Применение электроспиннинга в нуждах тканевой инженерии - Медицина курсовая работа

Главная

Медицина
Применение электроспиннинга в нуждах тканевой инженерии

Схематичное изображение аппарата для электроспиннинга. Создание композитных матриц, состоящих из полимеров и белков натурального внеклеточного матрикса. Материалы, применяемые в тканевой инженерии: синтетические полимеры, белки, неорганические соединения.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ
НОВОСИБИРСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАВМАТОЛОГИИ И ОРТОПЕДИИ ИМ. Я.Л. ЦИВЬЯНА
Применение электроспиннинга в нуждах тканевой инженерии
Используя клетки, питательную среду и подложку-матрицу тканевая инженерия создает прототипы тканей живых организмов с целью получения продукта пригодного для выполнения функций живого органа.
По мере развития науки все более и более уменьшаются исследуемые и создаваемые ею объекты. Производство вышло на уровень нанотехнологий, современные микроскопы способны визуализировать микро- и нанообъекты.
Данная тенденция не обошла и современную медицину, а в частности и тканевую инженерию. Так, например, производство матриц для культивирования клеток сейчас идет по пути максимального копирования структуры внеклеточного матрикса живых тканей. Это подтверждают ученые из Чехии в своей работе посвященной изучению эффекта нанотопографии матриц на остеогенную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток. В заключении они приходят к выводу, что для создания качественной тканеинженерной конструкции лучше всего имитировать живую 3D нишу предшественников остеобластов внутри матрицы, чтобы воздействовать на клетки химическими и физическими стимулами схожими с натуральными[1]. Так же ряд ученых изучая ту же тему провели эксперимент с матрицами имеющими различный диаметр пор от 25 до 150 мкм. Культуры мезенхимальных стволовых клеток на матрицах с различным диаметром пор вели себя по-разному. Так на матрицах с меньшим диаметром пор были более выражены адгезия и остеогенная дифференцирвка, на матрицах с большим диаметром клетки активно инфильтрировали конструкцию и наблюдалась тенденция к ангиогенезу[2]. В дополнение можно отметить группу исследователей во главе с Rebecca L. Dahlin, которые в своей обзорной статье делают вывод о том, что клетки живых организмов активней всего взаимодействуют с рельефом, структуры которого сопоставимы с ними же по размерам[3].
Таким образом ученые натолкнулись на проблему создания матриц с поверхностью структурированной на микро- и наноуровне. Помимо этого к матрицам выдвигается еще ряд требований, обусловленных необходимостью выполнения функций замещаемых ими органов, а так же свойств позволяющих использовать их при имплантации в живой организм. К этим требованиям относятся механическая прочность, что бы, например, выполнять опорную функцию кости, высокая порозность, для обеспечения поступления питательных веществ, биореактивность, для взаимодействия с клетками, биодеградируемость, что бы иметь возможность замещения конструкции натуральными тканями.
Часть этих требований возможно выполнить путем правильного подбора материала для матрицы. На сегодняшний день изучено множество биодеградируемых материалов, используемых для создания матриц. Существует две основные группы полимеров: натуральные и синтетические. Синтетические полимеры, такие как, полилактид(Poly(L-lactic acid)(PLLA)), полигликолиевая кислота(poly(glycolic acid), PGA) и поликапролактон (Polycaprolactone, PCL), по сравнению с другими обеспечивают огромную гибкость синтеза, создания разнообразных конструкций и их модифицирования. Биоактивность этих полимеров очень мала, что позволяет устранить неблагоприятные воздействия на макроорганизм. Натуральные полимеры (коллаген, желатин, шелк, хитин, хитозан), с другой стороны, высоко биоактивны, что положительно влияет на адгезию, пролиферацию и дифференцировку клеток. Коллаген, желатин, шелк и хитозан широко используются в создании полимерных матриц, но возможность их применения ограничена в связи с относительно небольшой механической прочностью[4].
