Применение полимерных микросфер для изучения кровеносного русла органов - Химия дипломная работа

Главная

Химия
Применение полимерных микросфер для изучения кровеносного русла органов

Строение сосудов. Сканирующая электронная микроскопия. Методы окрашивания полимерных микросфер флуоресцентными красителями. Исследование свойств суспензии полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер с карбоксильными группами на поверхности частиц.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
1.2 Вещества, препятствующие росту новых сосудов
1.3 Современные методы исследования строения кровеносных сосудов
1.4 Флуоресцентная конфокальная микроскопия
1.5 Сканирующая электронная микроскопия
1.6.1 Полупроводниковые нанокристаллы или квантовые точки (КТ)
1.6.2 Получение биосовместимых водорастворимых полупроводниковых CdSe/ZnS КТ, покрытых полисилоксановой оболочкой
1.6.3 Свойства и преимущества применения полупроводниковых КТ в биологических целях
1.7 Методы окрашивания полимерных микросфер флуоресцентными красителями
1.8 Устойчивость суспензий полимерных микросфер как дисперсных систем
2.2 Получение полистирольных микросфер диаметром 6 мкм с карбоксильными группами на поверхности
2.3 Получение ПММА микросфер диаметром 0,4 мкм с карбоксильными группами на поверхности
2.4 Определение размера частиц в суспензии
2.5 Определение сухого остатка суспензии
2.6 Подбор флуоресцентного красителя
2.8 Определение агрегативной устойчивости микросфер
Глава 3. Результаты и их обсуждение
3.1 Исследование свойств суспензии полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер с карбоксильными группами на поверхности частиц
3.2 Окрашивание микросфер флуоресцентным красителем
3.4 Исследование препаратов методом конфокальной лазерной микроскопии. Создание трехмерной модели сосудов
4.2 Пожароопасные свойства горючих веществ и материалов и меры безопасности при работе с ними
4.3 Характеристика токсичных веществ и меры безопасности
4.4 Вопросы электробезопасности в соответствии с "Правилами устройства электроустановок" (ПУЭ)
4.5 Анализ потенциальных опасностей и вредностей при выполнении экспериментальных исследований
4.6 Санитарно-гигиенические условия в рабочем помещении
Глава 5. Экологическая безопасность
Расчет затрат на проведение эксперимента
6.1 Расчет затрат на сырье и материалы
6.2 Определение энергетических затрат на проведение исследования
6.3 Затраты на воду для технологических целей
6.4 Расчет затрат на стеклянную посуду
6.5 Расчет амортизации установок, приборов и оборудования
6.6 Расчет затрат на заработную плату
Проблема исследования васкуляризации тканей (степени развития в ней сосудистого и капиллярного русла) является очень актуальной.
После любого разрушительного воздействия на организм (ушиба, пореза, инсульта, ранения) необходимо восстановить кровоснабжение поврежденных тканей. В организме «запускается» естественный процесс формирования новых сосудов, называемый ангиогенезом. Во время ангиогенеза эндотелиальные клетки, из которых состоят внутренние стенки сосудов, начинают интенсивно размножаться, и образовавшиеся новые каппиляры прорастают в поврежденные ткани [1].
Исследование развития сосудов и капилляров используется для изучения восстановления термически-пораженных тканей (ожоги) [2], изучения восстановления кровоснабжения при инфарктах и ишемической болезни [3], диагностики заболевания сосудов при сахарном диабете [4] и многих других целей.
В последние десятилетия все большее и большее внимание уделяется проблемам лечения и ранней диагностики онкологических заболеваний. Рост опухолевых образований в организме человека напрямую связывают с прорастанием в ней сосудов. Для интенсивного размножения опухолевых клеток нужны кислород и питательные вещества. А значит, по мере развития раковая опухоль должна прорастать новыми кровеносными сосудами.
