Регуляция экспрессии генов фумаратгидратазы в зеленых листьях кукурузы в условиях гипоксии - Биология и естествознание курсовая работа

Главная

Биология и естествознание
Регуляция экспрессии генов фумаратгидратазы в зеленых листьях кукурузы в условиях гипоксии

Дефицит кислорода как стрессовый фактор для растений. Энергетическое состояние клетки в условиях гипоксии. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени. Динамика активности фумаратгидротазы в зеленых листья кукурузы в условиях гипоксии.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Регуляция экспрессии генов фумаратгидратазы в зеленых листьях кукурузы в условиях гипоксии
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид окисленный
НАДН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
Rf - электрофоретическая подвижность
В природе растения могут находиться в условиях пониженного содержания кислорода при переувлажнении или затоплении почв, при сильной загазованности в городах, произрастании в условиях высокогорья.
Виды растений различаются по восприимчивости к гипоксическому стрессу. Толерантность может варьироваться от нескольких часов до нескольких дней и даже недель в зависимости от вида, органов, испытывающих недостаток кислорода, этапа развития, а так же внешних условий, таких как температура.
В настоящее время механизмы растений, которые лежат в основе кратко- и долговременной устойчивости к анаэробным условиям исследуются многими учеными. Они направлены на предотвращение цитоплазматического ацидоза, адекватную реакцию на стресс, обеспечение минимальной энергией для поддержания жизнедеятельности, модификации экспрессии генов и изменении метаболических путей с целью акклиматизации к низкому содержанию кислорода в среде [34].
В условиях гипоксии электрон транспортная цепь митохондрий претерпевает некоторые изменения: растения осуществляют поиск других альтернативных соединений, способных выступать в качестве конечного акцептора электронов. Цикл Кребса так же не является исключением, соответственно и его компоненты тем или иным образом реагируют на недостаток кислорода.
Фумараза (фумаратгидратаза, КФ 4.2.1.2) - это фермент, который занимает одно из ключевых положений в регуляции дыхания митохондрий, а так же выполняет важную роль в обеспечении взаимодействия клеточных органелл. Данный фермент у некоторых организмов кодируется 2 генами fum 1 и fum2, в клетке представлен в цитозольной и митохондриальной форме. В роли митохондриального фермента он катализирует одну из стадий цикла: реакцию превращения фумарата в малат, а в цитозоле ему предписывают несколько функций: непосредственное участие в метаболизме азота и утилизация фумарата, образующегося в реакции, катализируемой аргининсукцинат-лиазой, находящейся в цитозоле или пластидах [31]. В связи с тем, что недостаток кислорода оказывает существенное влияние на обмен веществ в клетке, а фумаратгидротаза является важным участником метаболизма растений, целью нашей работы являлось изучить изменение активности фумаратгидротазы в зеленых листьях кукурузы в условиях гипоксии.
1.1.1 Дефицит кислорода как стрессовый фактор для растений
Растительный организм на различных этапах своего онтогенеза подвергается стрессовым воздействиям со стороны окружающей среды, таким как изменения температуры, интенсивности света, нехватки питательных веществ, избытку или недостатку воды. В дополнение к этим абиотическим стрессам, на растения также влияют различные инфекционные возбудители и насекомые-фитофаги [24].
Стрессовым фактором, рассматриваемым в данной работе, является гипоксия или дефицит кислорода. Растения демонстрируют удивительные способности переносить низкое содержание кислорода. Для того, чтобы переносить стресс, растения разработали многочисленные морфологические и физиологические адаптации, к которым относятся: удлинение междоузлия и листовые пластинки для эффективного поглощения газа. А так же обмен веществ, при котором ограничивается рост с целью сохранения углеводных и энергетических запасов до тех пор, пока кислород не будет снова в свободном доступе [22].
В природных условиях гипоксия может наблюдаться в случае избыточного увлажнения или затопления почв, в связи, с чем растение может длительное время испытывать недостаток кислорода. Так как его нехватка способна вызвать сильнейшие нарушения в метаболических процессах клетки, серьезной задачей для современных исследователей является изучение механизмов и поиск путей адаптации растений к условиям гипоксии [25].
