Проведение экспериментов по инсерционному мутагенезу на практических занятиях - Биология и естествознание контрольная работа

Главная

Биология и естествознание
Проведение экспериментов по инсерционному мутагенезу на практических занятиях

Выявление трансформантов среди растений Т2 поколения. Выявление инсерционных мутантов, имеющих фенотипические изменения. Идентификация трансгенной природы трансформированных растений Arabidopsis thaliana. Использование метода полимеразной цепной реакции.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Проведение экспериментов по инсерционному мутагенезу на практических занятиях
1. Трансформация Arabidopsis thaliana с помощью векторов на основе Ti- плазмиды Agrobacterium tumefaciens
2. Выявление трансформантов среди растений Т2 поколения
3. Выявление инсерционных мутантов, имеющих фенотипические изменения
4. Использование ПЦР-анализа для идентификации трансгенной природы трансформированных растений A. thaliana
1. Трансформация Arabidopsis thaliana с помощью векторов на основе Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens
Исходный растительный материал. В экспериментах по трансформации используются семена или растения расы Dijon или Kцln. Для трансформации семян необходимы свежие семена с 95-100% всхожестью. Обычно в эксперименте используют 4-5 тыс. семян, что составляет навеску в 80-100 мг (1000 семян A. thaliana весит 20 мг). В случае применения методов, вызывающих появление микротрещин в семенах с целью повышения эффективности трансформации (обработка ультразвуком, серной кислотой или хромпиком), необходимо увеличить выборку семян пропорционально неизбежной потере всхожести (ее определяют экспериментально до проведения эксперимента).
Для трансформации методом инокуляции in planta (Chang et al., 1994; Katavic et al., 1994) к началу практических занятий необходимо вырастить заранее 3-4-х недельные растения расы Dijon в почве.
Условия выращивания растений. Для посева трансформированных семян готовят ящики или кюветы со стерильной смесью 2 частей просеянной через сито почвы и 1 части песка. Общий размер посевной площади определяю исходя из выборки семян и плотности посева - 1 растение на 1 см 2 .
Растения для трансформации методом инокуляции выращиваются в маленьких горшках диаметром 6-8 см по 4-5 растений на горшок. При проведении практикума в зимний период можно выращивать растения в установках с лампами дневного света при интенсивности освещения 3-5 тыс. люкс и 16-часовом фотопериоде. Оптимальной для выращивания A.thaliana является температура 21-24 °С. В весенний и осенний период растения выращивают в условиях теплицы.
Агробактериальные культуры и векторы для проведения трансформации. Для получения инсерционных мутантов семена или растения A. thaliana трансформируют почвенной агробактерией A. tumefaciens, содержащей векторные плазмиды. В работе на практикуме используются два штамма агробактерий - штамм LBA4404 и штамм GV3101, содержащие бинарные векторы двух типов (табл. 2):
1) бинарные векторы на основе плазмиды pBI121 (см. Гапеева и др., 1995), схема получения которых представлена на рис. 1, содержат в Т-области маркерные гены nptII и uidA (табл. 1).
Рисунок 1. Схема конструирования бинарных векторов pLD3 и pLD4.
Ген nptII находится под контролем промотора гена нопалинсинтазы, а ген uidA - под контролем промотора CaMV35S (Дрейпер и др., 1991). Оба гена экспрессируются в растениях и служат удобными маркерами для отбора трансформантов. Об активности гена nptII судят по появлению у растений устойчивости к канамицину, вызывающему обесцвечивание и гибель нетрансформированных растений. Активность гена uidA оценивают по способности b-глюкуронидазы катализировать расщепление b-глюкуронидов (см. дальше). Поскольку ген nptII экспрессируется и в клетках A. tumefaciens, канамицин добавляют также в среду для культивирования агробактерий. В Т-области плазмид pLD3 и pLD4 содержатся также гены cat (ген устойчивости к хлорамфениколу) и tet (ген устойчивости к тетрациклину), которые экспрессируются в клетках E. coli, что существенно облегчает последующую процедуру клонирования мутантных генов. На рис. 1 представлена схема конструирования этих векторов. При использовании векторов pLD3 и pLD4 в агробактериальную среду добавляют хлорамфеникол и тетрациклин, соответственно. В качестве вирулентной плазмиды - помощника используют плазмиду pAL4404. Агробактериальный штамм LBA4404, содержащий эту плазмиду, имеет хромосомный ген устойчивости к рифампицину (Rif), поэтому рифампицин также включают в состав среды роста в качестве селективного агента.