В 1971 году появилась статья американского хирурга Джуды Фолкмана, в которой впервые было высказано предположение, что рост опухолей, превышающих в диаметре несколько миллиметров, возможен только в случае формирования и прорастания в них мелких капилляров. В 1982 году американские ученые Ваупель, Калиновский и Окунев показали, что во всех злокачественных опухолях действительно идет интенсивное новообразование сосудов. Верно и обратное - если образование новых сосудов прекращается, то дальнейший рост опухоли становится невозможен.
В настоящее время наиболее эффективным методом исследования развития сосудистого русла - это флуоресцентные методы, заключающиеся во введении в сосуды флуоресцентных меток, использовании флуоресцентной конфокальной микроскопии, построении трехмерной модели сосудов и капилляров, а так же математическом анализе и количественной оценке полученных результатов.
В литературе имеются сведения об использовании в качестве флуоресцентных меток флуоресцирующих белков [5], полупроводниковых нанокристаллов [6], цианиновых красителей [7].
Возможность использования в качестве флуоресцентных меток наночастиц или квантовых точек (КТ) обсуждается в литературе [8], тогда как доставка в опухоль традиционных органических флуорофоров уже давно широко используется в клинике и лежит в основе флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии рака. Наиболее предпочтительны для флуоресцентной визуализации флуорофоры, имеющие интенсивное поглощение, и флуоресценцию в красной и ближней инфракрасной области спектра. Поскольку биологические ткани являются наиболее прозрачными для данного диапазона, это открывает возможность визуализации глубоко-локализованных опухолей [9].
Определенное преимущество флуоресцентных КТ в качестве флуоресцентных меток - это очень интенсивная флуоресценция, их нерастворимость в органических растворителях и воде. Но сейчас их стоимость крайне высока и не ведется их открытая продажа.
Таким образом, у нас возникла необходимость разработки полимерных микросфер, окрашенных люминесцентным красителем. Микросферы должны обладать высокой интенсивностью флуоресценции, не должны прилипать к стенкам сосудов и не конъюгировать друг с другом. Размер микросфер был выбран исходя из того, что средний размер сосудов составляет 4-5 мкм. Для исследования строения только артериального русла использовались полистирольные микросферы диаметром 6 мкм. При заполнении сосудистого русла микросферами диаметром 6 мкм, предположительно, суспензией окажется заполнено только лишь артериальное русло, при этом капилляры окажутся незаполненными, так как размер микросфер больше диаметра капилляра.
Для исследования строения сосудов, вен и капилляров было предложено использовать микросферы диаметром 0,4 мкм. Это обусловлено тем, что средний диаметр капилляров составляет 0,2-0,6 мкм. И в то же время диаметр микросфер не должен был быть меньше 0,1 мкм, так как объекты диаметром 0,05-0,1 мкм захватываются сосудистой мембраной и затем уносятся за пределы сосудистого русла. Вследствие чего наблюдалось бы размытие контуров сосудов при исследовании образцов методом конфокальной микроскопии.
Цель работы: Создание полимерных микросфер, окрашенных люминесцентным красителем для исследования архитектоники сосудистого русла.
1. Отработать методику синтеза микросфер диаметром 0,4 и 6 мкм.
2. Отработать методику окрашивания полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер флуоресцентным красителем.
4. Отработать методику заполнения сосудистого русла суспензией полимерных микросфер, окрашенных флуоресцентным красителем.
5. Приготовить и просветлить тканевые препараты.
6. Исследовать полученные тканевые препараты методом конфокальной лазерной микроскопии.
полимерная микросфера сосуд микроскопия
Некоторые ткани организма, да и сами быстрорастущие опухолевые клетки, вырабатывают белковые молекулы, стимулирующие прорастание кровеносных капилляров. Такие молекулы называют факторами роста. Самый важный из них - фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС), более известный под английским названием «vascular endothelial growth factor (VEGF)», - выделил в 1989 году французский медик Наполеон Феррара. Сегодня специалистам известна структура гена, отвечающего за синтез этого вещества, а концентрация ФРЭС в опухоли служит одним из диагностических показателей скорости ее роста (злокачественности). За прошедшие с тех пор почти два десятка лет ученые открыли множество (около 20) сигнальных молекул, стимулирующих образование новых сосудов.