Задачу же структурирования матрицы на микро- и наноуровне можно решить лишь с помощью выбора метода ее создания. На данный момент предложено несколько способов создания матриц способных удовлетворить большинство из поставленных перед ними условий. К ним относятся элеткроспиннинг, стереолитография, 3D принтинг, метод фазовой сепарации, метод самосборки амфифильных белков и некоторые другие. Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки. Так, например, стереолитография обеспечивает возможность создания заданной структуры, но требует дорогостоящего оборудования и технически сложен. Набирающему популярность 3D принтингу не достает высокого разрешения производимых изделий. Методы фазовой сепарации и самосборки амфифильных белков относительно просты и не требуют дорогостоящего оборудования, но не всегда способны обеспечить необходимую исследователю микроархитектонику матриц.
В данной работе будет подробнее рассмотрен один из методов создания матриц для тканевой инженерии - электроспинниг. Поскольку, данный метод привлекает все больший интерес исследователей в связи со своей относительной технической простотой, возможностью использования практически любых полимеров при синтезе, возможностью получения достаточно больших пористых конструкций с диаметром фибрилл от нано- до микрометров. Будет освещена техническая сторона метода, а так же сделан упор на материалы, применяемые при данном методе, и эффекте конечного продукта на жизнедеятельность культур клеток.
Электроспиннинг впервые был применен в первом десятилетии ХХ века для нужд текстильной промышленности. И лишь намного позже ряд ученых показали, что многие биополимеры также возможно использовать для создания структур методом электроспиннига, что открыло новые горизонты тканевой инженерии. Устройство для элеткроспиннинга схематично изображено на рисунке 1.
Рис. 1. Схематичное изображение аппарата для элеткроспиннига.
Аппарат электроспиннинга состоит из иглы через которую подается раствор полимера. Из коллектора, куда собирается выпущенная из иглы струя полимера. Все составляющие аппарата - игла, струя, коллектор являются элементами одной электрической цепи. Сутью процесса электроспиннинга является преодоление напряжением электрического тока сил поверхностного натяжения раствора полимера на конце иглы. По мере роста напряжения на конце иглы сначала образуется конус Тейлора - конусообразная капля полимера. Как только напряжения достаточно с верхушки конуса в направлении коллектора устремляется струя полимера, диаметр которой зависит от множества условий. Находясь в воздухе часть растворителя испаряется и на коллекторе собирается более чистый полимер в виде хаотично или направленно уложенных фибрилл.
Одними из первых, кто применили электроспиннинг для создания структур из синтетичесгоко полимера были ученые Doshi J. И Reneker D.H.. В своей работе от 1993 года они изучали техническую сторону процесса электроспиннинга. Исходя из описания метода электроспиннинга, ученые сделали предположение, что следующие параметры влияют на процесс: свойства раствора - вязкость, элеткропроводность, поверхностное натяжение; и контролируемые переменные, такие как скорость подачи полимера, величина электрического напряжения, расстояние между иглой и коллектором, а так же условия окружающей среды - температура и влажность. По завершении эксперимента прогнозы ученых подтвердились. Так, например, оказалось, что при вязкости раствора менее 800 Па*с струя ломалась, а при более 4000 Па*с вообще не удавалось сформировать струю из-за большого поверхностного натяжения раствора. При этом при увеличении концентрации полимера в растворе, а следовательно и вязкости требовалось все большее электрическое напряжение для преодоления поверхностного напряжения и создания струи. Чем толще использовалась игла, тем большее расстояние могла преодолеть струя до коллектора. В заключении исследователи предложили области науки и промышленности, где данная технология могла бы использоваться. Среди них создание композитных материалов, полимерных полупроницаемых мембран, использование в нетканом производстве, производстве покрывающих раны покрытий и многое другое[6].
