Текущее состояние тестирования на COVID
https://doi.org/10.1097/01.ASM.0000716944.70366.26В связи со вспышкой вируса SARS-CoV-2 в китайской провинции Хубэй в конце 2019 года возникла немедленная необходимость в точном тестировании нового вируса в беспрецедентных масштабах. Диагностика играет невероятно важную роль в сдерживании любой заразной вспышки, поскольку идентификация инфицированных людей позволяет изолировать их для предотвращения распространения болезни, а также позволяет отслеживать контакты для выявления других потенциально инфицированных людей.
Поскольку в то время не было доступных диагностических средств, характерные помутнения матового стекла, отмеченные при компьютерной томографии инфицированных пациентов, первоначально использовались для диагностики. С выделением SARS-CoV-2 в качестве возбудителя этого заболевания последовал всплеск активности, в результате чего был проведен ряд исследований с целью разработки эффективных и массовых средств диагностики этого вируса. Недавний обзор Удугамы, Чана и др. осветил некоторые технологии и рабочие характеристики диагностических средств, разработанных для наблюдения за SARS-CoV-2 ( ACS Nano 2020; 14: 3822-35 ).
Селективность и специфичность в тестировании
В рамках бинарного теста (т.е. положительный или отрицательный результат теста, рисунок 1 ) существует четыре возможных результата этого теста: истинно положительный (TP), когда тест точно определяет положительный результат (тест правильно выявляет болезнь у человека. с этой болезнью); истинно отрицательный (TN), когда тест правильно определяет отрицательный результат теста (тест не показывает заболевания у неинфицированного человека); ложноположительный (FP), когда тест дает положительный результат для того, что на самом деле является отрицательным (тест неверно показывает положительный результат для неинфицированного человека); ложноотрицательный (FN), когда тест показывает отрицательный результат вместо фактического положительного (тест дает отрицательный результат для болезни у инфицированного человека).
Фигура 1:
TP - истинно положительное; TN - истинно отрицательный; FP - ложное срабатывание; ФН - ложноотрицательный.
Двумя конкретными показателями, используемыми для измерения эффективности метода тестирования двоичных результатов, являются чувствительность , которую иногда называют истинно положительным показателем (способность теста точно измерять фактические положительные результаты теста), и специфичность , также называемая истинно отрицательным показателем ( способность теста точно определять отрицательные результаты). Чувствительность и специфичность определяются с использованием значений для четырех результатов теста в этой двоичной системе результатов.
Очень хорошее объяснение этих понятий представлено в Википедии ( https://en.wikipedia.org/wiki/Sensitivity_and_specificity ).
Чувствительность - это количество истинных положительных результатов, деленное на все фактические положительные результаты (т. е. истинные положительные результаты плюс ложно отрицательные, как показано на рисунке 1 ).
Специфичность - это количество истинных негативов, деленное на все фактические негативы (т. е. истинные негативы плюс ложные срабатывания).
Чтобы интерпретировать результат теста, необходимо знать положительные и отрицательные прогностические значения. Положительная прогностическая ценность говорит вам, следует ли верить положительному результату, а отрицательная прогностическая ценность говорит вам, следует ли верить отрицательному результату. Прогнозирующая ценность положительного результата - это количество истинных положительных результатов, деленное на общее количество положительных тестов (т. е. истинных положительных результатов плюс ложных положительных результатов). Прогнозирующая ценность отрицательного результата - это количество истинно отрицательных результатов, разделенное на общее количество отрицательных тестов (т. е. истинных отрицательных результатов плюс ложноотрицательных).
Не хватает одного важного момента: распространенности COVID среди населения. Чувствительность и специфичность определяются самим анализом, потому что при разработке анализа можно точно знать состояние каждого исследуемого образца. Однако для положительного и отрицательного прогноза вам необходимо знать, какая часть протестированных пациентов действительно имеет COVID. Другими словами, какова распространенность? Положительные и отрицательные прогностические значения полностью различаются, если заболевание встречается очень редко (например, только 0,1% тестируемого населения имеет COVID) или очень часто (например, 90% населения имеет COVID).
Существует множество онлайн-калькуляторов для положительных и отрицательных прогнозных значений. Как вариант, вы можете загрузить электронную таблицу, созданную авторами asamonitor.pub/ spreadsheet .
ОТ-ПЦР тестирование на COVID
Геном SARS-CoV-2 представляет собой одноцепочечную РНК с положительным смыслом длиной примерно 30 тыс. Нуклеотидов, которая кодирует 27 различных белков. Среди наиболее важных генов для анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) находятся гены, которые кодируют следующие белки: РНК-зависимую РНК-полимеразу ( RdRp ), белок малой оболочки ( E ), матричный белок ( M ), белок нуклеокапсида ( N ) и гликопротеин поверхности шипа ( S ).
Есть три области довольно консервативных последовательностей в атипичной пневмонии , связанных вирусных геномов: 1) RDRP , которая существует в открытой рамке считывания ORF1ab области, 2) E , и 3) N . Как следствие, многие из генетических тестов, разработанных для диагностики SARS-CoV-2, были сосредоточены на этих генах.
ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) может быть проведена с использованием одно- или двухэтапного процесса; в одноэтапном анализе и обратная транскрипция, и ПЦР-амплификация объединены в один этап. Они выполняются последовательно в двухэтапном процессе. Одноэтапный протокол может обеспечить довольно надежные и воспроизводимые результаты при высокой пропускной способности; Оптимизация этапов одновременной амплификации и обратной транскрипции может оказаться сложной задачей. Последовательно выполняемая двухступенчатая реакция более чувствительна, но требует больше времени и дополнительной оптимизации параметров.
Тестирование на антитела COVID
В процедуре, описанной Zhang et al., Иммуноглобулины G и M (IgG и IgM) были обнаружены в сыворотке крови пациентов с COVID-19 с использованием иммуноферментного анализа (ELISA) ( Emerg Microbes Infect 2020; 9: 386- 9 ).
В их методике поверхность 96-луночных планшетов, покрытых рекомбинантными белками, обрабатывают разбавленной сывороткой человека в течение одного часа, после чего планшет ополаскивают. Затем лунку обрабатывают античеловеческим IgG, функционализированным пероксидазой хрена; Затем планшет ополаскивают и обрабатывают восстанавливающим агентом, который вступает в реакцию с пероксидазой, вызывая поддающееся количественной оценке изменение цвета. Аналогичный тест на IgM, проведенный теми же исследователями, имеет аналогичный протокол, но вместо этого основан на планшете, покрытом антителами против человеческого IgM.
Оценка экспресс-тестирования (по месту оказания медицинской помощи)
Исследователи из Боннского университета недавно описали исследование, в котором экспресс-тест на COVID-19 сравнивался с признанным золотым стандартом диагностики - количественной ПЦР (qPCR) ( Public Health 2020; 182: 170-2 ) . Двойная диагностика в месте оказания помощи IgG / IgM, оцениваемая в этом исследовании, является качественной и показывает наличие инфекции COVID-19 в прошлом или настоящем. Для анализа требуется всего две капли крови, и он выполняется в течение 20 минут. Чип для тестирования в месте оказания медицинской помощи имеет полосы обнаружения, покрытые мышиными антителами против человеческого IgG и IgM. После добавления двух капель крови и некоторого количества раствора реагента положительные результаты для IgG и IgM получены через 15 и 20 минут соответственно.
В их исследовании 39 случайно выбранных лиц в центре скрининга COVID-19 были протестированы одновременно с помощью диагностики на месте и количественной ПЦР. Кроме того, был проведен анализ 10 человек с подтвержденными ранее случаями COVID-19.
В общей сложности 22 субъекта из 49, включенных в исследование, были подтверждены как COVID-положительные с помощью повторной количественной ПЦР; однако диагностика в месте оказания медицинской помощи выявила только восемь из этих положительных пациентов с чувствительностью 36,4%. Что касается остальных 27 пациентов с отрицательным COVID-статусом, 24 были правильно идентифицированы с помощью диагностики в месте оказания медицинской помощи, что дало специфичность 88,9%. Авторы приходят к выводу, что на диагностику в месте оказания медицинской помощи не следует полагаться при обследовании населения как части мер общественного здравоохранения, учитывая ее низкую чувствительность.
Тест на антитела и характеристики пациента
В недавней статье Nature Medicine исследователи со всего Китая представили данные 285 пациентов об острой реакции антител на инфекцию SARS-CoV-2 ( Nat Med 2020; 26: 845-8). Все субъекты показали серопозитивность к противовирусным IgG в течение 19 дней с момента появления симптомов. Сероконверсия для IgG и IgM может происходить одновременно или асинхронно, при этом уровни как IgG, так и IgM выходят на плато в течение шести дней после сероконверсии.
Подгруппа из 63 пациентов с подтвержденным COVID-19 наблюдалась до выписки с продольным сбором образцов сыворотки с трехдневными интервалами. Во время наблюдения общий уровень сероконверсии у этих субъектов составил 96,8%. Кроме того, два родственных пациента (мать и дочь) сохраняли IgG- и IgM-негативность на протяжении всей госпитализации.
Другая подгруппа из 26 изначально серонегативных пациентов испытала сероконверсию во время наблюдения; во всей этой подгруппе сероконверсия IgG или IgM была достигнута в течение 20 дней (в среднем 13 дней) после появления симптомов. Комбинированная сероконверсия IgG и IgM может происходить одним из трех способов: одновременно (n = 9), IgM ранее (n = 7) или IgG раньше (n = 10). Основываясь на своих выводах, авторы делают вывод, что серологическое тестирование может помочь в диагностике как бессимптомных инфекций, так и предполагаемых случаев с отрицательными результатами ОТ-ПЦР.