клетка фумаратагидротаза растение гипоксия
1.1.2 Энергетическое состояние клетки в условиях гипоксии
Основным условием существования клетки является обеспеченность ее энергией. Условия гипоксии могут способствовать развитию энергетического кризиса, что приводит к серьезным нарушениям и повреждениям структур и функций клетки. Поскольку митохондрии являются основными органеллами для производства энергии, поддержание их в функциональном состоянии, является важной задачей во время кислородного голодания.
Для выполнения надлежащих функций митохондрии выработали особую стратегию, с помощью которой даже в условиях гипоксии они сохраняют работоспособность ЭТЦ без кислорода посредством использования нитрита в качестве терминального акцептора электронов. Производимый АТФ наряду с АТФ, генерируемым путем ферментации поддерживает процессы транскрипции и трансляции, необходимые для гипоксической выживания растений. Все это служит биохимической адаптацией, приводящей к стабилизации энергетического состояния и тем самым в защите растений в условиях гипоксического стресса [21].
1.1.3 Функционирование митохондрий при недостатке кислорода
Для работы ЭТЦ необходимым является наличие кислорода, любые изменения его концентрации могут оказывать влияние на создание энергетической валюты клетки. При гипоксии, цитохромокасидзы ограничены в способности использовать кислород, в то время как альтернативная оксидаза практически не функционирует в низко кислородных условиях из-за различных значений Кm этих двух терминальных оксидаз [23].
В своих исследованиях Мюллер и др. показали защитную роль нитратов для корневых митохондрий кукурузы и гороха. Было предположено, что нитрат (NO3) может выступать в качестве терминального акцептора электронов, который поддерживает работу электрон транспортной цепи в отсутствие кислорода [27]. Но нет никаких сообщений о том, что митохондрии содержат каких-либо транспортеров для нитратов. С другой стороны, нитраты могут косвенно поддерживать функциональность митохондрий при гипоксии, через его восстановлением до нитритов, которые могут быть импортированы в митохондриях, подобным переносчика найденному в хлоропластах или с помощью внутреннего митохондриального мембранного анион-канала (PIMAC), активируемого при низкой концентрации АТФ [28].
1.1.4 Влияние гипоксии на метаболизм растений
Концентрация кислорода в клетке влияет на метаболическую активность как животных так и растительных тканей, а также в клетках бактерий и дрожжах[14].В растениях даже небольшое снижение концентрации кислорода в окружающей среде приводит к изменению клеточной энергетики (соотношение АТФ и АДФ), увеличение NADH по отношению к NAD+ как правило, все это рассматривается как общий ответ на гипоксию аэробных организмов, в том числе и растений [11].
1.2.2 Структура молекулы фумаратгидротазы
Была определена полная аминокислотная последовательность фумаратгидротазы свиньи. Фермент представляет собой тетрамер,состоящий из идентичных субъединиц с молекулярной массой 48,5 кДа и который состоит из 466 аминокислотных остатков. Фумараза, выделенная из сердца свиньи на 96% идентична ФГ, находящейся в печени человека.. Прогнозирование вторичных структурных данного фермента показыло, что фермент содержит большое количество альфа-спирали с очень небольшим количеством бета-структур [30].
Raghavendra A.S. с соавторами 1994 в своей статье «Interdependence of photosynthesis and respiration in plant cells: interactions between chloroplasts and mitochondria» проводят анализ аминокислотных остатков сайтов связывания фумаразы в бактерии Е. coli. Авторами было обнаружено наличие пары связывающих сайта: сайт А включает в себя остатки аминокислот принадлежащие трем другим субъединицам. Остатки Трн-100, Сер-139, Сер-140, и Асн-141 из b-субъединицы, Трн-187, Гис- 188 из d-субъединицы, и Лиз-324, Асн-326 из с-субъединицы. Ученые помимо аминокислотных остатков, перечисленных выше, обнаружили молекулу воды, которая была связана с Сер-98, Трн-100, Асн-141 из b-субъединицы и Гис-188 из d-субъединицы. Второй сайт (сайт В), является как бы соседним и создан остатками, принадлежащими отдельной субъединице (b-субъединицы), то есть Ар-126, Гис-129, Асн-131, и Асп-132. Данные сайты участвуют в формировании водородных связей с субстратом и ингибиторами. Вопрос о том, какой же из пары сайтов является каталитическим сайтом фумаратгидротазы ,был решен путем эксперимента, основанного на сайт-направленном мутагенезе. Было показано, что мутации в сайте А приводит к потере удельной ферментативной активности, в то время как изменения в сайте В на активность фермента не оказывают существенного влияния [30].