На начальных этапах использования элеткроспиннинга исследователи работали с отдельно взятыми синтетическими полимерами. В дальнейшем ученые начали создавать композитные матрицы, состоящие из полимеров и белков натурального внеклеточного матрикса. Такие матрицы, помимо нужных механических свойств, получили так же биореактивные свойства естественного клеточного окружения. По мере накопления знаний и опыта в этой сфере оказалось, что электроспинниг позволяет создавать множество разнообразных конфигураций клеточных матриц, пригодных для культивирования клеток различного происхождения, а следовательно пригодных и для создания множества видов искусственных тканей. Более того ученые выяснили, что изменяя основные параметры структуры матрицы, такие как диаметр фибрилл, порозность, направленность волокон можно влиять и на поведение клеток в культуре - на их адгезию, пролиферацию, дифференцировку и морфологию.
Ученым, занимающимся инженерией нервной ткани, методом электроспиннинга удалось создать 4 типа матриц из поли-L-лактида(PLLA): матрицы с диаметром фибрилл 150-500 нм с разнонаправленными и параллельными волокнами и матрицы с диаметром фибрилл 800-3000 нм так же с разнонаправленными и параллельными волокнами. Для электроспиннига 5% раствора PLLA использовались иглы 18G, для растворов с увеличенной концентрацией - 22G. Расстояние между иглой и коллектором составляло 10 см. Для создания параллельных волокон использовали мандрел вращающийся со скоростью 1000 об./мин. Для преодоления сил поверхностного натяжения раствора был выбран ток напряжением в 12кВ. При ведении на полученных матрицах нейральных стволовых клеток линии С17.2 выяснилось, что уже ко 2му дню в культуре клетки приобретают вытянутую биполярную морфологию. При этом элонгация клеток на матрицах всегда шла вдоль направления фибрилл, т.е. на матрицах с параллельным расположением волокон клетки вытягивались и выращивали отростки всегда параллельно волокну. На матрицах с хаотичным расположением фибрилл клетки удлинялись разнонаправлено. В дополнение было отмечено, что изменения морфологии клеток, их элонгация и появление отростков, наблюдалось лишь у 40 % при ведении культуры на матрице с диаметром фибрилл 0,8-3 мкм и в 80 % при ведении на матрице с волокнами в 150-500 нм. Поскольку наиважнейшим аспектом в регенерации нервной ткани является возможность роста отростков - аксона и дендритов, ученые сделали вывод, что для воссоздания нервный ткани необходимо использовать параллельные нановолокна, которые очень удобно создавать методом элетроспинннга[7].
На следующем этапе в создании матриц ученые к синтетическому 9% полимеру поли-L-лактиду-ко-поликапролактону(PLCL) добавили белок внеклеточного матрикса - коллаген I типа. Для элеткроспиннига использовали иглы диаметром 27G. Скорость подачи раствора составляла 1 мл/час, вольтаж электрического тока 15 кВ, расстояние от иглы до коллектора 12см. При ведении человеческих мезенхимальных стволовых клеток(hMSC) в нейрогенной среде на данных матрицах, в сравнении с матрицами из чистого PLCL, было отмечено несколько закономерностей. Во-первых, матрицы с добавлением коллагена оказались более гидрофильны - водный контактный угол 57±5 о , против матриц из чистого PLCL, где водный контактный угол составил 127±8 о , что делает их более комфортной средой для жизнедеятельности клеток, поскольку питательные вещества в организме растворены именно в воде межклеточной жидкости. Вдобавок существенно отличались и механические свойства полученных матриц. Так предел прочности на разрыв для матриц с добавлением коллагена в три раза превосходил таковой матриц из чистого PLCL(4,61±0,69 МРа против 1,42±0,40 МРа), что немало важно для периода нейрогенеза - необходимо обеспечить целостность конструкции во время мобилизации больного. Во-вторых, при использовании колорометрического метода была выявлена значительно большая пролиферация клеток находящихся на матрицах PLCL/ColI относительно культур развивающихся на чистом PLCL (индекс абсорбции 1300 против 900). А так же иммуноцитохимический анализ показал достоверно большее отложение нейрофиламента 200 и нестина - маркеров нервной ткани культурами, растущими на матрицах из PLCL/ColI. Морфология клеток в обоих случаях становилась нейроподобной - клетки увеличивались и принимали мультиполярную многоотростчатую форму[8].