2) бинарный вектор pPCVRN4 (Koncz et al., 1994) содержит в области Т-ДНК ген bla устойчивости бактериальных клеток к карбенициллину и ампициллину и ген hpt, который экспрессируется в растениях и служит маркером для отбора трансформированных растений (табл.2). Главной особенностью вектора pPCVRN4 является присутствие в Т-ДНК четырех копий энхансерного домена (в районе от -90 до -440) промотора 35S РНК CAMV (p35S-4nCAMV). Встраивание такого вектора в промоторные участки растительных генов может активировать их экспрессию и приводить к появлению доминантных мутаций уже в Т2 или даже в Т1 поколении (Koncz et al., 1994). Ген nptII в данной бинарной системе располагается в вирулентной плазмиде - помощнике pMP90RK. По признаку канамицин - устойчивости можно судить о наличии в агробактериальном штамме GV3101 плазмиды pMP90RK. Данный штамм, также как и штамм LBA4404, содержит в хромосоме ген устойчивости к рифампицину.
До проведения опытов необходимо убедиться в стабильности векторов и проверить способность штаммов расти на соответствующих селективных средах. Для этого клетки агробактерий штамма LBA4404, содержащего одну из бинарных плазмид pBI121, pLD3, pLD4, или штамма GV3101 с бинарным вектором pPCVRN4 высевают на агаризованную среду TY или YEB (для штамма GV3101 среда YEB более предпочтительна) без антибиотиков и с антибиотиками для проверки генотипа вектора и получения отдельных колоний. Если хранящиеся в глицерине при -70°С культуры агробактерии не проявят устойчивости по всем маркерам, следует проверить свойства векторов: выделить ДНК и проанализировать рестрикционные карты плазмид.
Состав питательных сред для культивирования растений и агробактерий. Для асептического выращивания A. thaliana может быть использована среда Квитко. Лучше заранее приготовить маточные растворы указанной концентрации, хранить которые следует в холодильнике. На их основе приготовить среду, которую затем следует автоклавировать 30 мин. при 0.7 атмосфер.
FeSO4 (закисное) добавляют в среду перед автоклавированием.
Для метода трансформации семян используют жидкую среду Квитко, в которую добавляют сахарозу (2%) и витамины по Гамборгу.
Таблица 2. Для культивирования агробактерий используют Среды TY и YEB:
Содержание антибиотиков в среде TY:
Содержание антибиотиков в среде YEB :
После автоклавирования добавляют 2 мл/л 1М р-ра MgCl2
растение мутант инсерционный трансформант
В настоящее время в исследованиях по инсерционному мутагенезу, для клонирования геномных последовательностей ДНК, прямого секвенирования ДНК и др. успешно используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот более быстрый, удобный и эффективный метод позволяет установить наличие интегрированной в растительный геном инсерции, а также определять число копий этой инсерции.
Предложенный в 1983 г. Карри Мулисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии 1993 г., метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) - явился важнейшим открытием нашего века в области молекулярной биологии. Метод ПЦР, или специфической амплификации ДНК, позволяет избирательно синтезировать in vitro относительно небольшие участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые пробы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК, так как реакция осуществляется путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезированными праймерами - олигонуклеотидными последовательностями ДНК длиной обычно до 30 п.н., комплементарными 3-концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул. Для проведения специфической амплификации не требуется больших количеств матричной ДНК и, в принципе, достаточно даже одной молекулы для запуска реакции.
На первом этапе ПЦР двухнитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее нагревания в течение нескольких минут до температуры 95-98 °С. Дальнейшая схема проведения ПЦР заключается в чередовании циклов:
2 - синтез последовательности, комплементарной матричной ДНК;
3 - денатурация образовавшихся двухнитевых структур.
При гибридизации, достигаемой за счет понижения температуры реакционной смеси до 30-50 °С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго специфичных областях, комплементарных праймерам. При температуре, оптимальной для работы Taq-полимеразы (60-70 °С), начинается синтез в направлении 5ў-3ў с двухнитевого участка, образованного праймерами. Затем при нагревании реакционной смеси до 80-90 °С синтез прекращается и двухнитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК денатурируется. В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а в последующих циклах - и с вновь синтезированными молекулами ДНК по мере их накопления в реакционной смеси (рис. 5).