Недавно было опубликовано исследование, проведенное врачами из Медицинского университета Чунцина, включая клинические особенности и иммунные ответы подтвержденных ОТ-ПЦР бессимптомных инфицированных COVID-19 людей в районе Ваньчжоу в Китае ( Nat Med, июнь 2020 г.)). Бессимптомные пациенты, включенные в это исследование, не проявляли клинических симптомов в течение и за две недели до госпитализации. Было обнаружено, что у этих бессимптомных пациентов вирусное выделение длилось в среднем 19 дней, что было значительно дольше, чем у пациентов с симптомами. Среднее отношение сигнала к пороговому значению (S / CO), равное 3,4, отмеченное для уровней SARS-CoV-2-специфических IgG у бессимптомных лиц, было значительно ниже по сравнению с симптомными людьми в острой фазе, у которых медиана отношения S / CO составляла 20.5. Авторы отметили, что 93,3% и 81,1% бессимптомных лиц в ранней фазе выздоровления имели снижение уровня IgG и нейтрализующих антител, соответственно; те же значения были 96,8% и 62,2% для пациентов с симптомами. В ранней фазе выздоровления болезни, Серонегативность IgG отмечена у 40% бессимптомных лиц и 12,9% симптоматических. У бессимптомных субъектов также были более низкие уровни 18 про- и противовоспалительных цитокинов, что свидетельствует о более слабом иммунном ответе на инфекцию SARS-CoV-2. Авторы отмечают, что снижение уровня IgG и нейтрализующих антител во время ранней фазы выздоровления может иметь значительные последствия для иммунных стратегий и серологических исследований.
Авторы ссылаются на предыдущие исследования снижения нейтрализующих антител при выздоровлении пациентов с COVID-19, предполагая, что для сдерживания болезни может потребоваться использование длительных вмешательств в области общественного здравоохранения, таких как широкое тестирование, социальное дистанцирование и изоляция групп «высокого риска». Они также предполагают, что завершение дополнительных продольных серологических исследований пациентов с COVID-19 крайне необходимо для оценки сроков опосредованного антителами иммунитета. Отмечая низкий уровень IgG к SARS-CoV-2 у бессимптомных пациентов, которые также с большей вероятностью станут серонегативными, они также настоятельно требуют дополнительных серологических обследований для оценки фактических показателей инфицирования COVID-19.
Летальность при тестировании
Принято считать, что на раннем этапе вспышки SARS-CoV-2 изначально высокий уровень смертности со временем снизится, поскольку число неопасных для жизни случаев COVID-19 будет выявлено с помощью расширенного тестирования. На момент написания этой статьи этого явно не произошло. Фактически, как можно легко увидеть из данных по отдельным штатам США ( рис. 2 ), некоторые штаты с наибольшим процентом протестированных жителей имеют самые высокие показатели смертности (например, Нью-Йорк и Нью-Джерси).
Фигура 2:
Штаты США - Смертность по сравнению с тестированием по состоянию на 11 июля 2020 г.
Данные по отдельным странам немного более запутаны ( Рисунок 3 ). В двух странах с самыми высокими показателями тестирования показатели летальности действительно довольно низкие; однако это Бахрейн и Люксембург, оба небольшие страны. В странах с самым высоким уровнем летальности около 15%, Бельгии, Великобритании и Италии было протестировано примерно 10% населения.
Фигура 3:
Страны - Смертность по сравнению с тестированием по состоянию на 11 июля 2020 г.
Различные диагностические потребности в клинических условиях и в условиях наблюдения
Исследователи из Университета Колорадо в недавнем препринте, опубликованном на сайте medRxiv, пришли к выводу, что требования к диагностическому надзору значительно отличаются от тех, которые используются в клинических целях, и, следовательно, чувствительность теста для целей надзора является вторичной по отношению к частота и сроки проведения тестирования на COVID-19 ( medRxiv, июнь 2020 г. ).
Авторы заявляют, что, поскольку клинические диагнозы нацелены на лиц с симптомами, потребность в высокой точности и чувствительности решает проблему стоимости и времени диагностики. Поскольку у этих людей есть симптомы, их можно изолировать до тех пор, пока не будут получены результаты, что предотвратит появление дополнительных инфекций. Для бессимптомных людей задержка результатов теста даже на один день может привести к ряду потенциальных инфекционных контактов, что подорвет усилия по надзору. Авторы отмечают, что скорость сообщения более важна, чем чувствительность, особенно если рассматривать инфекционный агент с подтвержденной трансмиссивностью для SARS-CoV-2. В результате этих различных требований,
В их исследовании определенные модели предполагают, что различные методы наблюдения могут подвергать некоторых людей ненужным карантинным дням. В качестве примера они приводят нечастое использование чувствительного теста, который позволит выявить людей с низкой вирусной нагрузкой, в том числе тех, кто находится в начале инфекции (кого следует изолировать, чтобы ограничить передачу вируса), а также людей, которые выздоравливают и могут иметь обнаруживаемые уровни, но, тем не менее, ниже порогового значения для передачи (изоляция которого не влияет на распространение вирусов и без необходимости увеличивает финансовое бремя). Авторы заявляют, что более эффективные решения о карантине можно было бы принять, если бы использовались серологические исследования, повторное тестирование (с интервалом 24 или 48 часов) или какой-либо другой тест, чтобы различать пациентов с низкой вирусной нагрузкой, которые находятся на подъеме инфекции.
Источник: https://doi.org/10.1097/01.ASM.0000716944.70366.26
наша команда: https://t.me/intensivemedicaleducation