Таким образом, добавление белка натурального внеклеточного матрикса к матрице не только усиливает ее механическую прочность, но и делает матрицу более эффективной для пролиферации и дифференцировки клеток.
Одним из перспективных направлений применения электроспиннинга является создание покрывающих раны конструкций, для терапии обширных кожных дефектов. Ведь на данный момент кожная аутопластика обрекает больного на множество запрограммированных операций, членовредительство донорских участков кожи и крайне длительное время восстановления.
Занимаясь данной проблемой группа ученых создала из полилактида-ко-гликолида (PLGA, молекулярный вес 70 кDa, лактид/гликолид= 75/25) три типа полимерных матриц различающихся по диаметру пор, порозности и степени гидрофильности. Первый тип матриц нес поры размером 21.0±4.8 мкм, имел порозность 68.2±3.7% и водный контактный угол 131.0±4.6. Второй тип имел следующие параметры (в порядке перечисленном выше) 59.5±16.3 мкм, 79.1±5.2%, 112.4±6.5. И третий 132.7±39.6 мкм, 92.4±4.3%, 76.1±8.5. Различные характеристики матриц получили путем изменения конфигурации приемного коллектора: в 1м случае - плоский неподвижный коллектор, во 2м - цилиндрический мандрел вращающийся со скоростью 28 об./ мин., в 3м - цилиндрический мандрел вращающийся со скоростью 60 об./ мин. Параметры электроспиннинга для создания данных матриц были следующими: игла диаметром 0,6 мм, скорость подачи раствора 0,5 мл/час, напряжение тока 20кВ. Анализ физических свойств матриц показал, что механическая прочность матриц снижается по мере роста их порозности. Для исследования биореактивных свойств матриц ученые использовали культуры человеческих дермальных фибробластов. Клеточное число увеличивалось на всех матрицах весь период наблюдения. Но характер распределения клеток по конструкции существенно различался. Так, для матриц первого типа с меньшим размером пор, меньшей порозностью и гидрофильностью миграция клеток внутрь конструкции не отмечалась вовсе. Клетки распределялись монослоем на поверхности матрицы. Данной явление исследователи объясняют тем, что диаметр пор такой матрицы(21.0±4.8) существенно меньше размера фибробласта(10-100мкм). Для сравнения клетки на матрицах третьего типа, с большим размером пор, большей порозностью и гидрофильностью отмечалась миграция клеток более чем на 100 мкм вглубь конструкций. Вдобавок исследование пролиферации культуры колорометрическим методом (MTS assay) уже после первых суток показало достоверно большую клеточную плотность на матрицах третьего типа по сравнению с конструкциями первого и второго типов. И разрыв в клеточных плотностях продолжал увеличиваться весь период наблюдения. В заключении проведенное иммуноцитохимическое исследование показало визуально большее отложение коллагена в матрицах третьего типа[9].
Команда ученых во главе с Kumbar S.G. занималась схожей темой. Учеными методом электроспиннинга были созданы матрицы из полилактида-ко-гликолида(PLGA, лактид/гликолид 50/50) с диаметром фибрилл от 150-225 нм до 3250-6000 нм и порозностью от 38 до 60%. Параметры электроспиннига для создания данных матриц следующие: скорость подачи раствора 2 мл/час, диаметр иглы 20G, расстояние от иглы до коллектора 20-40 см, вольтаж использовался из расчета 1 кВ на 1 см. Механические свойства всего ряда матриц оказались сопоставимы с механическими свойствами натуральной кожи. Человеческие дермальные фибробласты показали достоверно лучший рост на матрицах с диаметром волокон 350-1100 нм. Экспрессия гена коллагена III типа также оказались достоверно большими на матрицах с этим диаметром фибрилл[10].