Таким образом, при каждом цикле происходит двухкратное увеличение числа копий амплифицируемого участка ДНК, и содержание продуктов амплификации в растворе нарастает в геометрической прогрессии. За 25-30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов. ПЦР проводят обычно в автоматическом режиме, используя для этого специальный прибор - термоциклер или амплификатор ДНК. Этот прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные параметры времени и температуры для каждой конкретной реакции. Выбор оптимального режима реакции определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка ДНК (для каждой полимеразной реакции) в зависимости от типа праймеров, длины фрагмента, особенностей его первичной структуры, а также от типа используемой Taq-полимеразы. Оптимальные режимы реакции существенно варьируют и подбираются экспериментально.
В течение последних нескольких лет ПЦР успешно используется в исследованиях по инсерционному мутагенезу, для клонирования геномных последовательностей ДНК, прямого секвенирования ДНК и др. Одним из применений метода ПЦР является тестирование растений, получаемых в ходе проведения тем или иным способом трансформации.
Этот метод позволяет установить наличие интегрированной в растительный геном инсерции, а некоторые его модификации дают возможность определять также и число копий этой инсерции.
Однако применение ПЦР для тестирования трансгенных растений связано с определенными трудностями. Одна из них состоит в том, что наиболее популярным методом трансформации растений является агробактериальная трансформация, а рядом авторов показано (Ревенкова и др., 1990), что эксплантаты растений после трансформации могут оставаться зараженными агробактериями в течение более чем двух месяцев. Даже при использовании метода агробактериальной трансформации прорастающих семян А. thaliana не исключено, что агробактерии продолжают существовать в межклетных пространствах растений Т1 и даже Т2- поколений. Понятно, что растения, зараженные агробактериями, могут давать ложные положительные сигналы при тестировании с помощью ПЦР.
Другая трудность состоит в том, что для проведения ПЦР нужно получать растительную геномную ДНК определенного качества, т.к. эффективность амплификации исследуемой ДНК непосредственно связана со степенью ее очистки. Поэтому неудачный метод выделения растительной ДНК, недостаточно высокое качество ферментов или термоциклера мотут свести на нет все усилия исследователя. Изложенный ниже подход позволяет проводить скрининг полученных после трансформации прорастающих семян A. thaliana агробактериальными векторами растений Т2 поколения, выращенных на среде с канамицином в качестве селекционного маркера.
Первая пара праймеров (GUS-1 , GUS-2) определяет синтез фрагмента длиной 608 п.н. uidA - гена и позволяет тестировать растения на присутствие в его геноме инсерции Т-области, в состав которой этот ген входит.
Вторая пара праймеров (NPTIII-1 , NPTIII-2) определяет синтез 399 п.н. гена nptIII из Streptococcus. Она вводится в реакцию для того, чтобы тестировать плазмидную ДНК агробактериального вектора, так как в состав Т-области этот ген не входит.
Таким образом, наличие обоих генов в образцах растительной ДНК указывает на то, что это - трансгенные растения, зараженные агробактериями, присутствие только одного растительного селективного маркера свидетельствует о том, что растение имеет трансгенные природу, но не заражено агробактериями.
Рисунок 6. Стратегия ПЦР анализа с помощью двух праймеров
Поскольку вышеупомянутые гены не обладают заметной гомологией, то возможно проведение двух ПЦР в одной реакционной смеси на одном образце ДНК и в одинаковых условиях. В этом случае исключаются ошибки, связанные с загрязнением одного из двух образцов или с разной температурой в лунках термоциклера. Кроме того, вдвое уменьшается потребление всех компонентов реакционной смеси, за исключением праймеров. Вышеизложенный подход, разработанный в Институте общей генетике им. Н.И. Вавилова РАН (лаб. профессора Тарасова В.А.), позволяет проводить скрининг растений A. thaliana Т2 поколения, полученных после трансформации прорастающих семян агробактериями, несущими бинарную систему pLD3 или pLD4 и определять возможное заражение их агробактериями.
Выделение геномной ДНК растения для ПЦР
1. 100-300 мкг свежей зеленой массы поместить в стерильную пробирку типа Eppendorf и быстро заморозить в жидком азоте.
2. Растереть растительную ткань в той же пробирке стеклянной палочкой до состояния мелкого порошка.