Молекулы факторов роста, в том числе и ФРЭС, связываются на поверхности эндотелиальных клеток, составляющих внутреннюю оболочку сосудов, со специальными белковыми структурами - рецепторами. Рецепторы образуются под влиянием веществ, которые вырабатывает злокачественная опухоль. На нормальных клетках эндотелия в здоровом организме таких рецепторов нет. Как только молекула ФРЭС связалась с рецептором, инициируется целый каскад биохимических событий: клетки эндотелия начинают интенсивно делиться и «запускают» синтез ферментов - металлопротеаз, которые расщепляют обволакивающий эндотелий внеклеточный матрикс и оболочку сосудов. В образовавшиеся «дырки» эндотелиальные клетки выходят наружу и мигрируют по направлению к опухоли.
Рис.1.1 Активированные ФРЭС эндотелиальные клетки производят специальные ферменты - металлопротеиназы, расщепляющие матрикс оболочки сосуда, «сделанный» из белков и полисахаридов. В результате эндотелиальные клетки получают возможность мигрировать и делиться.
Ферменты - металлопротеазы, расщепляющие белки, как бы «расплавляют» ткани перед прорастающими сосудами, помогая им продвигаться к цели. Как только кровеносный капилляр окончательно сформировался, активность протеаз падает и ткань вокруг нового сосуда снова «затвердевает». Особенность металлопротеаз состоит в том, что в их активном центре находится атом цинка. Этим опухолевые ферменты отличаются от большинства других природных ферментов, расщепляющих белки, например желудочного пепсина или трипсина поджелудочной железы. Таким образом, ФРЭС и другие факторы роста, взаимодействуя с рецепторами, стимулируют не только формирование, но и продвижение капилляров вглубь опухоли.
Факторы роста совершенно необходимы здоровому организму для восстановления кровотока при различных повреждениях, но их избыток может стать роковым для онкологического больного. Повышение синтеза ФРЭС стимулирует метастазирование опухолей - под воздействием этого вещества раковые клетки выходят в кровяное русло и распространяются по всему организму. С другой стороны, ФРЭС играет и положительную роль - прорастающие в опухоли сосуды формируют в ней своеобразный мягкий скелет, который удерживает клетки на месте, не давая им метастазировать.
При недостатке кислорода выработка ФРЭС и других факторов роста усиливается - ведь организму нужно компенсировать гипоксию увеличением кровотока. Отсюда можно сделать вывод об увеличении риска онкологических заболеваний при снижении концентрации кислорода в воздухе из-за уничтожения зеленых насаждений, загрязнения окружающей среды и т.д. Также доказано, что молекулы, вырабатывающиеся в организме человека при стрессе, одновременно стимулируют синтез ФРЭС. Этот факт наводит на мысли о пагубной роли нервного напряжения в возникновении раковых опухолей.
1.2 Вещества, препятствующие росту новых сосудов
Помимо молекул, способствующих прорастанию опухоли сосудами, в организме синтезируются и собственные факторы, препятствующие росту сосудов (ингибиторы). В здоровом организме существует баланс между активаторами и ингибиторами роста новых кровеносных сосудов. При многих серьезных заболеваниях организм как бы теряет контроль над поддержанием этого равновесия. Смещение равновесия в сторону избыточного формирования новых сосудов происходит при онкологических заболеваниях, диабете, ревматоидном артрите и т.д. При таких опасных недугах, как заболевания коронарных артерий, инсульт, напротив, скорость роста новых сосудов явно ниже нормы.
Рис.1.2 Процесс ангиогенеза начинается с разрушения сосудистой оболочки ферментами - протеазами, которые под действием молекул фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) вырабатывают активированные клетки эндотелия. После этого клетки могут делиться и мигрировать по направлению к опухоли.
