Изобретение относится к области биохимии. Реагент обладает стабильностью при хранении как в водной суспензии, так и в лиофилизованном состоянии. Интенсивность биолюминесценции, возникающей в люциферинлюциферазной системе светляков в присутствии АТФ, пропорциональна концентрации АТФ в широком диапазоне его концентраций, поэтому эта система широко используется в аналитических целях для определения АТФ. Анализ АТФ необходим в медицинской диагностике, в контроле загрязнений окружающей среды. На его основе разработаны методы 'быстрой микробиологии', например, определение микробной зараженности биологических жидкостей, смывов с технологического оборудования и других по количеству микробного АТФ \\\\\\\\\[1\\\\\\\\\]. В качестве полисахаридного носителя используют сефарозу, ультрадекс, ультрагель, активированные бромцианом, или целлюлозную пленку. Предел обнаружения АТФ с использованием реагента с приведенной композицией составляет 10 М. Недостатками прототипа являются наличие высокого фонового сигнала биолюминесценции, наблюдаемой до добавления АТФ к реагенту , что снижает чувствительность анализа, и недостаточно высокая стабильность реагента при комнатной температуре, что создает неудобства при работе: необходимо специальное охлаждение и периодическая проверка калибровочного графика концентрации АТФ - интенсивность свечения. Целью предлагаемого изобретения является снижение фонового сигнала, повышение чувствительности анализа и повышение стабильности реагента для определения АТФ, особенно при комнатной температуре. Клонирование гена люциферазы светляков, получение плазмид, содержащих ген люцифераз светляков, и штаммов клеток Е. Для приготовления реагента наращивают биомассу клеток Е. Клетки разрушают известным способом и получают лизат клеток Е. Осаждение сульфатом аммония проводят в две стадии; на первой стадии к лизату клеток Е. В случае прототипа иммобилизацию люциферазы проводят из экстракта светляков. Фоновый сигнал реагента обусловлен примесями АТФ, адсорбированными на носителе из экстракта светляков или лизата клеток Е. Поскольку для иммобилизации рекомбинантных люцифераз используют лизат, предварительно очищенный и сконцентрированный путем осаждения сульфатом аммония, концентрация АТФ в растворе для иммобилизации значительно ниже, чем при использовании экстракта светляков, что и приводит к значительному снижению фонового свечения. Фоновый сигнал у предлагаемого реагента оказывается в раз ниже, чем у прототипа непосредственно после приготовления, а через час после приготовления практически равен 0. Увеличение удельной активности позволяет проводить анализ АТФ с меньшим количеством реагента, что приводит к экономии дорогостоящего препарата. Повышение стабильности реагента осуществляется за счет добавления дополнительного стабилизатора - смеси бычьего сывороточного альбумина и трегалозы. Период полуинактивации заявляемого реагента при 4 o C составляет суток прототип - суток в водной суспензии и суток в лиофилизованном состоянии. При комнатной температуре предлагаемый реагент может храниться без потери активности в течение 10 суток. Реагент получают добавлением к концентрированной суспензии иммобилизованной люциферазы в трис- оксиметил -аминометанацетатном буфере растворов люциферина, сульфата магния, ЭДТА, дитиотреитола в том же буфере, и сухого бычьего сывороточного альбумина и трегалозы по навеске. Пример 1. Приготовление рекомбинантной люциферазы, иммобилизованной на полисахаридном носителе а. Люциферазу получают из клеток Е. Осадок отбрасывают. Осадок, содержащий люциферазу светляков, растворяют в 10 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, pH 7,8, содержащего 2 мМ этилендиаминтетраацетата натрия, 0,1 М NaCl, и используют для иммобилизации. Иммобилизацию проводят на полисахаридном носителе по известной методике \\\\\\\\\[4\\\\\\\\\]. В этом случае люцифераза, синтезируемая клетками Е. В этом случае структура люциферазы, синтезируемой клетками Е. Пример 2. Приготовление реагента для определения АТФ на основе рекомбинантной люциферазы, иммобилизованной на полисахаридном носителе а. В полученную суспензию добавляют 5 мг