Основные направления применения активированной хемилюминесценции - Медицина курсовая работа

Главная

Медицина
Основные направления применения активированной хемилюминесценции

Механизм реакций, сопровождающихся свечением живых организмов, видимым простым глазом. Использование активированной хемилюминесценции и биолюминесценции как инструмента в медико-биологических исследованиях сыворотки крови, мочи, ликвора и слюны.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Биолюминесценция (БЛ) - это свечение живых организмов, видимое простым глазом. Способностью к БЛ обладают организмы, принадлежащие к самым разным систематическим группам: бактериям, грибам, моллюскам, насекомым. Механизм реакций, сопровождающихся свечением, различен у разных видов, однако обычно включает в себя химическое превращение определенного низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, катализируемое ферментом люциферазой.
Биолюминесценция светляка. Всем известное свечение светляков происходит в результате биохимической реакции окисления светлякового люциферина кислородом воздуха в присутствии аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ):
E-L^-АМФ +° 2 ^° 2 . Р*-Е-АМФ -> -> Е + Р + АМФ + фотон.
Здесь АМФ - аденозинмонофосфат, ПФ - пирофосфат, Е - люцифераза, LH 2 - люциферин, Р* и Р - продукт реакции (оксилюциферин) в возбужденном и основном состояниях соответственно.
При отсутствии АТФ биолюминесценции не наблюдается, на этом основан один из самых чувствительных методов анализа АТФ в различных объектах. Для определения содержания АТФ измеряют хемилюминесценцию в изучаемом растворе, к которому добавляют смесь люциферина и люциферазы. Удается определять содержание АТФ в образце от 10" 17 моля и выше.
Поскольку биосинтез АТФ - показатель нормальной жизнедеятельности клеток, препарат люциферин - люцифераза светляка используют для обнаружения бактериального заражения в какой-либо среде, для оценки жизнеспособности эритроцитов при консервировании крови, изучения действия на микроорганизмы антибиотиков и т.д. В последнее время используют препараты иммобилизованной люциферазы (фермента, молекулы которого химически связаны с полимерной пленкой), стабильность которой выше, такой препарат можно использовать многократно.
Биолюминесценция медузы Aequorea . В последнее время для обнаружения малых количеств ионов кальция широко используется хемилюминесценция белка, выделенного из медузы Aequorea . Этот фотопротеин, называемый экворином, содержит в себе ковалентно связанный люциферин, который в присутствии ионов Са 2+ подвергается химическим превращениям с образованием продукта в возбужденном электронном состоянии. Вследствие малой инерционности и высокой чувствительности биолюминесцентный метод весьма эффективен при изучении высвобождения и связывания Са 2 + в биологических системах, например во время мышечного сокращения. При этом экворин добавляют прямо к изучаемому объекту и по интенсивности биолюминесценции следят за динамикой изменения содержания свободного кальция.
Биолюминесценция светящихся бактерий. К числу светящихся относится немного видов бактерий. Хемилюминесцентная реакция, непосредственно сопровождаемая свечением, катализируется ферментом - бактериальной люциферазой и включает в себя процессы окисления восстановленного флавинмононуклеотида ФМН-Н 2 до ФМН и одновременно алифатического (С 14 ) альдегида до миристиновой (С 14 ) кислоты. Эта реакция протекает, по-видимому, через стадию образования пероксида флавинмононуклеотида:
ФМН-Н 2 + E + O 2 -> Е-ФМН-Н 2 -ООН + RCH 0 . -> 1ЮЗН-Е-ФМН-Н 2 -ООН -> -> ЖХЮН + Е-ФМН-НОН* ->
-> RCOOH + Е + ФМН + Н 2 О + фотон (490 нм).
Здесь Е - люцифераза, ООН - гидроперекисная группа, RCOH - алифатический альдегид, RCOOH - жирная кислота, образующаяся при окислении альдегида.
В последние годы получают все большее распространение биохимические анализы, в которых в качестве тест-объекта используют целые бактериальные клетки (в суспензии), экстракты светящихся бактерий, изолированный фермент - люциферазу. В таблице приведены некоторые примеры использования бактериальной биолюминесценции в биохимических анализах.
Прежде всего измерение биолюминесценции бактерий можно использовать для определения низких концентраций кислорода. Дело в том, что при отсутствии кислорода фотобактерии не обладают свечением, свечение усиливается пропорционально концентрации кислорода в среде в интервале концентраций О 2 от 2 х 10" 8 до 5 * 10" 6 моль/л.
