Получение инсулина методом генной инженерии

Получение инсулина, соматотропина, интерферонов на основе методов генетической инженерии

=== Скачать файл ===

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета. Очистку регенерированного гибридного белка проводят в одну стадию ионнообменной хроматографией. Расщепление гибридного белка осуществляют совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б Очистку инсулина проводят гидрофобной хроматографией с последующей гель-фильтрацией, а выделение инсулина - кристаллизацией в присутствии солей цинка. Изобретение позволяет сократить процесс получения генно-инженерного инсулина человека и увеличить его выход. С учетом основных достижений современной диабетологии и рекомендаций Всемирной организации здравоохранения европейские страны к году завершили переход на использование человеческих инсулинов. В связи с этим разработка способов получения инсулина с использованием методов ДНК-рекомбинантной технологии является актуальной задачей. Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, состоящий в культивировании штамма-продуцента Е. Coli, продуцирующего проинсулин, содержащий два синтетических IgG связывающих домена стафилококкового белка А. Схема выделения заключается в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих проинсулин, растворении телец включения, окислительном сульфитолизе проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка аффинной хроматографией, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами трипсином и карбоксипептидазой Б и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией. Недостатками данного способа являются высокая себестоимость продукта и использование при получении инсулина детергента, который может присутствовать в целевом продукте. Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, состоящий в том, что культивируют клетки штамма-продуцента Е. Нерастворившиеся примеси удаляют центрифугированием, после чего увеличивают концентрацию дитиотреитола до 10 мМ и восстанавливают дисульфидные связи при 4 o С в течение 1 ч. Раствор разбавляют в 5 раз холодной водой, доводят рН до 4,5 и выдерживают 2 ч при 4 o С для формирования осадка. Осадок, содержащий гибридный белок, отделяют центрифугированием и ренатурируют, быстро растворяют в холодной воде при рН , после чего разводят 10 мМ глициновым буфером рН 10,8 и выдерживают при o С в течение ночи. После ультрафильтрации раствор подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом G и элюируют 10 мМ глициновым буфером. Собирают фракции, содержащие гибридный белок, проводят ультрафильтрацию и лиофильно высушивают. Coli system with met-lys-human proinsulin as the expressed precursor' Applied Biochemistry and Biotechnology, , v. К недостаткам известного способа относится использование гельфильтрации на начальных стадиях, что требует значительных объемов сорбента и большого количества ферментов, используемых при расщеплении гибридного белка. К недостаткам способа следует отнести использование значительных количеств мочевины на стадии хроматографии на SP-сефарозе проблема последующей утилизации и использование органических растворителей на стадии выделения рекомбинантного белка и стадии очистки инсулина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии проблема защиты окружающей среды при промышленном производстве. Биосинтез продуцента проводят следующим образом. Полученный посевной материал используют для засева ферментера объемом л. Ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 30 ОЕ, проводя индукцию синтеза гибридного белка изопропилтио- -D-галактопиранозидом. После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка биомассу отделяют центрифугированием, разрушают на дезинтеграторе Гаулина и выделяют центрифугированием тельца включения. Тельца включения, полученные после дезинтеграции биомассы, обрабатывают по следующей схеме: Тельца включения подвергают двукратной отмывке водой и 50 мМ трис-НСl при рН 9,0. Отмытые тельца включения растворяют в буфере, содержащем 50 мМ трис-НСl, 8,0 М мочевину, 1 мМ ЭДТА, 0,2 М NaСl, мМ дитиотреитола, при рН 8,0. Раствор выдерживают при охлаждении и перемешивании в течение 72 ч. Очистку гибридного белка проводят хроматографией на ДЕАЕ-сефарозе FF, ДЕАЕ-тойоперле и т. К полученному раствору очищенного гибридного белка прибавляют раствор, содержащий карбоксипептидазу Б и трипсин, по окончании реакции данные ВЭЖХ гидролиз останавливают подкислением раствора до рН 3,0, прибавляют хлористый натрий, перемешивают в течение 30 мин и центрифугируют. Осадок передают на следующую стадию очистки. Осадок белка, содержащий инсулин, растворяют в 10 мМ лимонной кислоте, добавляют хлористый натрий до концентрации 1 М и доводят рН раствора до значения 6,,5. Раствор центрифугируют и супернатант, содержащий инсулин, наносят на