3. Добавить 400 мкл экстракционного буфера (0,5% SDS; 250 мM NaCl; 100 мM Трис-HCl pH 8,0; 25 мM ЭДТА) и интенсивно перемешать.
4. Центрифугировать при максимальной скорости на микроцентрифуге в течение 5 минут.
5. Перенести 300 мкл супернатанта в новую пробирку и добавить равный объем изопропанола, перемешать.
6. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
7. Центрифугировать на максимальных оборотах 5 минут.
8. Высушить осадок ДНК и ресуспендировать его в 50 мкл стерильной Н 2 О.
На одну ПЦР-реакцию требуется 1 мкл выделенной ДНК.
Перед началом любых расширенных опытов, при смене олигонуклеотидов, полимеразы, трифосфатов необходимо выполнить технический опыт по оптимизации условий, а именно:
1) протитровать по Mg буфер (имеются KCl-серия с диапазоном от 10 до 50 мМ Mg и (NH) 4 SO 4 -серия с диапазоном от 20 до 80 мМ Mg);
2) проверить на опыте рассчитанные теоретически температуру отжига олигонуклеотидов и время элонгации.
При выбранных условиях провести первую геномную амплификацию серии образцов, обязательно поставив контроли: положительный - реперная ДНК и отрицательный - без ДНК.
Матричная ДНК добавляется в реакционную смесь в концентрации не более 30 нг. Концентрация трифосфатов в реакции 2,5 мМ/1 мкл каждого.
Использовать 10хбуфер для ПЦР следующего состава: 100 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 500 мМ KCl; 10-50 мМ MgCl 2 ; 0,5% Tween 20.
1. Разлить в каждую реакционную пробирку по 24 мкл смеси указанного состава без матричной ДНК.
3. Наслоить на реакционную смесь вазелиновое масло и запустить реакцию.
4. Провести реакцию по следующей схеме:
5. Провести анализ проб в 1% агарозном геле.
1. Chang S.S., Park S.K., Kim B.C. et al. 1994. Stable genetic transformation of Arabidopsis thaliana by Agrobacterium inoculation in planta // The Plant J. 5, 4: 551- 558.
2. Desfeux C., Clough S.J., Bent A.F. 2000. Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method // Plant Physiol. 123: 895-904.
3. Ding S.W. 2000. RNAsilencing. // Curr.Opin Biotechnol. 11: 152-156.
4. Elmayan T., Balzergue S., Beon F., Bourdon V., Daubremet J., Guenet Y., Mourrain P., Palauqui J.C., Vernhettes S., Vialle T. et al. 1998. Arabidopsis mutant simpaired in cosuppression // Plant Cell. 10: 1447-1457.
5. Fagard M., Vaucheret H. 2000. (Trans)gene silencing in plants: how manu mechanisms? // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 51: 167-194.
6. Faugeron G. 2000. Diversity of homology-dependent gene silencing strategies in fungi // Curr Opin Microbiol. 3: 144-148.
7. Feldmann K.A. 1991. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: mutational spectrum // The Plant J. 1: 71-82.
8. Feldmann K.A., Marks M.D. 1987.Agrobacterium- mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana // Mol. Gen. Genet. 208: 1-9.
9. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. 391: 806-811.
10. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cell // Exp. Cell Res. 50: 151 - 158.
11. Hammond S., Bernstein E., Beach D., Hannon G. 2000. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells // Nature. 404 (6775): 293-6.
12. Hammond S.M., Bernstein E., Beach D., Hannon G.J. 2000. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells // Nature. 404. 293-296.
13. Hellens R.P., Edwards E.A., Leyland N.R. et al. 2000. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium - mediated plant transformation // Plant Mol Biol. 42: 819-832.
14. Jones A.L., Thomas C.L., Maule A.J. 1998. De novo methylation and cosupression induced by cytoplasmically replicating plant RNA virus // EMBO J. 17: 6385-6393.
15. Katavic V., Haughn G.W., Reed D. et al. 1994. In planta transformation of Arabidopsis thaliana // Mol. Gen. Genet. 245: 363-370.
16. Koncz C., Martini N., Szabados L., et al. 1994. Specialized vectors for gene tagging and expression studies// In: Plant Molecular Biology Manual. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Press. 2 : 1-22.