Первым известным природным веществом, тормозящим рост новых сосудов, стал гликопротеин тромбоспондин, вырабатываемый различными клетками, в том числе и клетками стенок кровеносных сосудов. Тромбоспондин тормозит размножение эндотелиальных клеток, сдерживая таким путем рост капилляров.
Клиницистам-онкологам давно известно, что первичная опухоль сдерживает рост метастазов. Эффективное подавление или хирургическое удаление первичной опухоли ведет к бурному росту опухолей вторичных. Причина этого явления оставалась неизвестной, пока первооткрыватель роли ангиогенеза в опухолевом росте Фолкман не высказал предположение, что первичная опухоль выделяет какое-то вещество, сдерживающее прорастание сосудов в своих «детках», не давая метастазам расти. В 1994 году американец Майкл О'Рейли выделил из мочи мышей с привитой карциномой вещество, которое подавляло рост капилляров. Оно представляет собой фрагмент молекулы содержащегося в крови белка плазминогена. Соединение назвали «ангиостатином» (стабилизирующим сосуды). Оказалось, что при удалении первичной опухоли фактор, сдерживающий рост метастазов, исчезает. В результате вторичные опухоли начинают быстро прорастать новыми сосудами и развиваться. Механизм действия ангиостатина в настоящее время интенсивно изучается.
В 1997 году тот же О'Рейли при исследовании культуры клеток злокачественной опухоли гемангиоэндотелиомы выделил еще один мощный блокатор формирования кровеносных сосудов - эндостатин. Это вещество является частью молекулы коллагена. Эндостатин активирует программируемую гибель эндотелиальных клеток и, вероятно, тормозит процесс их активации, размножения и миграции.
Помимо тромбоспондина, ангиостатина и эндостатина в органах и тканях животных исследователи обнаружили множество веществ, которые подавляют рост капилляров. К таким веществам относятся некоторые гормоны, фрагменты гепарина и др. Из известных природных ингибиторов можно назвать интерфероны, которые, кстати, борются и с вирусами. Однако как названные вещества, так и многие другие свойственные организму продукты обмена веществ обладают многофункциональным действием и из-за побочных эффектов не могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов.
Рис.1.3 В настоящее время ученые проверяют возможность применения различных блокаторов ангиогенеза в лечении рака. Блокаторы (ангиостатики) подразделяются на разные категории в зависимости от механизма их действия.
Первыми противоопухолевыми средствами были природный алкалоид колхицин, выделенный из безвременника подснежного, меркаптопурин - производное пурина, одного из метаболитов нуклеиновых кислот, и эмбихин - полученный модификацией молекулы отравляющего газа иприта, которого в природе нет, и лучше бы и не было. При создании новых лекарственных препаратов ученые работают в трех направлениях: а) получение новых веществ на основе знания молекулярных процессов, в которые требуется вмешаться; б) создание аналогов природных веществ, уже зарекомендовавших себя в клинике; в) скрининг («просеивание через сито») множества веществ, которые просто завалялись на полке и вроде бы должны действовать. Примеры новых ангиостатиков хорошо иллюстрируют эту схему.
Рис.1.4 На фотографии показано, как природный ангиостатический препарат фумагиллин предотвращает развитие новых кровеносных сосудов на препарате ткани цыпленка (Б). А - контрольный образец
Первый класс веществ, которые сейчас испытываются в качестве противоопухолевых препаратов, - соединения, непосредственно блокирующие рост эндотелиальных клеток. К этой категории веществ относится уже упомянутый природный белок эндостатин. Его синтетический аналог комбрестатин А4 - химическая модификация соединения, содержащегося в древесине южноафриканского дерева Combretum caffrum, - проходит клинические испытания. Препарат также проявляет способность подавлять размножение клеток сосудов, стимулируя клеточный апоптоз. В настоящее время большое внимание уделяется созданию веществ, блокирующих размножение уже активированных клеток эндотелия. Из них наиболее удачным по активности и малой токсичности является синтетический препарат TNP-470, прошедший клинические испытания при раке почек, шейки матки и саркоме Капоши.