В состав фумаратгидротазы входит 12 тиоловых групп, по 3 на каждую из четырех субъединиц. Причем тиоловые группы обладают меньшей реакционной способностью в активном ферменте, по сравнению с неактивной молекулой. Потому как в белке, подвергшемуся денатурации, количество тиоловых групп возрастает, то по их числу можно судить о потери активности фермента [16,17]
В Arabidopsis фумаратгидротаза кодируется двумя различными генами: FUM1 (At2g47510) и FUM2 (At5g50950). Два гена имеют одинаковую структуру экзонов и кодирует два белка, которые являются на 95% идентичны на уровне аминокислотной последовательности по всей длине, за исключением N-концевой области. Информация, закодированная в экзоне 1 в каждом гене отличается друг от друга так, что FUM1 и FUM2 кодируют концы 25 и 32 аминокислот (соответственно) с небольшим сходством, а последующие 23 остатков этого экзона идентичны. Это означает, что эти два гена возникли в результате дупликации с образованием измененного первого экзона [10]. Первый ген, FUM1, кодирует митохондриальных фермент, который является важным геном, а его удаление или нокдаун летально. Второй ген FUM2, обнаруженный в Arabidopsis, может кодировать цитозольную «эхоформу» [36]. FUM2 требуется для накопления фумарата в листьях, который, в свою очередь, необходимой для быстрого усвоения азота и роста при высоком содержании азота [10].
Фумаратгидротаза, которая содержится в клетках печени крысы, кодируется единственным геном, однако ее двойная локализация обуславливается наличием двух трансляционных продуктов. Генетический картирование показало, что крысиная фумараза имеет только одну, полноразмерную мРНК. Однако в исследованиях in vitro было обнаружено два трянсляционных продукта: первый полноразмерный предшественник, содержащий N-конец митохондриальной сигнальной последовательности; и второй, в виде короткой версии, которой не хватало сигнальной последовательности[29].
1.2.4 Двойная локализация фумаратгидротазы в клетке
Хорошо известно, что в эукариотических клетках молекулы одного белка могут быть расположены в более чем одном субклеточных компартменте, такое явление называется двойным нацеливание, бимодальным нацеливание или двойной локализацией [36]. Белки кодируются в ядре и посттрансляционно импортируются в соответствующие целевые органеллы, транспортные сигналы, как правило, селективными для одной определенной органеллы [32]. Если ранее считалось, что фумаратгидротаза - белок митохондрий, то сейчас, как показывают современные исследования, он так же локализуется в цитоплазме. В различных организмах его распределение осуществляется по-разному.
В митохондрии белковые молекулы могут попадать по средствам следующего механизма: белок синтезируются в виде предшественника, несущего N-концевую МТС последовательность. Предшествующие белки распознаются рецепторами внешней митохондриальной мембраны и транслоцируются через нее посредством транслоказного комплекса наружной мембраны (ТОМ). Предшественники затем перемещаются через внутреннюю мембрану через транслоказу внутренней мембраны (TIM).В естественных и искусственных условиях, большинство митохондриальных белков может быть успешно импортированы в митохондрии после прекращения трансляции[36].
В дрожжах S. Cerevisiae обнаружен другой механизм пострансляционного распределения белков между цитоплазмой и мотоходриями - механизма обратного переноса. Сначала белковые молекула направляются в митохондрии,где они обрабатываются митохондриальной пептидазой процессинга, однако часть белков движеться обратно в цитозоль Если в течение импорта, образующаяся аминокислотная цепь начинает скручиваться в митохондриальном матриксе, то по завершению импорта, она локализуется в митохондрии. А цепочка, начинающая процесс фолдинга в цитозоле, блокирует движение вперед, и выводится из механизма импорта, оставаясь при этом в цитоплазме [9].
1.2.5 Регуляция активности фумаратгидратазы
Главная задача фермента это функционирование, отвечающее требованиям организма. Фермент, чтобы осуществлять все присущие ему свойства с необходимой скоростью, должен обладать особыми механизмами, которые могут воспринимать и реагировать на сигналы, поступающие из окружающего мира [26].
Фумаратгидротаза - фермент, играющий важную роль в регуляции клеточного дыхания, а так же в обеспечение слаженного взаимодействия клеточных органойдов. Как и у всех ферментов, ее активность зависит от значения pH, цитозольная форма в Zea mays имеет низкий оптимум рН (6,5) и высокое сродство к малату (км 5 мкМ) по сравнению с митохондриальной формой (оптимум рН 7,0, км 50 мкМ) [18].
В качестве конкурентного ингибитора ФГ может выступать пиромеллитовая кислота, так как является структурным аналогом фермента, другим конкурентным ингибитором может быть 2-оксоглутарат. Кроме того было показано, для A. thaliana конкурентными ингибиторами фумаразы также являются AДФ, AMФ, цитрат, пируват и сукцинат.
Другим мощным ингибитором активности фумаразы является АТФ, однако существует следующая зависимость: в присутствии Mg2+ ингибирующее действие АТФ снижается. Ингибирование АТФ увеличивается при низких значениях рН, считается, что АТФH3- более эффективный ингибитор, чем АТФ4-. Более того, способность магния, снижать ингибирующее воздействие снижается при низких значениях рН, что связано с тем, что АТФH3- имеет более низкую аффинность, чем АТФ4- к Mg2+.
В качестве активирующих агентов фумарат гидротазы могут служить борат, арсенат, фосфат и ацетат, а так же SO42-, Cl- [20].
Целью данного исследования являлось изучение особенностей функционирования фумаратгидротазы в зеленых листьях кукурузы в условиях гипоксии.
В соответствии с целью работы, были выдвинуты следующие задачи:
1. Создание экспериментальных условий с пониженным содержанием кислорода;
2. Изучение динамики активности фумаратгидротазы в зеленых листьях кукурузы при выдерживании растений в течение 3ч, 6ч и 24 ч в условиях недостатка кислорода;
3. Выявление особенностей изоферментного состава фумаратгидротазы в зеленых листьях кукурузы в условиях гипоксии;
4. Определение уровня экспрессии генов fum1 и fum2 в листьях кукурузы при низкой концентрации кислорода.
В качестве объекта исследования были выбраны 10-12-дневные растения кукурузы (Zea mays L.) сорта Воронежская 76 , выращиваемые методом гидропоники на водопроводной воде при постоянной температуре 25 С и 12-часовом световом дне.
2.2.2 Создание экспериментальных условий с пониженным содержанием кислорода
Растения в возрасте 10-12 дней перед постановкой опыта в течение суток выдерживали в темноте. Затем помещали в стаканчики с чистой водой и ставили на 24 часа в изолированные от поступления света вакуум-эксикаторы объемом 5 литров, через которые пропускались различные газовые среды - воздух, углекислый газ и азот из коммерческих баллонов.
Скорость поступления газа составила 17 см3/сек по разработанной ранее методике. По сертификату присутствие О2 в баллоне с азотом составляло не более 0,5 %, следовательно, используемые в опытах условия можно считать гипоксическими.
2.2.3 Определение активности фумаратгидротазы
Активность фумаратгидротазы определяли спектрофотометрическим методом на СФ 2000 при длине волны 240 нм. по увеличению оптической плотности в следствии образования двойной связи в молекуле фумарата.В качестве субстрата использовался малат натрия. [7]
Растительную навеску массой 150-200 мг растирали в ступке в соотношении 1:5 с 0,05М. фосфатным буфером pH 7.4, содержащим 5мМ ЭДТА и 5мМ MgSO4 смесь фильтровали и центрифугировали 5 мин , 5000 об/мин на ЦФ eppendorf Centrifuge 5804 R. Полученный супернатант использовали для определения активности фермента.