17. Koncz C., Nemeth K., Redei G.P., Schell J. 1992. T-DNA insertional mutagenesis in Arabidopsis // Plant Mol. Biol. 20: 963-976.
18. Krysan P.J., Young J.C., Sussman M.R. 1999. T-DNA as an Insertional Mutagen in Arabidopsis // Plant Cell. 11: 2283-2290.
19. Kubo H., Peeters A.J.M., Aarts M.J.M. et al. 1999. ANTHOCYANINLESS 2, a homeobox gene affecting anthocyanin distribution and root development in Arabidopsis // Plant Cell. 11: 1217-1226.
Сущность и содержание метода полимеразной цепной реакции, особенности его использования в реальном времени для диагностики различных, в том числе и вирусных, заболеваний. Актуальность и этапы разработки быстрых и эффективных диагностических тестов. статья [686,1 K], добавлен 26.07.2013
Рассмотрение сути метода полимеразной цепной реакции. Понятие амплификации как процесса увеличения числа копий дезоксирибонуклеиновой кислоты. Основные принципы подбора праймеров при создании тест-системы. Подготовка пробы биологического материала. курсовая работа [610,8 K], добавлен 14.11.2014
Метод полимеразной цепной реакции в реальном времени, его использование в диагностике мутаций в генах, приводящих к возникновению рака молочной железы и яичника. Действие генов-супрессоров на формирование опухолевого процесса. Наследственные формы рака. дипломная работа [306,1 K], добавлен 09.10.2013
Дефицит кислорода как стрессовый фактор для растений. Энергетическое состояние клетки в условиях гипоксии. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени. Динамика активности фумаратгидротазы в зеленых листья кукурузы в условиях гипоксии. курсовая работа [325,9 K], добавлен 09.08.2016
Определение понятий "засуха" и "засухоустойчивость". Рассмотрение реакции растений на засуху. Изучение типов растений по отношению к водному режиму: ксерофитов, гигрофитов и мезофитов. Описание механизма приспособления растений к условиям внешней среды. реферат [998,2 K], добавлен 07.05.2015
Фенотипические последствия гибридизации животных. Молекулярные методы определения видов. Молекулярно-генетические исследования видов рода Aquila. Разработка специфических праймеров для полимеразной цепной реакции. Особенности секвенирования по Сэнгеру. дипломная работа [3,7 M], добавлен 25.06.2017
Интерес к исследованию природы Иоганна Вольфганга Гете. Учение о метаморфозе растений. Утверждение о превращении одних органов растений в другие. Опубликование работы Гете "Опыт объяснения метаморфоза растений". Признание широких научных кругов. реферат [19,3 K], добавлен 03.02.2011
Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д. PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах. Рекомендуем скачать работу .

© 2000 — 2021



Проведение экспериментов по инсерционному мутагенезу на практических занятиях контрольная работа. Биология и естествознание.
Курсовая работа по теме Доказательства на досудебных стадиях
Реферат: Демократия и Монархия: Прошлое и настоящие.
Реферат На Тему Мировой Опыт Примененния Налога На Добавленную Стоимость
Автореферат На Тему Оптимізація Реконструктивної Хірургії Монокулярної Травматичної Катаракти У Дітей
Реферат: Маркетинг в интернете 2
Контрольные Работы 6 Класс Минаева
Реферат по теме Аналіз українського ринку побутових насосів
Реферат: Друковані та інтернет-видання
Реферат по теме Создание сайта "Дикие кошки"
Учебное пособие: Учебно-методическое пособие Минск Белмапо 2006
Реферат по теме Экономическое совершенствование Новгородской республики в XI-XV веках
Курсовая работа по теме Налоги в системе регулирования российской экономики
Реферат На Тему Невербальная Коммуникация
Реферат по теме Технологія продажу шкільно-письмових товарів та канцелярського приладдя
Контрольная работа: Место социологии в структуре современного знания. Скачать бесплатно и без регистрации
Курсовая работа: Особенности ценообразования при различных моделях рынка
Сочинение Сбор Урожая 3 Класс Перспектива
Социально-экономическое развитие Китая
Реферат: Необходимая оборона. Её значение
Сочинение По Картине Осень Левитана 4
Органоиды клетки и их функции - Биология и естествознание конспект урока
Управление безопасностью жизнедеятельности - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда лекция
Проект вагона МЧС для проведения аварийно-спасательных работ в метрополитене - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда курсовая работа