колонку, содержащую гидрофобный сорбент, уравновешенный исходным буферным раствором. Сорбированный материал элюируют линейным градиентом этилового спирта. Раствор, содержащий инсулин, смешивают с равным количеством раствора 4 М хлористого натрия в 10 мМ лимонной кислоте, выдерживают при перемешивании на холоду, центрифугируют. Полученный осадок растворяют в 0,5 М уксусной кислоте, фильтруют и передают на гель-фильтрацию. Гельфильтрацию раствора инсулина проводят на колонке, содержащей сефадекс G SF SG. К раствору инсулина, полученного на предыдущей стадии, добавляют ацетат цинка, доводят значение рН до 5,,2 концентрированным раствором аммиака. Суспензию перемешивают в течение 2 ч, после чего центрифугируют. Кристаллы последовательно промывают апирогенной водой, этиловым спиртом и абсолютным этиловым спиртом и высушивают в вакуумном сушильном шкафу. Для получения иннокулята питательную среду на основе гидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей засевают культурой штамма-продуцента, затем выращивают посевной материал в ферментере объемом 10 л. После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка биомассу отделяют центрифугированием, разрушают на дезинтеграторе Гаулин и выделяют центрифугированием тельца включения. Для этого тельца включения суспендируют в воде при массовом соотношении телец и воды 1: Затем суспензию центрифугируют при g в течение 30 мин, супернатант сливают, а осадок отмывают в 50 мМ трис-НСl. Полученные тельца включения растворяют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl, 8,0 М мочевину, 1 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl, 10 мМ дитиотреитол, при рН 8,0. Реакцию проводят в течение 3 ч при температуре 20 o С. Нерастворившийся материал отделяют центрифугированием при g в течение 30 мин. Очистку гибридного белка проводят хроматографией на ДЕАЕ-сефарозе FF. Ha колонку диаметром мм, содержащую 1,5 л ДЕАЕ-сефарозы FF и уравновешенную 25 мМ трис-НСl-буфером с рН 7,5, наносят раствор ренатурированного гибридного белка. Сорбированный белок элюируют с колонки градиентом соли от 0 до 0,3 М хлористого натрия в исходном буфере. Фракции, содержащие гибридный белок, объединяют и используют для получения инсулина. К мл полученного раствора с рН 7,5, содержащего 9 г гибридного белка, прибавляют свежеприготовленный раствор 4,5 мг трипсина в соляной кислоте, раствор, содержащий 2,25 мг карбоксипептидазы Б в массовом соотношении По окончании реакции гидролиз останавливают подкислением раствора соляной кислотой до рН 3,0. Содержание инсулина в реакционной среде по данным ОФ ВЭЖХ составляет 2,3 г. К подкисленному раствору гидролизата гибридного белка прибавляют хлористый натрий до концентрации 2М, перемешивают в течение 30 мин и центрифугируют при g. Супернатант сливают, а осадок передают на следующую стадию очистки. Осадок белка, содержащий 2,3 г инсулина, растворяют в 10 мМ лимонной кислоте, прибавляют хлористый натрий до концентрации 1 М и доводят рН раствора до значения 6,1. Сорбент промывают исходным буферным раствором, затем этим же буфером в условиях линейно понижающейся концентрации хлористого натрия от 1 до 0 М и 10 мМ цитратным буфером с рН 6,1. Собранные фракции белкового раствора анализируют методом ОФ ВЭЖХ. Белковые фракции, содержащие инсулин с более высоким содержанием примесей, объединяют и направляют на дополнительную очистку. Раствор, содержащий 1,05 г инсулина, смешивают с равным количеством раствора 4 М хлористого натрия в 10 мМ лимонной кислоте, выдерживают при перемешивании в холодильнике в течение 2 ч, центрифугируют 20 мин при 20 g. Полученные фракции анализируют методом эксклюзионной ВЭЖХ и объединяют фракции, содержащие инсулин без высоко- и низкомолекулярных примесей. Выход инсулина на данной стадии составляет 0,9 г. К мл раствора инсулина в 0,5 М уксусной кислоте, содержащего 0,9 г инсулина, добавляют ацетат цинка до концентрации 0,05 М, доводят значение рН до 6,0 концентрированным раствором аммиака. Суспензию перемешивают на магнитной мешалке при 4 o С в течение 2 ч, после чего центрифугируют при g в течение 15 мин. Супернатант сливают, а осадок промывают апирогенной водой и вновь центрифугируют. Слегка опалесцирующий раствор оставляют медленно перемешиваться при 4 o С в течение 4 ч, затем центрифугируют при g в течение 15 мин. Супернатант сливают, осадок последовательно промывают апирогенной водой дважды , этиловым спиртом и абсолютным этиловым спиртом дважды. Кристаллы высушивают в вакуумном сушильном шкафу. Затем суспензию центрифугируют при g в течение 30 мин, супернатант сливают, а осадок отмывают в 50 мМ трис-HCl. Полученные тельца включения растворяют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl, 8,0 М мочевину, 1 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl, 5 мМ дитиотреитол, при рН 8,0. Реакцию проводят в течение 7 ч