки Припять - Биология и естествознание курсовая работа
Управление безопасностью труда - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда курсовая работа