Рис.1.5 Продукт метаболизма грибковых микроорганизмов фумагиллин - один из наиболее сильных блокаторов роста сосудов. Его синтетический аналог TNP-470 стал первым ангиостатическим препаратом, прошедшим клинические испытания
Ко второй группе препаратов, тормозящих рост сосудов, относятся природные или синтетические вещества, так или иначе блокирующие передачу сигнала на рецепторы факторов роста. Как уже было сказано, ФРЭС взаимодействует с эндотелиальными клетками посредством специальных белковых структур - рецепторов. Клетки здорового организма к этим веществам - блокаторам рецепторов нечувствительны. На стадии клинических испытаний находится талидомид. Талидомид оказался эффективным при лечении больных миеломой, раком простаты и легких, саркомой и ганглиобластомой.
Рис.1.6 Классы блокаторов ангиогенеза
К третьей группе веществ, подавляющих прорастание сосудов, а, следовательно, и рост опухоли, относятся блокаторы (ингибиторы) активности опухолевых ферментов - металлопротеаз, которые разрушают внеклеточный матрикс и оболочку сосуда, давая клеткам эндотелия возможность мигрировать в сторону опухоли. Разработка препаратов такого типа действия - приномастата, маримастата и СOL-3 - находится на стадии клинических испытаний.
1.3 Современные методы исследования строения кровеносных сосудов
В настоящее время существует ряд методов исследования строения сосудов.
Наливка сосудистого русла смесью тушь-желатин
Это одна из первых методик исследования строения сосудистого русла. Методика заключается в следующем: сосуды промываются от крови, готовится раствор тушь-желатин и приготовленный теплый раствор вводится в сосудистую систему.
Приготовленные препараты изучаются с помощью светового микроскопа.
1. Возможно изучение только тонких препаратов или тонких оболочек (капсула почек, брыжейка).
2. Невозможно реконструировать 3-ехмерную модель.
3. Толстые препараты необходимо нарезать, что влечет потерю препарата.
Окраска сосудистого русла азотнокислым серебром (AgNO3)
Повторение методики заполнения сосудистого русла раствором тушь-желатин, только контрастным веществом является AgNO3.
1. Возможно изучение только тонких препаратов или тонких оболочек (капсула почек, брыжейка).
2. Невозможно реконструировать 3- мерную модель.
3. Толстые препараты необходимо нарезать, что влечет потерю препарата.
Растровая электронная микроскопия сосудистых слепков из пластмассы
Методика заключается во введении в отмытые от крови сосуды быстрополимеризующегося мономера, обычно метилметакрилата (ММА). После того, как мономер заполимеризовался в сосудах ткань вокруг полимера удаляют, подвергая препарат щелочному гидролизу (обработка щелочами NaOH или KOH). Полимерный слепок изучают на растровом электронном микроскопе.
Толстые образцы сложно приготовить для электронной микроскопии (на их поверхности происходит накопление зарядов, что приводит к появлению дефектов изображения).
Поэтому возникла идея разработки нового метода исследования строения сосудистого русла, которая позволила бы преодолеть многие из недостатков.
Разработанная нами методика состоит в том, чтобы
а) заполнить сосудистое русло микросферами, окрашенными флуоресцентным красителем;
б) использовать флуоресцентную конфокальную микроскопию для исследования строения сосудов.
По нашему мнению, метод лишен недостатков перечисленных выше и обладает некоторыми достоинствами:
- возможность реконструировать 3-ехмерную модель сосудистого русла;
- препарат остается целым после исследования.