Среда спектрофотометрирования включала 0,05М фосфатный буфер рН 7,4 и 3мМ малат натрия. В кварцевую кювету вносили 3 мл. среды спекстрофотометрирования, вносили 10 мкл. пробы и определяли изменение оптической плотности при длине волны 240 нм. Активность фермента рассчитывали по формуле:
где ?D - изменение оптической плотности при длине волны 240 нм, ? - коэффициент молярной экстинкции, Vобщ - общий объем ферментной вытяжки (мл), Vвнес - объем внесения (мл), t - время (мин).
Все процедуры по выделению фермента проводили при температуре 4оС.
2.2.4 Электрофоретическое исследование изоферментного состава
Фермент был выделен, как описывалось ранее в определении активности. Идентификация проводилась с использование метода диск-электрофреза в полиакриламидном геле с применением камеры для вертикального электрофореза производства Helicon VE-10. Концентрирующий гель представлен 4% полиакриламидным гелем, разделяющий 7% полиакриламидным гелем. В каждый карман геля вносилось количество пробы, соответвующее концентрации 3мг/мл. Для контроля движения фронта использовался 2мкл. 0,1% бромфенолового синего. В качестве электродного буфера применяли 0, 025М трис-HCl и 0,192М глицин рН 8,3.
Электрофорез ферментативных препаратов проводили в 2 этапа: при прохождение белковых проб через концентрирующий гель сила тока равнялась 19 мА, при прохождении проб через разделяющий гель сила тока увеличивалась на 6мА и составляла 25 мА. [7]
2.2.5 Специфическое окрашивание фумаразы
Специфическое окрашивание фумаратгидротазы проводилось с использованием 50мМ трис-HCl буфере рН 7,4, включающий 20мМ фумарат натрия, 3мМ NAD+, 1Е малатдегидрогеназы, нитросиний теразолий и FMS. Гелевая пластинка после окончания электрофореза извлекалась из камеры и помещалась в проявляющую смесь, где выдерживалась при температуре 37оС до появления белковых полос, после чего пластинка помещалась в 7% уксусную кислоту. Изображение геля с проявившимися полосами белка фиксировалось на фотокамеру. [7]
2.2.6 Выделение суммарной клеточной популяции РНК
При выделение РНК из зеленых листьев кукурузы использовался метод гуанидин-тиоционат-фенол-хлороформной экстракции [13]. Растительную навеску массой 150-200 мг растирали в буфере, содержащим гуанидин тиоционат и центрифугировали 5мин 3000об/мин. Затем отбирали надосадочную жидкость и приливали 1V смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1. После чего полученную смесь инкубировали на льду в течение 10 мин., а затем центрифугировали 5мин. 10000 об/мин., при температуре 4С. Далее использовалась надосадочная жидкость, к которой приливались 3V 96% этанола и 1 мкл ацетата натрия в качестве осадителя. Полученная смесь инкубировалась в течение 30 мин. при температуре -20оС. После инкубирования эппендорфы центрифугировали в течение 10 мин. 12000 об/мин., надосадок удалялся , а осадок высущивался до полного испарения спирта, нуклеиновые кислоты растворялись в 50мкл. стерильной воде.
2.2.7 Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот
Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот производился в 1% агарозном геле производства Helicon (Россия). В качестве буфера использовался 50 ТАЕ-буфер, красителем для визуализации нуклеиновых кислот бромистый этидий. Гелевая пластинка помещалась в электрофоретическую камеру, заполненную 1хТАЕ буфером (рН 8,5).Пробы вносили в каждый карман в объеме 5 мкл. Электрофорез проходил в течение 40 мин. при напряжении 70В.
Оценка качества выделенных нуклеиновых кислот проводилась на трансиллюминаторе с длиной волны 312 нм. Результаты фиксировались системой фото-видео документирования DNA Analyzer (ДНК-технология, Россия) и обрабатывались с помощью программы Gel Explorer 1.0.