На следующем этапе группа исследователей из Сингапура для создания тканеинженерного эквивалента кожи к 10% раствору синтетического полимера поликапролактона (PCL) добавила биореактивный белок - желатин. Из данного композитного раствора методом электроспинннига(с параметрами: вольтаж 10,5 кВ, игла 0,4 мм, расстояние до коллектора 15 см, скорость подачи растовра 0,7 мл/ч), были получены матрицы со средним диаметром фибрилл 470 ± 120 нм и порозностью 62-75%. Пористое строение матриц, по замыслу ученых, должно способствовать не только проникновению клеток вглубь конструкции, но и осуществлять эффективный гемостаз в ране. Для анализа биологических свойств матриц использовались человеческие дермальные фибробласты. Анализ количества клеток находящихся на конструкциях на протяжении эксперимента не выявил достоверных различий при ведении клеток на матрицах из PCL и PCL/ желатин. Но клетки находящиеся на PCL/желатин конструкциях мигрировали глубже внутрь матрицы, что может быть связано с большей гидрофильностью данного материала. Однако ученые подчеркивают, что полученной инфильтрации не достаточно для заключения о равномерном распределении клеток внутри матрицы[11].
Таким образом, на поведение клеток в культуре влияет не только качественный состав подложки, но и ее структура. Учеными предложено множество вариантов строения матриц. Но для дальнейшего развития тканевой инженерии необходимо определение оптимальных для клеточного роста параметров микроархитектоники получаемых конструкций.
Проблема стеноза и тромбирования сосудов все еще остается нерешенным вопросом современной медицины. Поскольку применяемые на данный момент методы лечения, в частности аутотрансплантация и протезирование, не дают долгосрочного приемлемого эффекта. Так, при использовании в качестве трансплантата большой подкожной вены бедра ее просвет сужается до 88% к 5 году после операции и до 50 к 10[12]. Наиболее часто используемый для протезирования сосудов полимер - политетрафторэтилен уменьшается в просвете до 60% уже после 5 лет после имплантации[13]. Таким образом, ученые нуждаются в новом подходе лечения патологии сосудов. Один из вариантов - тканевая инженерия.
Группа ученых, чтобы создать тканеинженерный сосуд провела занятный с точки зрения электроспиннинга эксперимент. С диаметром иглы 26G и вращением цилинидрического коллектора со скоростью 300-2000 об/мин, вольтажом в 13 кВ, расстоянием до коллектора в 20см и скоростью подачи раствора 0,6-1,5 мл/час исследователями были созданы двухслойные матрицы-трубки. Внутренний слой состоял из хаотично расположенных фибрилл поликапролактона (PCL, молекулярный вес 80kDa) диаметром 600±400 нанометров и пор со средним размером 15мкм. Наружний - из циркулярных волокон полилактида(PLA, молекулярный вес 76kDa) диаметром от 800нм до 3мкм, с порами меньше 10 мкм. Общая порозность конструкции составила 79 ± 4%. Такой подход ученые объясняют необходимостью имитирования анатомического строения натурального сосуда, где медиа содержит циркулярно расположенные волокна коллагена для сопротивления растяжению, а интима является ложем для эндотелиоцитов. Исследователи делают акцент на том, что за время всего эксперимента не наблюдалось раздвоения конструкции на слои, что можно объяснить наличием крепкой зоны смешивания. Анализ механических свойств показал, что такие матрицы выдерживают на разрыв до 4.3 ± 0.2 MPa, при максимальном растяжении в 47.0 ± 6.3%, что значительно крепче, чем при изолированном использовании PCL. Для исследования биосовместимости матриц использовли мышиные фибробласты 3Т3 и человеческие венозные миофибробласты. Мышиные фибробласты увеличивали собственное число вплоть до 30 дня культивирования. К 14м суткам в культуре было отмечено проникновение клеток вглубь матрицы, а к 30м достигнута почти полная конфлуэнтность. Инфильтрации конструкции человеческими венозными фибробластами отмечено не было. К 30 дню клетки формировали монослой на поверхности матрицы. Иммуноцитохимические исследования показали отложения коллагена и гликозаминогликанов в обоих случаях[14].