1.4 Флуоресцентная конфокальная микроскопия
Конфокальная микроскопия и созданные на ее основе конфокальные лазерные сканирующие микроскопы (КЛСМ) - принципиально новое направление в световой микроскопии. С возникновением методов конфокальной сканирующей микроскопии появилась возможность путем послойного сканирования просматривать детали объемного препарата на некоторой его глубине, что не позволяет делать обычный, даже самый совершенный микроскоп из-за рассеяния и преломления света на оптически неоднородных фрагментах.
Конфокальный микроскоп дает две неоценимые возможности - исследование тканей на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности и демонстрации результатов исследования (т.е. клеточной активности) в четырех измерениях - высота, ширина, глубина и время. Для качества изображения и глубины исследования наиболее важную роль играет способность ткани к пропусканию света, иначе говоря, прозрачность ткани [10].
Большинство современных конфокальных микроскопов построено на базе люминесцентного (прямого или инвертированного) микроскопа. Следовательно, объекты исследований должны быть предварительно окрашены соответствующим люминесцентным красителем или обладать собственной люминесценцией. Иногда микроскоп имеет т.н. «детектор проходящего света», который позволяет наблюдать и неокрашенные объекты в режиме интерференционного контраста.
Способ конфокального сканирования трёхмерных микрообъектов был предложен ещё в 50-х годах прошлого столетия, но первые коммерческие 3D-микроскопы появились только к концу 80-х. В настоящее время наибольшее распространение получила лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (LSCM - Laser Scanning Confocal Microscopy). Объёмное изображение в LSCM получается при помощи регистрации флуоресценции в фокусе лазерного луча. Излучаемые фотоны фокусируются объективом на небольшом (~ 50 мкм) отверстии, которое ослабляет флуоресцентный сигнал от участков, находящихся не в фокусе (рис. 1.7).
Рис. 1.7 Оптическая схема конфокальной сканирующей системы [11].
Устройство современных LSCM - микроскопов намного сложнее и включает лазерные модули, несколько фотоумножителей (PMT), акустооптические туннельные фильтры (AOTF), светоделительные пластинки, сканерный модуль и многое другое.
Подобное усложнение обеспечивает широкий выбор спектральных линий когерентного освещения и возможность параллельной регистрации флуоресценции с различными длинами волн. Скорость сканирования зависит от разрешения и у микроскопа LCM 510 при разрешении 512х512 составляет примерно 1/5 секунды на слой [11]. При максимальном разрешении 2048х2048 сканирование каждого слоя занимает более секунды, и считывание объёмного изображения может продолжаться десятки минут.
Максимальная глубина сканирования при использовании объективов с минимальным увеличением и водной иммерсией достигает 3…4 мм, что вполне приемлемо для не слишком толстых образцов, но для сканирования крупных объектов с высоким разрешением необходима панорамная съёмка объёмных блоков с последующей компьютерной стыковкой нескольких десятков или сотен трёхмерных изображений. Даже при минимальном разрешении микроскопа продолжительность такого сканирования будет измеряться часами, что неприемлемо для большинства биологических объектов.
Значительно более высокая скорость сканирования характерна для SDCM (Spinning Disk Confocal Microscopy). [12] В микроскопах подобного типа используется вращающийся диск с тысячами отверстий. Его прототипом стало датируемое ещё 1884 годом изобретение германского учёного, обеспечивающее передачу изображений на расстояние. Принцип такой передачи показан на рис. 1.8.
Рис. 1.8 Принцип передачи изображения на расстоянии при помощи Nipkow-диска [12]
Современный аналог Nipkow-диска содержит 20 тысяч расположенных по спирали отверстий, причём лазерный луч фокусируется на них при помощи дополнительного диска с 20 тысячами микролинз. При вращении такого двойного диска объект сканируется сразу множеством (~1000) световых фокусов, обеспечивая считывание 360 кадров (плоскостей) в секунду [13] или даже 1 кадр за миллисекунду. [14] Схема этого устройства показана на рис. 1.9.