2.2.8 Определение концентрации нуклеиновых кислот
Измерения оптической плотности образцов проводились на СФ 2000 в кварцевых кюветах при длине волн 260 и 320 нм. Среда фотометрирования представляла собой 0,09% физиологический раствор, проба вносилась в количестве 5 мкл. Разница оптической плотности (D260/320) вносилась в программу, где автоматически производился расчет концентарции.
Обратная транскрипция осуществлялась при помощи набора MMLV Reverse Transcriptase. РНК матрица в количестве 1-6 мкл. (0,5-2мкг) с 1-3 мкл. олиго-dT праймера, позволяющего избирательно получить молекулы кДНК, соответствующие исключительно мРНК и объемом стерильной воды, необходимым до доведения общего объема смеси до 9 мкл., прогревались в течение 2 мин. при температуре 70оС, затем эппендорфы со смесью переносились на лед и к ним добавлялись 4 млк. 5 буфера,4 мкл. 10мМ dNTP, 2 мкл DTT и общий объем доводился до 20 мкл. После чего полученную смесь прогревали при температуре 37С в течение 30 мин.
2.2.10 Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени
RT-ПЦР проводилось на приборе Bio-Rad DNA Engine Thermal Cycler Chromo 4 (Bio-Rad, США), краситель, применяемый в работе - SYBR Green. В качестве праймеров, подобранных с помощью программного обеспечения Primer3, использовали нуклеотидные последовательности:
прямой - 5' -gattacttcgatcattgaggt-3'
обратный 5' -accagaactcgcggatgtggc-3'
прямой - 5'-acaaacttgccattcgtcacc-3';
обратный - 5'-tggttcattctcaggcagaga-3'
Параметры проводимой амплификации: денатурация 95оС - 5 мин., после чего цикл: 95оС - 30 сек., 60оС - 30 сек., 72оС - 30 сек. (детекция), финальная элонгация - 72оС - 10 мин. Количество кДНК контролировалось с использованием параллельной амплификации фактора элонгации ef-1? и разработанными нами ген-специфичными праймерами. Отрицательным контролем служила суммарная РНК не подвергшаяся обратной транскрипции.
Относительный уровень экспрессии исследуемых генов определялся при помощи 2-??Ct-метода и программного обеспечения Opticon MonitorTM Software (Biorad, США).
2.2.11 Статистическая обработка данных
Каждый опыт проводился в 3-4 кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. На рисунках приводятся данные опытов, каждое значение есть среднее из трех измерений. Полученные данные обрабатывали с использованием статистических критериев. Обсуждаются статистически достоверные различия при р < 0,05 [4].
Глава III Полученные результаты и их обсуждения
3.1 Динамика активности фумаратгидротазы в зеленых листья кукурузы в условиях гипоксии
Изучение механизмов приспособления организмов к изменяющимся условиям среды обитания становится особенно актуальным в связи с глобальными изменениями климата, загрязнением окружающей среды, а также для решения различных практических задач. Способность растений произрастать в обедненной кислородом среде связана с формированием целого комплекса анатомо-морфологических и физиолого-биохимических приспособлений, среди последних ведущая роль принадлежит приспособлениям процесса дыхания. Оптимальное для дыхания парциальное давление кислорода составляет 21%, снижение этого показателя отражается на уровне и структуре процесса дыхания. Качественные перестройки дыхания при недостатке кислорода представляют собой компенсаторные изменения в обмене веществ, выражающиеся в трансформации дыхательных путей, которые остаются недостаточно изученными, особенно для фотосинтезирующих органов растения [1].
В растениях кукурузы, помещенных в эксикатор с воздухом, активность фумаразы на протяжении всего эксперимента была наиболее стабильна. К 3 ч. экспозиции она составила 15,54 Е/гр.с.м. По прошествии 6 активность данного фермента установилась на значении 16, 13 Е/гр.с.м., а к окончанию опыты составляла 16,1 Е/гр.с.м. Данные результаты говорят о том, что в целом активность фумаратгидротазы в зеленых листьях кукурузы, изолированных от действия света, в условиях атмосферного воздуха не меняется. С целью изучения действия стрессовых условий на активность фумаратгидратазы проводили исследования в различных газовых средах: среде азота и в среде углекислого газа.