при температуре 20 o С. На колонку диаметром мм, содержащую 1,5 л SP-сефарозы FF, уравновешенную 25 мМ трис-НСl-буфером с рН 7,5, наносят раствор ренатурированного гибридного белка с рН 7,5. Сорбированный белок элюируют с колонки градиентом соли от 0 до 0,7 М хлористого натрия в исходном буфере. Фракции, содержащие гибридный белок, объединяют и используют для получения субстанции инсулина. К мл полученного раствора, содержащего 8,1 г гибридного белка рН раствора 7,5 , прибавляют свежеприготовленный раствор 2, мг трипсина в соляной кислоте, раствор, содержащий 2, мг карбоксипептидазы Б в массовом соотношении Через 2 ч гидролиз останавливают подкислением раствора соляной кислотой до рН 3,0. Содержание инсулина в реакционной среде по данным ОФ ВЭЖХ составляет 2,1 г. К подкисленному раствору гидролизата гибридного белка прибавляют хлористый натрий до концентрации 2М, перемешивают в течение 30 мин при 20 o С и центрифугируют 25 мин при g. Осадок белка, содержащий 2,1 г инсулина, растворяют в 10 мМ лимонной кислоте, добавляют хлористый натрий до концентрации 1 М и доводят рН раствора до значения 6,5. Фракции белкового раствора анализируют методом ОФ ВЭЖХ. Выход инсулина 0,95 г. Раствор, содержащий 0,95 г инсулина, смешивают с равным количеством раствора 4 М хлористого натрия в 10 мМ лимонной кислоте, выдерживают при перемешивании в холодильнике в течение 2 ч, центрифугируют 20 мин при g. Полученный осадок растворяют в 1,0 М растворе уксусной кислоты, фильтруют и передают на гель-фильтрацию. Полученные фракции анализируют методом эксклюзионной ВЭЖХ и объединяют фракции, содержащие инсулин с минимальным содержанием высоко- и низкомолекулярных примесей. Выход инсулина на данной стадии составляет 0,8 г. К мл раствора инсулина в 0,5 М уксусной кислоте, содержащего 0,8 г инсулина, добавляют ацетат цинка до концентрации 0,1 М, доводят значение рН до 6,0 концентрированным раствором аммиака. Суспензию перемешивают на магнитной мешалке при 6 o С в течение 2 ч, после чего центрифугируют при g в течение 15 мин. Слегка опалесцирующий раствор оставляют медленно перемешиваться на магнитной мешалке при 6 o С в течение 4 ч, затем центрифугируют при g в течение 15 мин. Способ получения генно-инженерного инсулина человека. Изобретение относится к области медицинской генетики. Изобретение относится к области иммунобиотехнологии и медицины и касается моноклонального антитела МКАТ к СД23 человека. Изобретение относится к получению биологически активной IL-1 протеазы с помощью технологии рекомбинантных ДНК и может быть использовано в медицине. Изобретение относится к иммунобиотехнологии и касается новых моноклональных антител, способов их получения с использованием гибридомной технологии и осУр3-интегрина или витронектина в качестве антигена, полипептидов, представляющих легкую и тяжелую цепи антител и ДНК, кодирующие эти полипептиды. Рекомбинантная плазмидная днк p31nc, кодирующая аминокислотный нуклеокапсидный белок вируса репродуктивно- респираторного синдрома свиней и обеспечивающая его экспрессию в клетках бактерий e. Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано в диагностике заболеваний свиней. Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике метаболических костных заболеваний. Изобретение относится к биотехнологии и касается микробиологического производства белково-витаминного корма. Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производного инсулина или его физиологически приемлемой соли с ускоренным по сравнению с человеческим инсулином наступлением действия, в котором аспарагин Asn в положении В3 цепи В заменен на природный основной аминокислотный остаток и по меньшей мере один аминокислотный остаток в положениях В27, В28 или В29 цепи В замещен на другой природный нейтральный или кислый аминокислотный остаток, причем аспарагин Asn в положении А21 цепи А может быть заменен на Asp, Gly, Ser, Thr или Ala, а фенилаланин Phe в положении В1 цепи В и аминокислотный остаток в положении В30 цепи В могут отсутствовать. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения вирусоподобных частиц VLP папилломавируса человека, используемых для создания вакцин. Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения проинсулина человека. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии, и решает задачу получения высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента человеческого проинсулина. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для создания лекарственных препаратов человеческого инсулина. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок- предшественник инсулина человека варианты , штамм бактерий e. Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека варианты , штамм бактерий e.

При какой температуре запекать утку

Сделать большую коробкуиз картонасвоими руками

Что значит шагреневая кожа