Можно использовать светящиеся бактерии и в качестве лабораторного животного, то есть живых организмов, на которых изучают действие различных токсических веществ. Светящиеся бактерии чувствительны к примесям токсических веществ в воде, и измерение биолюминесценции можно использовать для оценки загрязнения воды токсическими соединениями, например ионами тяжелых металлов. Кроме того, свечение бактерий можно использовать для предварительной оценки эффективности новых антибиотиков.
Но наиболее перспективно применение очищенных препаратов бактериальной люциферазы. Фермент, очищенный от примесей низкомолекулярных соединений, обладает способностью к излучению света лишь в присутствии всех трех субстратов: кислорода, ФМН-Н 2 и длинноцепочечного альдегида (с длиной цепи не менее восьми углеродных атомов). Добавив к изолированной бактериальной люциферазе ФМН-Н 2 , исследователь получает высокочувствительную систему для определения алифатических альдегидов. К их числу принадлежат, в частности, половые гормоны насекомых, феромоны, которые обнаруживаются в количестве 10" 14 моля, что позволяет изучать метаболизм этих веществ у одной особи. В медицине найдет широкое применение анализ содержания ФМН и ФАД, основанный на биолюминесцентном определении ФМН-Н 2 , образующегося при их предварительном восстановлении.
Наиболее широкое применение в биохимических и клинических лабораторных анализах обещает получить препарат, состоящий из смеси двух компонентов (ферментов): бактериальной люциферазы и НАДН: ФМН-оксидоредуктазы.
В отечественном наборе КРАБ (комплект реактивов для анализа биолюминесценции) содержатся люцифераза и оксидоредуктаза, выделенные из биомассы светящихся бактерий. Добавив к препарату в присутствии С 15 -альдегида НАДН, можно получить высокочувствительный реактив для определения ФМН (без его предварительного восстановления):
-»- НАД + ФМН-Н 2 Люцифераза , . Биолюминесценция.
Наоборот, если добавить к смеси люциферазы и оксидоредуктазы альдегид и ФМН, то такая смесь может использоваться как биолюминесцентная тест-система для количественного определения НАДН в биологических материалах (схема реакций такая же).
Удлиняя цепочку биохимических стадий, предшествующих биолюминесценции, можно получить все новые аналитические возможности. Для определения активности ферментов дегидрогеназ или (альтернативно) концентрации субстратов этих ферментов используется следующая тест-система:
Люцифераза + Оксидоредуктаза + Альдегид + ФМН + НАД +
В присутствии субстрата какой-либо дегидрогеназы, например лактата, можно определять по биолюминесценции активность соответствующей дегидрогеназы (в нашем примере активность ЛДГ, лактатдегидрогеназы):
Субстрат + НАД+ Дегидрогеназа . НАДН
и далее по схеме, приведенной выше.
В присутствии изолированной дегидрогеназы можно определять концентрацию субстрата этого фермента в интересующей нас химической или биохимической системе (схема реакций та же). Во второй главе рассмотрим активированную хемилюминесценцию как инструмент медико-биологических исследований.
Глава 2 . АКТИВИРОВАННАЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ И БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ КАК ИНСТРУМЕНТ В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Хемилюминесценцией (ХЛ) называется свечение, сопровождающее некоторые биохимические реакции. Клетки и ткани животных обычно излучают свет в процессе своей жизнедеятельности, но такой слабый, что его долгое время не удавалось обнаружить (излучение назвали сверхслабым свечением [1]). Это собственное свечение клеток и тканей обусловлено в основном реакциями с участием свободных радикалов, и его измерение используется в научных исследованиях и в целях лабораторного клинического анализа в тех случаях, когда важно обнаружить и изучить появление свободных радикалов в живых системах. Низкая интенсивность свечения служит, однако, серьезным препятствием для подобных исследований. Низкая интенсивность собственной хемилюминесценции [1, 2] оказалась главным и пока непреодоленным препятствием на пути к ее широкому использованию в аналитических целях. Значительное распространение получило, однако, измерение хемилюминесценции в присутствии определенных соединений, которые в отечественной литературе называют активаторами, а за рубежом - усилителями (enhancer) хемилюминесценции. По механизму действия активаторы распадаются на две четко различающиеся группы - химические и физические [3].