Рис. 1.9 Схема устройства дисковой системы CSU10 [15]
Каждый оптический фокус, образуемый парой микролинза-отверстие и объективом, при вращении диска перемещается по слегка искривлённой (дуговой) траектории. Линзы и отверстия расположены на диске по спирали, поэтому траектория каждого следующего фокуса немного смещена и вращение диска обеспечивает сканирование всей фокальной плоскости объекта. Регистрирующим устройством в такой системе служит камера с CCD-матрицей, на которой конфокальная оптика формирует изображение перемещающихся фокусов.
Дисковым сканирующим микроскопам присущи два основных недостатка. Первый связан с необходимостью точной синхронизации скорости вращения диска (1800 об./мин. у CSU10) и частоты считывания сигнала CCD. Без такой синхронизации на изображении появляются многочисленные полосы. В последней модели дисковой системы корпорации Yokogawa (CSU22) предусмотрена возможность варьирования скорости вращения диска, упрощающая настройку микроскопа. [16]
Вторая проблема заключается в недостаточной чувствительности обычных CCD при высоких скоростях сканирования и необходимости применения ICCD (Intensified CCD), имеющих встроенный фотоумножитель, или EMCCD (Electron Multiplying Charge-Coupled Device), способных работать в режиме счётчика фотонов. Это существенно повышает стоимость регистрирующей системы.
Общим недостатком сканирующих микроскопов типа LSCM и SDCM является заметная фоновая флуоресценция объектов, находящихся не в фокусе лазерного луча. Более контрастные объёмные изображения можно получить при помощи сканирующей двухфотонной или мультифотонной (MPE - MultiPhoton Exitation) микроскопии. Нелинейность зависимости MPE от интенсивности освещения обеспечивает максимальную флуоресценцию центральной части светового фокуса и повышает разрешающую способность микроскопов этого типа и контрастность изображения (рис. 1.10).
Рис. 1.10 Трёхмерные изображения поверхности гранул пыльцы [14]
а) мультифотонная сканирующая микроскопия;
б) обычная конфокальная сканирующая микроскопия.
Благодаря отсутствию внефокусной флуоресценции MPE-микроскопы могут работать без обычного для LSCM фильтрования света через микроотверстие. В мультифокусных системах сканирования (SDCM) при мультифотонном возбуждении флуорофоров диск с отверстиями тоже излишен. Достаточно одного диска с микролинзами
Современные 3D-микроскопы, как правило, способны работать и в обычном, и в MPE режимах. Кроме того, в них сохраняется возможность визуального наблюдения сканируемых объектов. Следствием является непомерная (для России) стоимость приборов данного типа.
Получаемые с помощью сканирующих микроскопов виртуальные трёхмерные изображения высокого разрешения позволяют заглянуть в микромир и по информативности несопоставимы с обычными двухмерными картинками.
На рисунке 1.12 показан конфокальный микроскоп Nikon
Рис.1.12 а) блок лазеров (аргоновый л=488 нм; геленеоновый л=596 нм); б) слева - система управления сканированием лазеров в микроскопе; в центре - блок питания ртутной лампы; справа (вверху) - блок питания лампы накаливания; справа (внизу) - блок детекторов; в) микроскоп.
1.5 Сканирующая электронная микроскопия
В последнее время сканирующие электронные микроскопы (СЭМ) заняли прочное место среди исследовательских приборов универсального применения. Исследователи, работающие на современных моделях СЭМ, отмечают такие качества этих приборов, как большую наглядность, легкую интерпретируемость изображений, высокую разрешающую способность, хорошую информативность сканирующей электронной микроскопии. К этому можно добавить относительную простоту приготовления образцов для СЭ микроскопии в сравнении с методами подготовки препаратов для просвечивающей электронной микроскопии.
В основу СЭМ положен принцип формирования изображений на экране электронно-лучевой трубки (ЭЛТ) с помощью развертки, синхронной с разверткой электронного луча, последовательно облучающего сканируемую поверхность изучаемого объекта. При этом яркость каждой точки экрана ЭЛТ соответствует интенсивности одного из вторичных излучений, возникающих при взаимодействии электронного луча с веществом объекта в определенной точке его поверхности.