В паре исследований при добавлении к синтетическому биоразлагаемому полимеру поликапролактону белка естественного внеклеточного матрикса коллагена I типа наблюдалось уменьшение модуля Юнга с 7.5±0.7 (для чистого PCL) до 2.7±1.2 (для композитного материала), что говорит о снижении ригидности материала и проявлении им более эластичных свойств. Параметры электроспиннига для создания данных матриц были следующие: напряжение электрического тока 5-25кВ, расстояние до коллектора 10-20см, скорость вращения приемного мандрела 1000 об/мин, скорость подачи растовора 1-10 мл/час. В эксперименте наблюдалась достоверно большая адгезия и пролиферация эндотелиальных и гладкомышечных клеток на матрицах с добавлением коллагена по сравнению с конструкциями из чистого PCL. Эндотелиальные клетки самостоятельно распределялись по внутренней стороне цилиндрической матрицы, что может говорить возможности становлении сосуда. Морфология клеток эндотелиальных клеток зависела от диаметра волокон матрицы. Так, при диаметре фибрилл меньше 1 мкм клетки имели многоотросчатую форму, большое количество сайтов фокальной адгезии на множестве волокон находящихся рядом с ними. При диаметре фибрилл от 2,39 до 4,45 мкм клетки контактировали лишь с одним волокном, не продуцировали сайтов фокальной адгезии и имели вытянутую вдоль волокна форму. Иммуноцитохимический анализ экспрессии эндотелиальных маркеров, таких как CD31, фактор фон Виллебранда, VE-кадгерин показал значительно большее их отложение в культурах клеток выращиваемых на матрицах с диаметром волокна до 1 мкм. Наблюдалась характерная для эндотелиальных клеток локализация молекул: CD31, VE-кадгерина - между мембранами отдельных клеток и фактора фон Виллебранда внутри клетки[15-16].
Таким образом электроспиннинг позволяет создавать цилиндрические структуры схожие по строению с натуральной сосудистой стенкой, а правильный подбор материала матрицы может обеспечить необходимую для сосуда эластичность. Структурирование конструкции на микро- и наноуровнях поможет в создании оптимальных условий для того или иного вида клеток.
Одной из причин развития хронической сердечной недостаточности является рубцевание и развитие зон гипокинеза миокарда после перенесенного больным острого инфаркта миокарда. Если учесть, что смертность от сердечно-сосудистых заболеваний находится на первом месте среди других причин смертности, то проблема лечения данной патологии становится одной из актуальнейших в современной медицине. На сегодняшний день не существуют эффективного лечения описанной патологии, а тканевая инженерия сердечной ткани является наиболее перспективным направлением, способным решить поставленную задачу.
Чтобы создать тканеинжинерный эквивалент сердечной ткани ученые подвергли электроспинннигу 3 вида синтетических полимеров: поли-L-лактид(PLLA, молекулярный вес 100000 г/моль), полилактид-ко-гликолид(лактид/гликолид=10/90), полилактид-ко-гликолид(лактид/гликолид=75/25). Параметры получившихся матриц следующие: для 1го типа - средний диаметр фибрилл 1мкм, порозность 71, водный контактный угол 107 о , для 2го - средний диаметр фибрилл 1мкм, порозность 78, водный контактный угол 85 о , для 3го - средний диаметр фибрилл 0,9 мкм, порозность 75, водный контактный угол 65 о . Параметры процесса электроспиннига, позволившего создать данные матрицы следующие: расстояние до приемного коллектора 15 см, напряжение тока 2кВ на 1 см, скорость подачи раствора 6мл/час. Каждая матрица имела вариант с хаотично расположенными волокнами и вариант с продольным расположением, что обеспечивалось разной скорость вращения приемного мандрела. Анализ биодеградируемости конструкций показал, что добавление гликолидов в конструкцию ускоряет ее время разложения. Так, после 7 дней в фосфатном буфере матрица из PLLA потеряла меньше 10% массы, матрица из PLGA(75/25) чуть больше 10%, в то время как матрица из PLGA(10/90) потеряла в массе около 22%. Анализ биосовместимости проводился с помощью кардиомиоцитов. В ходе исследования было выявлена, что адгезия и пролиферация клеток убывали в ряду PLLA - PLGA(75/25) - PLGA(10/90). Т.е. кардиомиоциты лучше взаимодействуют с гидрофобными структурами, что не характерно для подавляющего большинства остальных клеток организма. Вдобавок на матрицах из PLLA наблюдалось образование вставочных дисков между кардиомиоцитами, что говорит о формировании необходимой гистологической структуры. Данное явление не было выявлено при использовании других видов матриц. Одной из причин такого поведения клеток может быть ускоренная биодеградация, которая не позволяет клеткам эффективно расположиться на поверхности матриц, содержащих PLGA. При использовании матриц с продольно расположенными фибриллами клетки вытягивались вдоль волокон и образовывали пул однонаправлено расположенных клеток, что в сочетании с формированием вставочных дисков между кардиомиоцитами давало гистологическую картину схожую с естественной сердечной тканью[17].