Химические активаторы хемилюминесценции - это соединения, вступающие в химические реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом свечение связано с переходом молекул в основное состояние, что приводит к высвечиванию фотонов:
Здесь R - радикал, A - химический активатор, P - ответственный за хемилюминесценцию продукт превращения молекулы активатора в возбужденном (P*) и основном (P A ) электронных состояниях. Хорошо известными представителями таких активаторов могут служить люминол (3-аминофталевый гидразид, см. рис. 1) и люцигенин - бис(Т>Г-метилакридиний). На рис. 1 дана упрощенная схема превращений люминола в присутствии радикалов кислорода [4]. Под действием окислителя (в данном случае радикала гидроксила) происходит образование радикала люминола, который затем вступает в реакцию с супероксидным радикалом, образуя внутреннюю перекись (диоксид). Ее разложение приводит к образованию возбужденной молекулы 3-аминофталата. Переход этой молекулы в основное состояние сопровождается испусканием кванта света.
Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но тем не менее многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. В основе их действия лежит физический процесс переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции на активатор:
R -- PA - - P + фотон 1 (неактивированная ХЛ),
P* + A -> P A + A* (перенос энергии), A* -»- A + фотон 2 (активированная ХЛ).
Интенсивность свечения при реакциях хемилюминесценции (7 хл ) зависит от трех параметров: скорости химической реакции, которая сопровождается свечением (и хл ), вероятности образования молекулы продукта в электронно-возбужденном состоянии (квантовым выходом возбуждения, л exc ) и вероятности высвечивания фотона при переходе возбужденной молекулы продукта в основное состояние (квантовый выход люминесценции, л 1шп ) [4]:
Химические активаторы свечения по существу направляют реакции свободных радикалов в новое русло, поскольку реагируют с радикалами с образованием возбужденных молекул продуктов этой реакции. Свечение при этом имеет высокую интенсивность, поскольку все три сомножителя в уравнении в этих реакциях довольно велики. Физические активаторы хемилюминесценции (в англоязычной литературе называемые сенсибилизаторами - sensitizers) не влияют на ход химических реакций и увеличивают интенсивность люминесценции за счет физического процесса переноса энергии на молекулу активатора, которая обладает высоким квантовым выходом люминесценции.
Иными словами, они увеличивают только величину квантового выхода испускания фотона возбужденной молекулой продукта (т| 1шп ). В обычных реакциях свободных радикалов эта величина довольно мала, всего десятые или даже сотые доли процента, отчего и сама неактивированная хемилюминесценция имеет очень низкую интенсивность, и ее часто называют сверхслабым свечением. Но если все молекулы продукта передадут энергию электронного возбуждения на молекулы активатора, то интенсивность свечения будет определяться уже квантовым выходом люминесценции активатора, который в идеале приближается к единице. Интенсивность свечения увеличивается при этом на 3-4 порядка.
К физическим активаторам можно отнести некоторые люминесцирующие соединения, применяемые для усиления ХЛ при цепном окислении липидов. Дело в том, что, несмотря на полезность получаемой информации, измерение этой хемилюминесценции пока еще не стало рутинным лабораторным методом в значительной мере из-за ее низкой интенсивности. Поэтому ведется поиск веществ, усиливающих липидную ХЛ. Оказалось, что некоторые красители и комплексы редкоземельных элементов обладают способностью многократно усиливать интенсивность такой хемилюминесценции (табл. 1). Самым эффективным активатором оказалось производное кумарина, применяемое при создании лазеров под названием С-525, которое усиливало хемилюминесценцию, сопровождающую цепное окисление липидов, более чем в 1500 раз, никак не влияя при этом на ХЛ при взаимодействии радикалов кислорода (гидроксила и супероксида). Формула этого вещества приведена ниже.
В случае цепного окисления липидов образуются возбужденные молекулы кетонов (L=O)*. В присутствии кумаринов происходит перенос энергии на это ярко люминесцирующее соединение и интенсивность хемилюминесценции резко возрастает:
L=O* -> L=O + hn 1 (слабое свечение; л 1 um = 10" 4 ),
L=O* + А -- L=O + А* (перенос энергии),
А* -«- А + hv A (яркое свечение; л 1 um = 10" 1 ).
Распространенное применение хемилюминесценция находит в биологических анализах, подробно рассмотрим это направление в главе 3.
