Отработка технологии выделения и очистки белка Xvent-2 из Шпорцевой лягушки - Биология и естествознание курсовая работа
Главная
Биология и естествознание
Отработка технологии выделения и очистки белка Xvent-2 из Шпорцевой лягушки
Синтез белка Xvent-2 в клетках зародышей с целью дальнейшей дифференцировки стволовых клеток. Выделение клеточных органелл. Реагенты и растворы для изоэлектрического фокусирования. Получение биологического материала. Результаты работы и их обсуждение.
посмотреть текст работы
скачать работу можно здесь
полная информация о работе
весь список подобных работ
Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение Высшего профессионального образования
"Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова"
Кафедра химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского
Отработка технологии выделения и очистки белка Xvent-2 из Шпорцевой лягушки
Научный руководитель от ИБХ им.А.Н. Баха РАН
-O-CH 2 CHOHCH 2 N + H (CH 2 CH 3 ) 2
-O-CH 2 CHOHCH 2 O (CH 2 ) 3 SO 3 -
-O-CH 2 CHOHCH 2 OCH 2 CHOHCH 2 SO 3 -
Так как белок, который необходимо очистить методом ионообменной хроматографии содержится в буфере, также как целлюлоза, то выбор буферной системы, в которой будет проводиться разделение, очень важен. Буфер необходим для поддержания определенного значения pH, так как содержит ионы, участвующие в ионном обмене и сохраняющие стабильность системы в ионообменнике. Буферные растворы не должны химически взаимодействовать с сорбентом и менять его свойства, поэтому наиболее оптимальным будет, если буфер и сорбент будут иметь заряд с одинаковым знаком. При изменении ионных сил может происходить модификация структуры сорбента, изменение сил связывания белка с иногенными группами и денатурация белка. Во избежание этого, хроматографию на анионообменниках предпочтительно вести в таких буферах, у которых буферный компонент является катионом, т.е. трисовом, пиридиновом и имидазольном. Для катионообменников следует использовать буферы, где буферным компонентом служит анион кислотного остатка, такие как ацетатный, фосфатный, бикарбонатный и другие буферы, которые можно найти в литературе [20,21].
Ориентировочно о характере различия электрофоретических подвижностей двух белков в данных условиях разделения можно судить в том случае, когда известны их молекулярные массы и изоэлектрические точки, а также содержание в них ионогенных аминокислот.
Электрофоретическая подвижность молекул в ПААГ зависит от молекулярных масс белков и концентрации ПААГ. Подвижность биополимеров, находящихся в геле, пропорциональна подвижности в свободной жидкости. Подвижность определяется отношением суммарного заряда макромолекулы к ее массе. По силе трения молекулы о гель, а также по размерам пор определяют молекулярные массы белков.
Электрофорез проводят в буферной системе - рабочем буфере. От pH буфера, в котором находится белок, зависит суммарный заряд молекулы, а значит и отношение массы к заряду. Наилучшее разделение проводится при наиболее различных зарядов всех белков в смеси, для обеспечения разности зарядов белков выбирают величину pH буфера максимально удалённую от изоэлектрических точек всех белков. Разделение белков с кислым значением pH следует проводить в слабощелочном буфере, при котором разделение будет проходить от катода к аноду. При разделении щелочных белков наоборот, следует выбрать буфер с слабокислым значением pH и их миграция будет проходить от анода к катоду.
При выборе буфера также следует учитывать его электропроводную способность и электрофоретическую подвижность его ионов. Ионы буфера под действием электрического тока могут мигрировать в одном направлении с разделяемыми макромолекулами. Качество разделения улучшается, если для щелочных белков использовать трисовый буфер, а для кислых белков - барбитуратный буфер.
Трение молекулы о гель может происходить в зависимости от ее молекулярной массы, но на трение может влиять другой фактор. Например, конфигурация молекулы белка. Белки, образующие глобулы, которые не подвержены распаду и присоединению к ним новых молекул, называются глобулярными белками, их размеры зависят от плотности упаковки полипептидных цепей в глобулы. Все глобулы взаимодействуют с ПААГ практически одинаково, в отличие от фибриллярных белков, которые изменяют свою структуру при взаимодействии с гелем, что помогает им легче пройти между нитями ПААГ. Поэтому чтобы белковые структуры вели себя одинаково при миграции, применяют метод распрямления молекулы полипептидной цепи, то есть разрушение связей в белке, до первичной структуры. При применении этого метода более точно определяется молекулярная масса белка. Для разрушения связей в белке его перед электрофорезом обрабатывают детергентом - додецилсульфатом натрия, и нагревают до 100°С. Такую методику впервые предложил Лэммли [22]. Гидрофобными частями детергент присоединяется к гидрофобным радикалам аминокислот в полипептидной цепи. Данное взаимодействие изменяет конформацию белков. Денатурированный под действием детергентов белок обычно остаётся в растворённом виде, так как гидрофильные части денатурирующего вещества удерживают его в растворе и белок приобретает отрицательный заряд. Полипептидная цепочка белка распрямляется из-за электрического отталкивания остатков серной кислоты, расположенных на поверхности белка.
Как уже говорилось, белки способны слипаться, образовывая новые большие молекулы, такой процесс называется агрегацией и может привести к образованию таких соединений как димеры или тримеры молекул. Они будут проявляться отдельно от основной молекулы белка, давая дополнительные полосы. Такой эффект может происходить за счет сохранения водородных связей в структуре. Для предотвращения этого можно использовать мочевину, под действие которой разрушаются в основном нековалентные связи, такие как гидрофобные взаимодействия и водородные связи. Мочевина образует водородные связи с амино - и карбонильными группами пептидного остова и некоторыми функциональными группами радикалов аминокислот, в результате чего происходит разрыв связей, участвующих в формировании вторичной и третичной структуры нативных белков, и образование новых связей с мочевиной.