Контролем являлась атмосферный воздух.
Результаты влияния гипоксии на функционирование фумаратгидротазы в листья кукурузы представлены на рисунке 1. Из графика видно, что в течение 24 часов эксперимента наблюдалось изменение активности исследуемого фермента.
Рис. Динамика активности фумаратгидратазы в листьях кукурузы в условиях различной газовой среды.
Установлено, что максимальное значение активности ФГ наблюдается при экспозиции растений в течение 3ч в атмосфере углекислого газа и составляет 26,3 Е/г.с.м., однако к 6 часам экспозиции данный показатель резко снизился до значения в 12,28 Е/г.с.м. Через 24ч инкубации в среде CO2 достигалось наименьшее значение скорости функционирования фумаразы и составляло 7,75 Е/г.с.м. Такая динамика активности фермента может быть связана с тем, что повышенное относительно нормального значения содержание углекислого газа в атмосфере оказывает сильное влияние на все процессы жизнедеятельности растительного организма.
Компенсаторные перестройки дыхательного метаболизма при недостатке кислорода в значительной степени отражают использование сформированных систем гликолиза и пентозофосфатного пути окисления глюкозы, поставляющих АТФ, достаточно большое количество промежуточных веществ для биосинтезов и биологических восстановителей.
Углекислый газ в избытке может влиять на синтез белковых молекул, рост организма, активировать или угнетать те или иные физиологические процессы [12]. Отмечено, что повышение содержания CO2 в окружающей атмосфере способно снижать дыхание растения, а так же изменяет проницаемость мембраны клеток и как следствие снижать поглощение воды. [6]. Это может объяснить тот факт, что к концу эксперимента у растений, находившихся в условиях повышенного содержания углекислого газа, снижался тургор. В ряде исследований показано, что при гипоксии с избытком углекислого газа обмен углеводов, аминокислот и липидов усиливался, что являлось результатом специфического действия диоксида углерода на процессы обмена веществ у растительных организмов [3].
Резкое повышение активности исследуемого фермента в начале эксперимента может быть объяснено действием диоксида углерода как специфического стрессового фактора, способствующего мобилизации всех обменных процессов, однако при более длительном воздействии потенциал организма иссякает. По-видимому, активация дыхательного метаболизма в клетках листа компенсирует дефицит НАДФН, АТФ и продуктов обмена и одновременно при непродолжительной гипоксии вызывает усиление фотосинтетической активности и стабилизацию первичных фотохимических реакций, локализованных в хлоропластах.
Ранее показана активация работы ферментов разных дыхательных путей: гликолиза (ПК), спиртового брожения (АДГ), пентозофосфатного цикла (Г-6-ФДГ) и фотосинтеза (ГАФДГ - НАДФН) в проростках ячменя в условиях гипоксии как в темноте, так и на свету. Перестройки дыхательного метаболизма на анаэробный путь обмена в гетеротрофных и автотрофных тканях растения, кооперация процессов дыхания и фотосинтеза позволяют поддерживать энергетический баланс клетки, ведут к образованию необходимого количества восстановителей и промежуточных соединений, необходимых для различных биосинтезов, что обеспечивает наряду с другими защитными реакциями устойчивость растений к гипоксии [1].
В атмосфере азота наблюдался иной характер зависимости активности фумаразы от времени инкубации растений. В течение первых шести часов экспозиции активность исследуемого фермента изменялась незначительно. И составляла от 13,7 Е/г.с.м. до значения 15,3 Е/г.с.м. Однако, к 24ч эксперимента скорость функционирования фумаратгидротазы снизилась практически в двое и составила 8,67 Е/гр.с.м.. При этом, данное значение было выше, чем данный показатель в атмосфере углекислого газа.