Группа других ученых решила добавить натуральный белок желатин к 19% растовору синтетического PLGA(лактид/гликолид=75/25). При различных параметрах электроспиннинга(вольтаж 14-16кВ, диаметр иглы 27G, скорость подачи растора 1 мл/час, расстояние до коллектора 12 см) микроархитектоника конечных продуктов оказалась разной. Средний диаметр фибрилл для матриц из PLGA составил 630±51нм, для композитных матриц 64±55 нм, средний диаметр пор 1.072±0.54 мкм и 0.546±0.29 мкм соответственно. К тому же было выявлено значительное снижение эластичности и прочности на разрыв композитных матриц по сравнению с конструкций из чистого PLGA. Для исследования биосовместимости ученые применили кардиомиоциты. Колорометрический анализ показал достоверно большую пролиферацию клеток на композитных матрицах все время культивирования. Исследование механических свойств матриц после заселения их клетками показал снижение и прочности и эластичности конструкций. Расселение клеток по поверхности PLGA матриц имело ограниченный характер, в то время как клетки находящиеся на PLGA/Gel конструкция уже к 4 дню заняли почти всю представленную поверхность. Данное явление можно объяснить тем, что желатин имеет множество интегрин-связываемых сайтов, что положительно влияет на адгезию и дифференцировку клеток. Иммуноцитохимический анализ показал визуально большее отложение специфичных белков сердечной мышцы, таких как альфа-актин и тропонин I, на матрицах из PLGA/Gel[18].
Другая команда исследователей тестировала матрицы состоящие из полигликолида(PGA) и коллагена I типа. В работе был применен электроспинниг с параметрами: диаметр иглы 0,7 мм, напряжение электрического тока 25 кВ, расстояние до приемного коллектора 23 см, скорость подачи раствора 10мл/час. Оказалось, что добавление полигликолида к коллагену существенно увеличивает прочность матрицы. Анализ биосовместимости с помощью сердечных стволовых клеток показал, что ни матрица из чистого PGA ни композитная матрица не являются цитотоксиными - рост клеточного числа отмечался все время культивирования. Однако большая адгезия и пролиферация наблюдались на композитных матрицах[19].
В данных исследованиях еще раз подтверждается большая биореактивность композитных материалов, но обнаруживается и недостаток. Добавления натуральных белков может не только увеличивать но и уменьшать механическую прочность матрицы. Вдобавок становится ясно, что созданные благоприятные условия для одних клеток совсем не обязательно будут приемлемыми для другого их вида. Таким образом, для создания оптимального продукта ученые вынуждены лавировать между механическими и биореактивными свойствами матриц путем выбора материала и структуры конструкций, а так же вида используемых клеток.
Необходимость в восстановлении обширных костных дефектов и протезирования хрящей сделала тканевую инженерию костнохрящевой ткани одним из самых изученных направлений. На сегодняшний день с этой целью исследовано множество синтетических и композитных материалов. Все они обладают своими достоинствами и недостатками и многие из них являются потенциальными предшественниками тканеинженерных конструкций.