бычьего сывороточного альбумина и мг трегалозы. Получают реагент при следующем соотношении компонентов, мас. В полученную суспензию добавляют 10 мг бычьего сывороточного альбумина и 1 г трегалозы. В полученную суспензию добавляют 20 мг бычьего сывороточного альбумина и 2 г трегалозы. Методика определения АТФ 1,0 мл реагента, полученного, как описано в примерах 1 и 2, вводят в цилиндрическую кювету объемом 3 мл и диаметром 1 см. Кювету помещают в кюветное отделение люминометра и регистрируют фоновый сигнал. Затем вводят 10 мкл раствора АТФ с известной концентрацией, не прерывая регистрации интенсивности свечения. Разность между величиной сигнала интенсивности биолюминесценции в присутствии и в отсутствие АТФ является величиной, пропорциональной концентрации АТФ. Процедуру повторяют для растворов АТФ в том же диапазоне концентраций, в котором предполагается проводить измерения. Результаты измерений с использованием реагента, полученного по примеру 2в, показаны в табл. Прямая пропорциональная зависимость биолюминесценции от концентрации АТФ наблюдается в диапазоне концентраций АТФ от 10 до 10 -5 М. При работе с концентрациями АТФ от 10 М до 10 -5 М предпочтительнее использовать реагент, описанный в примере 2а или 2б, с концентрациями АТФ от 10 М до 10 М - реагент, описанный в примере 2в. Концентрацию АТФ в неизвестном образце определяют по интенсивности биолюминесценции, возникающей при добавлении 10 мкл раствора АТФ неизвестной концентрации к 1 мл реагента, используя калибровочный график, описанный выше. Предел обнаружения АТФ с использованием указанного реагента составляет 10 М. Пример 4. Испытания активности реагента Результаты испытания измерения активности реагента и фонового сигнала в отсутствии АТФ приведены в табл. Удельная активность предлагаемого реагента по крайней мере в раз выше, чем у прототипа, а фоновый сигнал практически отсутствует. Пример 5. Испытание стабильности реагента В табл. Для сравнения приведены аналогичные показатели для реагента-прототипа. Эти данные показывают, что стабильность предлагаемого реагента как в водной суспензии, так и в лиофилизованном состоянии по крайней мере в два раза превышает стабильность реагента-прототипа. Литература 1. Угарова, Л. Бровко, Г. Бровко, Е. Беляева, И. Кутузова, Е. Дементьева, Т. Болдвин, Н. Березин, Н. Lundovskikh, Е. Dementieva, N. Реагент по п. RUC2 ru. Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования 'Сибирский федеральный университет'. Кутузова Г. Болдвин Т. JPB2 ja. EPB1 en. Bioluminescence reagent and method for quantitative determination of adenosine phosphate ester using the reagent. Eldred et al. Transfer of amino acid from a transfer ribonucleic acid synthetase-aminoacyl adenylate complex to transfer ribonucleic acid. Luo et al. Avidin-biotin coupling as a general method for preparing enzyme-based fiber-optic sensors. USA en. USB1 en. Kobayashi et al. NZA en. Atp-adp chemiluminescent testing for microorganisms including a source of a magnesium ion. Cattaneo et al. Monitoring glutamine in animal cell cultures using a chemiluminescence fiber optic biosensor. Yamamoto et al. Identification of a temperature-sensitive asparaginyl-transfer ribonucleic acid synthetase mutant of Escherichia coli. JPHA ja. USA1 en. SUA1 ru. Green et al. Rapid assays based on immobilized bioluminescent enzymes and photographic detection of light-emission. Determination of trehalose by flow injection analysis using immobilized trehalase. Funabashi et al. Porter et al. Polarographic determination of dipicolinic acid in the presence of bacterial spores and vegetative cells.

Реагент в Дмитре

Купить наркотики Бодрум

RU2164241C2 - Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата - Google Patents

Троицк купить закладку Euro HQ Hash ЧЕРНЫЙ

Реагент в Дмитре

Реагент в Дмитре

Вы точно человек?

RU2164241C2 - Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата - Google Patents

RU2164241C2 - Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата - Google Patents

Вы точно человек?

RU2164241C2 - Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата - Google Patents

Report Page