Как известно, одним из возможных поставщиков АТФ является дыхательный метаболизм, неотъемлемая часть которого электрон транспортная цепь, для которой в аэробных условиях конечным акцептором электронов является кислород. В том случае, когда доступ к кислороду затруднен, синтез энергетических эквивалентов происходит преимущественно в реакциях спиртового и молочнокислого брожения, однако данная стратегия способна обеспечивать организм энергией весьма недолговременно. Но в настоящее время рассматривают другой механизм, помогающий выживать растениям в условиях гипоксии - это использование NO в качестве промежуточного акцептора электронов, способствующего окислению NADH, которое достигается в реакции образования NO и его последующее окисление обратно в нитраты [23].
Сукцинат важный метаболит, который выделяется при гипоксии. Было отмечено, что он накапливаться в всходах рассады и в клетках водорослей (Vanlerberghe и др, 1989; 1990;. Vanlerberghe & Turpin, 1990) , подвергнутых дефициту O2, в результате частичной операции цикла трикарбоновых кислот в обратном направлении.
Полученные нами данных согласуются с данной теорией, поскольку накопление сукцината может является следствием низкой активности сукцинатдегидрогеназы, окисляющей последний до фумаровой кислоты. При этом недостаток субстрата для фумаразы, проявляется в снижении ее активности по истечении 6 часов инкубации.
10. Arabidopsis has a cytosolic fumarase required for the massive allocation of photosynthate into fumaric acid and for rapid plant growth on high nitrogen / I. Pracharoenwattana [et al.] // Plant J. -- 2010. -- V. 62. -- P. 785-795.
11. Bailey-Serres J. Flooding stress: acclimations and genetic diversity/J. Bailey-Serres, L.A. Voesenek//Annual Review of Plant Biology.-2008.-V.59.-P.313-339.
12. Bown A.W. The influence of carbon dioxide on protein synthesis in ethiolated coleoptiles of Avena sativa / A.W. Bown, W.W. Lampmann // Canad. J. Bot. - 1972. - V. 50.- N.9. - Р. 1937-1942.
13. Chomczynski P. Singlestep-method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. - 1987. - V. 162. - P. 156-159.
14. C
Регуляция экспрессии генов фумаратгидратазы в зеленых листьях кукурузы в условиях гипоксии курсовая работа. Биология и естествознание.
Курсовая работа по теме Разработка системы менеджмента качества для внешнего пользования в контрактных ситуациях на основе требований стандарта ГОСТ Р ИСО 9001-2001
Реферат: Indian History
Курсовая работа: Роль коллективного договора в защите социально-экономических прав и интересов работников. Скачать бесплатно и без регистрации
Финансовый Менеджмент Темы Курсовых Работ
Курсовая работа: Характеристика видов деятельности в сфере туризма
Реферат: Холодная штамповка 2
Курсовая работа по теме Привод ленточного транспортера, состоящего из электродвигателя, цилиндрического двухступенчатого редуктора и соединительных муфт
Цицерон О Возникновении Государства И Права Эссе
Реферат: Лабораторный практикум по бухгалтерскому учету 2
Реферат по теме Виды составов преступлений: основной, квалифицированный и особо квалифицированный
Практическое задание по теме Тактика следственного эксперимента
Курсовая работа: Проектирование антенны. Скачать бесплатно и без регистрации
Контрольная работа по теме Организация радиорелейной связи
Реферат: Саркоптоз свиней (Комплекс лікувально – профілактичних заходів при саркоптозі свиней в ТзОВ Надія Хотинського району Чернівецької області)
Сочинение Егэ По Русскому 2022 Образец
Перевод Долга Реферат
Моя Родина Азербайджан Сочинение
Реферат: Детектор лжи. Скачать бесплатно и без регистрации
Контрольная работа по теме Пневматический транспорт измельченной древесины
Денежная Реформа Канкрина Реферат
Адсорбция ионных и неионных поверхностно-активных веществ (ПАВ) - Биология и естествознание контрольная работа
Организменная среда обитания - Биология и естествознание презентация
Изменения строения вегетативных органов в связи с симбиозом и паразитизмом - Биология и естествознание курсовая работа