Выбор вторичного излучения, несущего информацию о поверхности, производится путем подключения нужного детектора к входу видеоусилителя. Естественно, что для регистрации каждого вида вторичного излучения требуется свой детектор, чувствительность которого к данному излучению максимальна. Количество детекторов, имеющихся в СЭМ, зависит от класса прибора (чем выше класс, тем их больше).
Любой современный научный прибор, дающий информацию об объекте исследования в форме изображения, снабжается блоком фиксирования этой информации. Только в этом случае возможна объективная оценка и последующая обработка полученных данных. СЭМ в этом смысле весьма удобен, так как позволяет представить визуальную информацию в удобной для фотографирования форме.
Для получения высококачественных микрофотографий используют медленные развертки с числом строк не менее 2000 и вертикальной скоростью не менее 50 с на кадр, повышая, таким образом, плотность электронного облучения поверхности и улучшая отношение сигнал/шум.
С помощью СЭМ можно получать стереомикрофотографии (стереопары). Для этого делают 2 снимка с одного и того же участка образца, причем для второго снимка его наклоняют на 5-10° по отношению к первоначальному положению, сохраняя при этом центральную деталь поля зрения в центре экрана. Полученные фотоотпечатки монтируют на одном листе бумаги с соблюдением взаимного расположения правого и левого снимков и рассматривают в стереоскоп. Существуют специальные стереометрические устройства, позволяющие рассчитывать по стереопарам истинные расстояния между точками изображенной поверхности и восстанавливать взаимное расположение структур в пространстве.
Если биологический объект обладает низкой электропроводностью и (или) неплотно прилегает к поверхности держателя, то при сканировании электронным зондом объект будет заряжаться. Для достижения высокой степени разрешения приходится прибегать к специальным мерам обеспечения электропроводности. Главной мерой является покрытие объекта слоем металла.
Покрытие металлом предотвращает образование электрических зарядов на поверхности объекта, способствует отведению тепла, генерируемого взаимодействием электронов зонда с объектом (перегревание объекта в процессе СЭ микроскопии может вызвать смещение и повреждение объекта), способствует достижению более высокой разрешающей способности и механически стабилизирует поверхность объекта.
Для создания покрытия и
Применение полимерных микросфер для изучения кровеносного русла органов дипломная работа. Химия.
Курсовая Работа На Тему Исследование Рынка Кофе Nescafe Classic
Реферат: Соционика квадры. Скачать бесплатно и без регистрации
Контрольная Работа По Математике 1 Кл
Сочинение Мое Отношение К Митрофану
Водоотводящие Сети Курсовой Проект Методические Указания
Практическое задание по теме Технология написания клиентских приложений с использованием языка сценариев JavaScript
Контрольная работа: Задачи и обязанности финансовых служб предприятия
Варианты Контрольных Работ 9 Класс География
Дипломная Работа На Тему Разделение Смеси Бензол – Циклогексан – Этилбензол – Н-Пропилбензол Экстрактивной Ректификацией
Доклад по теме Получение серы и кислорода
Доклад по теме Знак
Дипломная работа по теме Апелляция в гражданском процессе
Реферат: Правовое регулирование пособий по безработице и пособий на погребение в Республике Беларусь
Реферат: по исполнению Государственного контракта от «21»
Реферат: Эвристические методы решения творческих задач
Историческое Сочинение На Тему Ярослав Мудрый
Контрольная работа по теме Основы решения эконометрических задач
Русская Церковь Реферат
Дипломная работа по теме Классификация прав потребителей и их защита
Стандарты Поведения В Публичной Сфере Великобритании Эссе
Острый катаральный гастрит у кошки - Медицина реферат
Алгоритмы решения задач - Программирование, компьютеры и кибернетика контрольная работа
Трудовий договір і контракт - Менеджмент и трудовые отношения курсовая работа