Глава 3 . ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АКТИВИРОВАННОЙ ХЛ В БИОХИМИЧЕСКИХ АНАЛИЗАХ
Пероксид водорода постоянно образуется в организме человека, хотя и в небольших количествах. Само по себе это относительно безобидное соединение, но в присутствии ионов металлов переменной валентности (железа, меди, марганца, хрома) или геминовых соединений из пероксида водорода (H 2 O 2 ) образуется разрушительный гидроксильный радикал ('OH), способный вызывать мутации, инактивировать ферменты и повреждать биологические мембраны. В присутствии люминола гидроксильный радикал вступает с ним в химическую реакцию, что приводит к яркому свечению, связанному с реакциями люминола (см. рис. 1). По этой причине хемилюминесценцию в присутствии люминола часто используют для определения в биологических средах малых количеств геминовых соединений, металлов переменной валентности, а также вообще способности биологического материала разлагать перекись водорода с образованием радикалов. Приведем некоторые примеры.
У больных инфарктом миокарда в моче могут появиться небольшие количества миоглобина. Гемсодержащие соединения, к которым относится миоглобин, дают яркое свечение в присутствии перекиси водорода и люминола в сильно щелочной среде. Свечение мочив этих условиях может служить одним из показателей инфаркта у больного (Барон, 1985, цит. по [1]).
На поверхности свежей раны выделяется жидкость, называемая раневым экссудатом. В ней содержится каталаза - фермент, разлагающий перекись водорода без образования свободных радикалов. Наряду с этим жидкость содержит другие гемсодержащие белки и ионы железа, которые катализируют разложение перекиси водорода с образованием свободных радикалов кислорода, токсичных для клеток окружающей ткани. При добавлении к раневому экссудату перекиси водорода с люминолом наблюдается хемилюминесценция, тем более сильная, чем больше радикалов образуется при разложении перекиси. Таким образом, хемилюминесценция показывает, сколько токсичных радикалов образуется в экссудате. В свежей ране таких радикалов много, а по мере заживления их становится все меньше и меньше. Ускорение заживления ран за счет применения лекарственных средств или облучения светом лазера сопровождается соответственным снижением хемилюминесценции экссудата. Таким образом, этот метод позволяет врачу контролировать эффективность лечения и вносить коррективы в сроки и дозы применения лечебных процедур [5].
Люминесценция фагоцитов. Некоторые клетки организма: гранулоциты и моноциты в крови и тканевые макрофаги - в целях борьбы с чужеродными клетками, такими, как болезнетворные бактерии и грибы, выделяют так называемые активные формы кислорода, к которым относятся супероксидный радикал (*O2), пероксид водорода (H 2 O 2 ), радикал гидроксила (*OH). При этом наблюдается очень слабая хемилюминесценция, которая усиливается в тысячи раз в присутствии люминола (или люцигенина) [2-4]. На рис. 2, а в качестве примера показана хемилюминесценция клеток крови при действии на кровь кратковременных электрических импульсов, вызывающих увеличение проницаемости клеточных мембран и стимуляцию выделения клетками активных форм кислорода. Такие же хемилюминесцентные ответы можно получить, если добавить к лейкоцитам крови суспензию бактерий, изолированные оболочки дрожжевых клеток, кристаллы кварца или сульфата бария, а также определенные химические соединения. Все эти агенты получили собирательное название стимулов. Стимулированная ХЛ клеток в присутствии люминола - ценный показатель функционального состояния фагоцитов крови и тканей, их способности производить при необходимости активные формы кислорода, то есть выполнять свою защитную функцию. Эта способность обычно усиливается при возникновении в организме очагов воспаления (например, после инфаркта миокарда) и в других случаях.
Наоборот, при длительном недостатке кисло-облучение крови ультрафиолетовым светом (УФ-ОК) оказалось малоэффективным, если верить данному показателю. Как видно на рис. 2, б, у больных семейной гиперхолестеринемией (при этой наследственной болезни в крови содержится много холестерина и имеется выраженная предрасположенность к раннему развитию атеросклероза) ХЛ-ответ клеток на стимул почти в четыре раза превышает ответ клеток здоровых доноров. Назначенное лечение - Хотя люминесценция люминола - весьма чувствительный метод обнаружения радикалов кислорода, метод не очень специфичен. Свечение наблюдается при действии на люминол не только радикалов гидроксила, но и при действии гипохлорита и других окислителей. Заметный вклад в ХЛ-ответ клеток вносит выделение окиси азота: ингибитор NO-синтазы (фермента, катализирующего образование окиси азота в клетках) уменьшает интенсивность свечения нейтрофилов почти вдвое.