С целью создания тканеинженерного хряща ученые подвергли электроспиннингу 2 вида полилактида-ко-гликолида(PLGA, лактид/гликолид= 50/50 и 75/25). Параметры процесса были следующие: расстояние до приемного коллектора 25 см, вольтаж 0,56кВ на 1 см расстояния до коллектора, диаметр иглы 18G, скорость вращения 0,3 м/сек. Получившиеся матрицы имели средний диаметр волокон 550±150 нм, размеры пор от 0.0032 до 409.44 мкм и порозность 80,68%. Выяснилось, что по механическим свойствам такие матрицы сопоставимы с кожей, но для хряща являются слишком эластичными и не выполнят опорную функцию. К тому же время деградации, как и в предыдущих использованиях PLGA, оказалось слишком мало для эффективного хондрогенеза. Так была выявлена необходимость смены материала или добавления веществ, способных усилить механическую составляющую[20].
В другой работе ученые наоборот использовали лишь белок натурального внеклеточного матрикса - коллаген II типа. Матрицы полученные методом электроспиннинга имели волокна со средним диаметром 496 нм м среднюю площадь пор 6,94 мкм 2 . Анализ механических свойств показал, что матрица хоть и имеет достаточный запас прочности, но является ригидной и почти не подвергается деформации(1-2% растяжения). Что так же не пригодно для хрящевой ткани. Однако при исследовании биосовместимости хондроциты активно инфильтрировали конструкцию, что немало важно для будущего тканеобразования[21].
Чтобы сохранить преимущества и устранить недостатки обоих типов используемых материалов ученые создали композитную матрицу из поликапролактона(PCL) и эластина со средним диаметром пор 540±21 мкм. Механические свойства данной конструкции приближались к механическим свойствам естественной хрящевой ткани. По мере увеличения концентрации эластина в растворе вело к увеличению захвата воды и гидрофильности матрицы, что дополнительно увеличивало эластичность конструкции, что важно для хрящевой ткани. Анализ биосовместимости проводился с помощью хондроцитов. Адгезия и пролиферация клеток более выражена на композитных матрицах по сравнению с конструкциями из чистого PCL. Вдобавок на матрицах из PCL/эластина отмечалась активная инфильрация клеток вглубь конструкции[22].
Интересный подход к созда
Применение электроспиннинга в нуждах тканевой инженерии курсовая работа. Медицина.
Реферат: Production Report To Directors Essay Research Paper
Реферат: Культура Эпохи Высокого Возрождения и ее представители как светочи мировой культуры. Скачать бесплатно и без регистрации
Адипиновая кислота
Реферат: Languages Of Rights Essay Research Paper The
Реферат По Физкультуре На Тему Спринт
Реферат по теме Telecommunications
Курсовая работа: Федеральный бюджет и его роль в регулировании доходов нижестоящих бюджетов
Обучение И Развитие Персонала Реферат
Практическое задание по теме Определение железа в растворах хлорида железа (III)
Концепция Времени Эйнштейна И Ньютона Курсовая
Реферат: The Core Of Stability-Character Analysis On To
Реферат по теме Матрицы графов
Контрольная работа по теме Функции операционной системы
Курсовая Работа Информационная Система Магазина Автозапчастей
Реферат: Психологические особенности развития мотивации достижения в профессиональной деятельности
Реферат по теме Система управления аппаратом производства фотографической эмульсии
Контрольная Работа На Тему Деловая Риторика. Коммуникативный Аспект Делового Общения
Контрольная работа: Автомобиль ГАЗ-6611. Скачать бесплатно и без регистрации
Памятка Для Написания Эссе По Обществознанию Егэ
Реферат по теме Интеллектуальные чувства
Историческое своеобразие культуры Древнего Рима - Культура и искусство контрольная работа
Концепт "Мечта" во фразеологической картине мира английского, немецкого и русского языков - Иностранные языки и языкознание дипломная работа
Государственные гарантии субъекта Российской Федерации - Государство и право курсовая работа