Для разрушения дисульфидных мостиков в структуре белка используют меркаптоэтанол, который также предотвращает окисление белкового препарата, так как при окислении происходит образование дисульфидных связей:
Разрушение дисульфидных связей происходит из-за восстанавливающего действия меркаптоэтанола на дисульфидные мостики между аминокислотными остатками в молекуле белка:
Во время проведения электрофореза сами белки увидеть нельзя, поэтому для визуализации процесса используют красители, которые добавляют в смесь белков перед проведением электрофореза. Обычно подбирают такой краситель, который не взаимодействует с белком и несет электрический заряд с таким же знаком. Под действием электрического тока краситель также двигается в электрическом поле, однако он не должен значительно опережать миграцию исследуемых белков в ПААГ. Скорость миграции молекул красителя должна быть немного выше, чем наивысшая скорость миграции макромолекул. Для белков заряженных отрицательно, а также денатурированных при помощи додецилсульфата натрия, часто применяют краситель, имеющий отрицательных заряд - бромфеноловый синий.
Основной физический принцип метода разделения белковой смеси при помощи электрофореза заключается в том, что макромолекулы, которые необходимо подвергать разделению, имеют суммарный электрический заряд за счет нахождения на поверхности разнозаряженных зон [23]. На заряд может влиять значение pH среды, в которой содержатся макромолекулы. Если создать такие условия, что через буферный раствор, находящийся между изолированными стеклами, пропускать электрический ток, то будет образовываться градиент напряжения и в буферном растворе установится электрическое поле. Под действием электрического поля макромолекулы перемещаются к катоду или аноду, в зависимости от суммарного заряда, которым обладает молекула. От того какой размер самой молекулы и каким зарядом она обладает, будет зависеть скорость миграции в электрическом поле. При столкновении молекул с нитями геля, их подвижность замедляется. Вследствие торможения молекул и происходить разделение. Исходный набор макромолекул разделяется на зоны, в которых содержаться молекулы, имеющие одинаковый размер и заряд. В процессе проведения электрофореза эти зоны распределяются по длине геля.
Белок – неотъемлемая составляющая нашего организма, нарушение которой может вызвать его разрушение. Исторический анализ открытия и исследований белков. Свойства белка, выделение. Биосинтез и химический синтез белка - практическое применение и значение. реферат [23,5 K], добавлен 18.05.2008
История получения белка с помощью микроорганизмов. использование высших базидиальных грибов для получения белка кормового, пищевого назначения. Получение белка путем глубинного культивирования на питательных средах. Сохранение и усиление грибного аромата. реферат [28,9 K], добавлен 13.03.2019
Характеристика биосинтеза как процесса образования органических веществ, происходящего в клетках с помощью ферментов и внутриклеточных структур. Участники биосинтеза белка. Синтез РНК с использованием ДНК в качестве матрицы. Роль и значение рибосом. презентация [2,3 M], добавлен 21.12.2013
История открытия и изучения белков. Строение молекулы белка, ее пространственная организация и свойства, роль в строении и жизнеобеспечении клетки. Совокупность реакций биологического синтеза. Всасывание аминокислот. Влияние кортизола на обмен белка. контрольная работа [471,6 K], добавлен 28.04.2014
Применение клеточных технологий в селекции растений. Использование методов in vitro в отдаленной гибридизации. Работы по культивированию каллуса с целью получения нового селекционного материала. Гибридизация соматических клеток и ее основные результаты. реферат [28,6 K], добавлен 10.08.2009
Типовые нарушения белкового обмена. Несоответствие поступления белка потреблению. Нарушение расщепления белка в ЖКТ и содержания белка в плазме крови. Расстройство конечных этапов катаболизма белка и метаболизма аминокислот. Нарушения липидного обмена. презентация [201,8 K], добавлен 21.10.2014
Изучение кодирования аминокислотной последовательности белков и описание процесса синтеза белка в рибосомах. Генетический код и синтез рибонуклеиновой кислоты. Построение цепи матричной РНК и синтез протеина. Трансляция, сворачивание и транспорт белков. реферат [3,5 M], добавлен 11.07.2015
Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д. PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах. Рекомендуем скачать работу .
© 2000 — 2021
Отработка технологии выделения и очистки белка Xvent-2 из Шпорцевой лягушки курсовая работа. Биология и естествознание.
Контрольная Работа На Тему Духовная Культура Эпохи Просвещения
Контрольная работа по теме Анализ управления финансами предприятия
Реферат: Ливонская война
Контрольная работа: Адсорбция полимеров
Реферат: Інсулін
Реферат: Основы проектирования склада 2
Сочинение Огэ Материнская Любовь По Тексту Астафьева
Сочинение По Рассказу Куприна Гранатовый Браслет
Реферат по теме Новации и качество
Написать Сочинение Используя Одну Часть Речи
Реферат На Тему Правление Николая 2
Реферат: Европейская философия до Канта
Контрольная работа по теме Оценка радиационной обстановки на железнодорожном участке
Сочинение По Теме Детство Горького
Реферат На Тему История Создания Города Борисоглебска
Ефросинья Полоцкая На Белорусском Языке Реферат
Реферат по теме Сифилитический и раковый перитонит, характеристика перитонита у детей
Сочинение На Тему Мокрая Терраса Кратко
Амортизация Основных Фондов Курсовая Работа
Реферат На Тему Александр Невский Личность Нации
Особенности покрытосеменных - Биология и естествознание реферат
История развития физиологии высшей нервной деятельности - Биология и естествознание контрольная работа
Естествознание - фундаментальная наука - Биология и естествознание доклад