Большей избирательностью отличается люцигенин, свечение которого происходит при восстановлении красителя супероксидными радикалами. Это соединение часто используют для изучения образования супероксидных радикалов различными клетками и биохимических реакциях в пробирке.
Хемилюминесцентный иммунный анализ. По идеологии хемилюминесцентный иммунный анализ не отличается от радиоиммунного, с той только разницей, что вместо радиоактивно-меченых субстратов или антител используют субстраты и антитела, меченные соединением, которое вступает в реакции, сопровождающиеся хемилюминесценцией, в присутствии перекиси водорода и катализатора (обычно это фермент пероксидаза). Хемилюминесцентными метками (ХЛ-метками) чаще всего служат низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и люцигенину, такие, как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры акридиния и др. Присоединение хемилюминесцентной метки производится либо к антигену, то есть низкомолекулярному соединению, либо к антителу на этот антиген. В первом случае метод называется CIA (Chemiluminescent Immuno Assay), во втором - ICMA (Immuno Chemilumino Metric Assay). По-русски это соответствовало бы ХИА (хемилюминесцентный иммунный анализ) и ИХМА (иммуно-хемилюминометрический анализ). Оба метода направлены на определение биологически важных низкомолекулярных соединений (например, гормонов) в тех концентрациях (как правило, очень низких), в которых они встречаются в биологических объектах.
Очень важно, что пропорция между меченым и немеченым иммунными комплексами зависит от того, сколько меченого антигена было добавлено (A*) и сколько немеченого находилось в исследуемой пробе (A), а именно чем больше было немеченого антигена, тем меньше доля меченых антител. Теперь остается очистить смесь иммунных комплексов и определить количество А*-анти-А по хемилюминесценции. Интенсивность ХЛ будет тем меньше, чем больше было немеченых антигена А (то есть анализируемого вещества) в исследуемой пробе. Чтобы анализ был количественным, предварительно строят калибровочную кривую, то есть измеряют зависимость интенсивности ХЛ в конечной пробе от концентрации стандартного раствора изучаемого вещества А. Затем измеряют интенсивность ХЛ в растворе с неизвестной концентрацией антигена (А), повторяя те же процедуры, и по калибровочной кривой находят концентрацию А.
При использовании метода ГСМА (рис. 4, Б ) берут избыток ХЛ-меченого антигена (анти-А*) и добавляют к нему раствор с изучаемым веществом (А). Образуется ХЛ-меченый иммунный комплекс:
Остается отделить иммунные комплексы от других участников реакции и измерить интенсивность ХЛ. В данном случае она будет тем выше, чем больше было анализируемого вещества А в пробе. Для количественного анализа и здесь предварительно строят калибровочную кривую.
В обоих методах одна из практических трудностей - это очистка иммунных комплексов. Она решается также методами иммунохимии. Детали этой техники мы рассматривать не будем, но один из подходов заключается, например, в использовании порошка сорбента (см. рис. 4, В ), к поверхности которого пришиты (то есть присоединены ковалентной химической связью) антитела к анти-А (назовем их анти-анти-А). В присутствии растворенных комплексов (А-анти-А и/или А*-анти-А) образуется тройной комплекс (сэндвич): (анти-анти-А)-(анти-А)-А и/или (анти-анти-А)-(ан-ти-А)-А*. Адсорбент можно осадить и затем определить в осадке (после дополнительных обработок) количество меченого антигена.
Возможности технологии хемилюминесцентного анализа в хирургической клинике рассмотрены в главе 4.
Глава 4. Современные возможности технологии хемилюминесцентного анализа в хирургической клинике
свечение хемилюминесценция биолюминесценция
История изучения хемилюминесценции (ХЛ) биологических объектов насчитывает около пяти десятилетий с тех пор, как итальянские астрономы Л. Колли и У. Фаччини обнаружили свечение непигментированных тканей растений. Если в первых работах интерес к ХЛ был связан, в основном, с поисками принципиальных доказательств образования возбужденных и свободнорадикальных состояний в темновых биологических реакциях, то сейчас ХЛ является по существу обычным лабораторным методом, широко используемым в клинике. Успехи в этой области во многом связаны с совершенствованием техники регистрации слабых световых потоков, позволяющей улавливать излучение отдельных клеток и получать микроскопическое изображение свечения [11, 17].
На сегодняшний день химические и физические явления, лежащие в основе превращения энергии биохимических реакций в световое излучение, в основном расшифрованы. Хемилюминесцентная реакция включает следующие основные стадии: а) восстановление одного из участников реакции и окисление второго, приводящее к накоплению химической энергии в системе; б) перенос электрона на один из более высоких энергетических уровней и образование, таким образом, продукта реакции в электронно-возбужденном состоянии; в) высвечивание фотона при переходе молекулы из электронно-возбужденного в основное состояние (люминесценция) [2, 3, 19]. Разнообразие реальных механизмов хемилюминесцентных реакций определяется природой и энергетикой отдельных стадий, структурой реагентов, большим числом промежуточных и конечных продуктов.
Сверхслабое свечение или собственное излучение клеток и тканей практически всегда сопровождает процессы жизнедеятельности и может быть обусловлено тремя типами реакций: реакциями активных форм кислорода (АФК), реакциями цепного (перекисного) окисления липидов, реакциями с участием оксида азота [22]. Главным источником АФК в организме человека и животных служат клетки-фагоциты: гранулоциты, моноциты крови и тканевые макрофаги. Непосредственной причиной собственной хемилюминесценции активированных фагоцитов считают образование синглетного кислорода в реакциях между кислородными радикалами, перекисью водорода и гипохлоритом.
Одной из основных составляющих собственной (неактивированной) хемилюминесценции животных клеток и тканей является свечение, сопровождающее цепное окисление липидов в мембранных структурах клеток и липопротеинах крови. В реакции взаимодействия двух радикалов липопероксида образуются молекулы кетона и кислорода в электронно-возбужденном состоянии, которые затем переходят в основное состояние, испуская квант света (фотон). Увеличение продукции радикалов в системе сопровождается ростом интенсивности ХЛ. Вещества-антиоксиданты, реагирующие со свободными радикалами и тормозящие цепное окисление, одновременно подавляют хемилюминесценцию. При этом подавление собственной хемилюминесценции тканей и клеток антиоксидантами, например токоферолом, указывает на то, что это свечение обусловлено реакциями цепного окисления липидов. С другой стороны, изучая влияние различных природных и синтетических соединений на кинетику ХЛ, можно получать представление о способности этих веществ препятствовать повреждающему действию свободных радикалов [5, 12, 22].
Оксид азота выделяется многими типами клеток и является одним из основных регуляторов внутриклеточных процессов. Участие реакций нитроксида в собственной хемилюминесценции тканей животных было показано в опытах Джулио Терренса и сотрудников, которые изучали свечение перфузируемого легкого. Авторы регистрировали существенное снижение свечения при введении в перфузат нитро-L-аргинина, ингибитора NO-синтазы. Установлено, что источником ХЛ является реакция пероксинитрита - токсичного продукта взаимодействия окиси азота и супероксида, - с белком. Природа процессов, определяющих собственное свечение ткани, может меняться при изменении ее состояния. В опытах того же автора было показано, что у животных с пневмонией ингибитор NO-синтазы слабо влиял на свечение органа, в то время как супероксиддисмутаза и ловушки липидных радикалов вызывали существенное уменьшение интенсивности свечения. Это позволило предположить, что при воспалении на первый план выходят реакции, связанные с активацией клеток-фагоцитов и образованием ими активных форм кислорода, а затем - липидных перекисей, тогда как в норме за свечение ответственны реакции окиси азота.
Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, отличается низкой интенсивностью, что явилось основным препятствием на пути к широкому ее использованию в аналитических целях. Значительное распространение получило измерение хемилюминесценции в присутствии активаторов (индукторов). Химическими активаторами (зондами ХЛ) называют соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом свечение связано с переходом молекул в основное состояние, что приводит к высвечиванию фотонов. Известными представителями группы химических активаторов являются люминол (3-аминофталевый гидразид) и люцигенин [Бис(N-метилакридиний)] [2, 5].
Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но, тем не менее, многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. К ним относятся некоторые люминесцирующие соединения, усиливающие ХЛ при цепном окислении липидов, в том числе родамин Ж, ализариновый красный, конго красный, фуксин кислый, метиленовый голубой, акридиновый оранжевый, некоторые порфирины и редкоземельные металлы. Поиск веществ-активаторов, не оказывающих влияния на ход реакций перекисного окисления, но многократно увеличивающих интенсивность свечения, продолжается в настоящее время.
В широкой клинической практике хемилюминесцентный анализ используется в трех основных вариантах: ХЛ сыворотки крови и других биологических жидкостей, клеточная ХЛ и хемилюминесцентный иммунный анализ.
Индуцированная ХЛ сыворотки крови, по мнению большинства исследователей, является наиболее чувствительным и объективным методом изучения процесса перекисного окисления липидов. Реакции цепного окисления отличаются большой сложностью и включают в себя целый ряд быстропротекающих стадий. Основные участники реакций, свободные радикалы, обычными методами химического анализа определены быть не могут из-за своей крайне высокой реакционной способности и неустойчивости в биохимических системах. Поэтому регистрация интенсивности свечения в режиме реального времени представляет собой ценную информацию для анализа механизма реакций перекисного окисления липидов.
Уровень ХЛ сыворотки крови является отражением подвижного равновесия, объективным интегральным показателем соотношения интенсивности ПОЛ и активности биологических антиоксидантных систем организма. Регистрация ХЛ тканей и биологических жидкостей лежит в основе многообразия методов выявления ранних стадий нарушения защитно-приспособительных реакций организма, диагностики состояния предболезни, определения прогноза и тяжести заболевания, выбора этиопатогенетического воздействия и контроля состояния пациента [1, 11, 15, 18].
Концентрация свободных радикалов в исследуемом объекте определяется по значению максимальной интенсивности сигнала (I max) и светосуммы (S). Антиоксидантный потенциал пробы коррелирует со скоростью падения кривой хемилюминесценции (tg a) и коэффициентом К, определяемым по соотношению I max/S. При острых воспалительных процессах наблюдается увеличение I max и S, при этом степень увеличения пропорциональна тяжести воспалительного процесса. Снижение значений указанных показателей более чем в два раза регистрируется при наличии злокачественных новообразований [5, 13].
Анализ кинетики хемилюминесцентных реакций различных биологических жидкостей (сыворотки крови, мочи, ликвора, слюны, раневого, плеврального и перитонеального экссудата) позволяет осуществлять дифференциальную диагностику неспецифического воспаления и онкологического процесса, функционального и органического поражения. Так, определение интенсивности ХЛ сыворотки крови лежит в основе экспресс-метода дифференциальной диагностики приступа абдоминальной формы периодической болезни и заболеваний, протекающих с картиной «острого живота», и позволяет уменьшить частоту необоснованных хирургических вмешательств [2, 11, 18].
Существенный интерес представляет изучение влияния на ХЛ разнообразных внешних агентов, обладающих как про-, так и антиоксидантным действием.
Основные направления применения активированной хемилюминесценции курсовая работа. Медицина.
Реферат: Моделирование экономики
Сочинение По Рассказу Недоросль Проблема Воспитания Митрофанушки
Реферат На Тему История Изобретения Бумаги
Реферат: Защита коммерческой информации
Реферат: Древней Греции на рубеже IX VIII вв. до н. э.
Современные Теории Происхождения Нефти Реферат
Сочинение Один День Из Жизни Земледельца
Короткое Сочинение О Марии Из Дубровского
Реферат На Любую Тему По Легкой Атлетике
Реферат: по дисциплине: «Стратегический маркетинг» на тему: «Нобелевские лауреаты, их вклады в развитие экономики рф»
Курсовая работа по теме Технологический процесс изготовления поковки на изделии 'вал гребной'
Быт Славянских Племен Реферат
Реферат по теме В.Г. Распутин 'Живи и помни'
Сочинение Про Архангельский Собор 8 Класс
Реферат: Финансовая результативность как фактор обеспечения финансовой устойчивости предприятия
Дипломная работа по теме Облік фінансових результатів підприємства
Челночный Бег 3х10 М Реферат
Реферат: Allen Ginsberg
Реферат На Тему История Развития Автотранспорта
Реферат: Мотивационная основа воспроизводства интеллектуального капитала
Криминологическая характеристика личности преступника - Государство и право контрольная работа
Государственные и негосударственные пенсионные фонды и основные направления их деятельности - Государство и право курсовая работа
Технология анализа конкурентов - Маркетинг, реклама и торговля курсовая работа