Проточная цитометрия
https://t.me/medach
Появление биологического оружия потребовало изобрести метод, с помощью которого можно было бы с большой долей вероятности определять, что оно было использовано. Так возник способ подсчета количества бактерий в воздухе, разработанный в 1934 году и базировавшийся на методе подсчета бактерий в капилляре с помощью фотоэлектрических эффектов. Прибор по подсчету количества микроорганизмов в воздухе состоял из камеры анализа, в которую под давлением подавался исследуемый воздух. В камере находился источник света (обыкновенная лампа), детектор и фотоумножитель. Количество бактерий определялось по рассеянию света.
Медицинские и научно-исследовательские потребности и военные разработки в области микробиологии определили, таким образом, появление прибора, названного затем проточным цитометром.
В 1954 году вышел прибор под названием Coulter Counter Model A, предназначенный для подсчета и разделения клеток крови. Через 14 лет Вольфганг Гёде в университете Мюнстера сконструировал аналогичный прибор, но уже использующий для изучения клеток эффект флуоресценции. С этого момента идет отсчет развития современной цитофлуориметрии. Само же название метода «проточная цитометрия» было предложено на конференции Американского инженерно-технического фонда в 1978 году.
Проточные цитометры делятся на 2 типа:
1. Собственно цитометры, позволяющие только анализировать различные клеточные популяции;
2. Цитометры-сортировщики, позволяющие отбирать из гетерогенных популяций интересующие клетки.
Однако с появлением магнитной сепарации практическая ценность проточной цитометрии-сортировки несколько снизилась. У проточной цитометрии есть 2 существенные особенности, делающие этот метод очень ценным для практической медицины:
— способность охарактеризовать изучаемую популяцию клеток по фенотипу, а при использовании ДНК-цитометрии — и по генотипу. Это особенно важно для выявления изменений, возникающих в процессе онкогенеза;
— большая производительность, а за счет этого — возможность обнаружить редкие явления и патологии.
Прибор для проточной цитометрии состоит из:
1. Пробирки с исследуемым образцом, который забирается специальной иглой;
2. Проточной ячейки — основной части прибора, где и происходит подсчет клеток и измерение их оптических свойств;
3. Слива.
Так как цитометрия изучает свойства отдельных клеток в растворе, то по проточной ячейке клетки должны проходить по одной. Это осуществляется за счет гидродинамического фокусирования. Принцип такого фокусирования заключается в подаче жидкости под бо́льшим давлением, чем у исследуемой суспензии. Два ламинарных потока не пересекаются, и подаваемая под большим давлением жидкость (проточная) фокусирует раствор клеток в центре ячейки. Если увеличивать давление проточной жидкости, то поток клеток будет сужаться, и точность измерения увеличится, однако при этом уменьшится производительность. Поэтому приходится находить компромисс между скоростью и точностью измерения.
Само измерение параметров клеток происходит при прохождении их через лазерный луч, расположенный в проточной ячейке. При этом часть света клеткой рассеивается, часть проходит сквозь нее без изменений, а часть может поглощаться и вызывать флуоресценцию.
Таким образом при цитометрии возможно изучение нескольких параметров клеток:
1. Анализ прямого светорассеяния (FS — forward scatter).
Детектор прямого светорассеяния регистрирует излучение, рассеянное в пределах малых углов, и располагается по ходу лазерного луча. Центральная часть детектора покрыта экранирующим веществом, поэтому нерассеянное излучение им не регистрируется. При прохождении клетки через лазерный луч происходит рассеяние света, что и регистрируется боковыми участками детектора. Чем больше клетка, тем бо́льшее малоугловое рассеяние она вызывает. Таким образом, анализ прямого светорассеяния позволяет измерять количество клеток и судить об их размерах.
2. Анализ бокового светорассеяния (SS side scatter).
Детектор бокового светорассеяния располагается под углом 90° к направлению лазерного пучка и регистрирует рассеяние под большими углами. Рассеяние в пределах больших углов возникает при многократном преломлении света от внутриклеточных структур клетки. Следовательно, анализ бокового светорассеяния позволяет оценить сложность внутриклеточного устройства клетки, ядерно-цитоплазматическое соотношение.
3. Анализ флуоресценции (Fl — fluorescence).
Измерение флуоресценции клеток позволяет судить не только о ее размерах и морфологии, но и о белковом составе, строении мембран. Стало быть, анализ флуоресценции позволяет различать клетки по выполняемой функции, стадии клеточного цикла. Может оцениваться и аутофлуоресценция клетки, но чаще используются красители, тропные к определенным структурам или молекулам клетки. Интенсивность флуоресценции позволяет судить о количестве молекул, связавшихся с красителем.
Говоря об использовании красителей, стоит упомянуть и моноклональные антитела. Они способны связываться со строго определенными структурами клетки и обеспечивают тропизм красителей. Наиболее часто для конъюгации с МА используют такие красители, как флуоресцеинизотиоцианат, фикоэритин и Алекса Флуор. Красители отличаются длиной волны и эмиссией (фотоэлектронная эмиссия — испускание электронов из вещества под действием падающего на него излучения). Проточная цитометрия открыла широкие возможности для своевременной диагностики гемобластозов и детекции опухолевых клеток, а также позволила оценивать иммунный статус, что делает ее чрезвычайно важным исследованием не только в научной работе, но и в клинической практике.
Источники: