Наркотики бесплатные пробы Виго

• • • • • • • • • • • • • • • • •

• • • • • • • • • • • • • • • • •

Гарантии ❗ Качество ❗ Отзывы покупателей ❗

• • • • • • • • • • • • • • • • •

👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇

Наши контакты:

▶️▶️▶️ (НАПИСАТЬ ОПЕРАТОРУ В ТЕЛЕГРАМ)️ ◀️◀️◀️

👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆

• • • • • • • • • • • • • • • • •

🚩 ИСПОЛЬЗУЙТЕ ВПН (VPN), ЕСЛИ ССЫЛКА НЕ ОТКРЫВАЕТСЯ!

🚩 В Телеграм переходить только по ссылке что выше! В поиске тг фейки!

• • • • • • • • • • • • • • • • •

Наркотики бесплатные пробы Виго

Здесь мы опишем клеточную цитотоксичность и один раунд анализы инфекционности, которые позволяют для быстрого и точного скрининга соединений с целью определения их клеточную цитотоксичность CC 50 и значения ИК 50 против WT и прочной ВИЧ-1 препарата. Хотя ряд анти лекарств против ВИЧ были одобрены, все еще существуют проблемы с токсичностью и лекарственной устойчивости. Это показывает необходимость идентификации новых соединений, которые могут ингибировать инфекцию общими лекарственной устойчивостью штаммов ВИЧ-1 с минимальной токсичностью. Здесь мы описываем эффективного анализа, который может использоваться для быстрого определения клеточной цитотоксичности и эффективность соединения против дикого типа и мутантных штаммов вируса. Желаемый целевой линии клеток высевали в луночный планшет с и после 24 ч инкубации последовательно разведения тестируемых соединений добавлены. Никаких дополнительных манипуляций не требуется для сотовых цитотоксичность; для анти ВИЧ анализах заранее определенное количество либо WT или лекарственной устойчивостью ВИЧ-1 вектора, который экспрессирует люциферазы добавляют к клеткам. Цитотоксичность измеряется с помощью АТФ зависимую люминесценции анализа и воздействие соединений на инфекционность измеряется определением количества lucifeRase в присутствии или в отсутствие предполагаемых ингибиторов. Этот скрининг анализ занимает 4 дня, чтобы закончить и несколько соединения могут быть подвергнуты скринингу параллельно. Эта техника обеспечивает быстрое и точное измерение эффективности и токсичности потенциальных анти соединений ВИЧ. Наличие препаратов, ориентированных на несколько важных шагов в ВИЧ-1 жизненного цикла вируса привело к комбинированной лекарственной терапии так называемый высокую активность антиретровирусная терапия, или ВААРТ , что позволило значительно улучшить лечение ВИЧ-1 инфекции, а также долгосрочное выживание пациентов. ВААРТ, которая обычно использует комбинации двух нуклеозидов обратной транскриптазы RT ингибиторов и либо ингибитор протеазы или не ингибитора РТ нуклеозид, в настоящее время преобразован смертельную болезнь, в длинной жизни состоянии Однако, несмотря на многочисленные успехи ВААРТ в устойчивой подавления вирусной репликации, он имеет свои ограничения. Есть проблемы с наркотиками токсичности и с появлением штаммов устойчивы наркотиков. Сопротивление может возникнуть для всех утвержденных анти лекарств против ВИЧ, в том числе новых утвержденных препаратов, предназначенных ВИЧ интегразы ПО. Когда мутации возникают в генах, кодирующих мишеней анти ретровирусов, небольшая часть этих мутаций приведет к снижению восприимчивости вирусного штамма к препаратам. Чтобы избежать развития лекарственной устойчивости, концентрации препарата должна поддерживаться на уровне, который полностью подавляют репликацию ВИЧ. Несоблюдение лечебного режима усугубляет проблему, и может привести к быстрому развитию резистентности Хотя концентрации препарата может варьироваться у пациентов из-за отличающейся поглощения, обмена веществ, распределения и уровней экскреции, высокие концентрации препарата может привести к токсичности Поскольку терапия продолжается в течение жизни пациента, существуют серьезные проблемы безопасности о долгосрочной токсичности анти retrovirals. Анти retrovirals, обычно используемые в ВААРТ может иметь неблагоприятные последствияй были случаи, когда побочные эффекты были опасными для жизни Проблемы пациентов сталкиваются с развитием резистентности и токсичности объясняют необходимость разработки новых лекарств, которые эффективно блокируют репликацию общих лекарствам штаммов вируса практически без долгосрочного токсичности. Таким образом, существует потребность в анализе, который может скрининга соединений, которые блокируют основные этапы в жизненном цикле вируса быстро. Здесь мы описываем эффективного анализа, который может использоваться для оценки цитотоксичности в соединений и их способностью блокировать репликацию как дикого типа и штаммов ВИЧ с лекарственной устойчивостью быстро и эффективно. Анализ мы используем похож на анализе, который был разработан для выявления лекарственной устойчивости вируса, выделенного у больных Хотя анализ может быть использован без модификации для скрининга соединений, которые могут блокировать обратную транскрипцию ВИЧ, мы будем DescrМБП с использованием анализа для оценки В ингибиторы. В является важным вирусный фермент, который вставляет вирусной ДНК в клеточный геном Хотя ряд перспективных в ингибиторов в настоящее время разрабатываются, некоторые из которых в настоящее время проходят клинические испытания, только Isentress 20, 21 также известный как Ралтегравир или RAL и совсем недавно, элвитегравира ГО 22 и Dolutegravir DTG 23 закончились утвержден FDA. Эти соединения являются активными и против ВИЧ B и не являющихся B подтипов в клеточной культуре и больных 24, Примечание: эффект каждого соединения по репликации вируса корректируется путем нормализации до уровня репликации, полученной в отсутствие какого-либо соединения. Если анализ рис. Если активность люциферазы не превышает 0,1 Относительная люциферазы единиц RLUS во всем диапазоне концентраций, это обычно означает, что соединение убил клетки. Если данные люциферазы больше или равна 2,0 RLUS во всех серийных разведений, то соединения не были способны ингибировать ВИЧ-1 инфекции у испытанных концентрациях. Построение концентрацию соединений по сравнению процента ингибирования активности люциферазы в Kaleidagraph табл. Рисунок 1. Подготовка ВИЧ-1 вирусные штаммы и установки клеточной цитотоксичности и один тур анализы в отношении инфекционности. На стадии 1 T клетки трансфицировали pNL4. На шаге 2, HOS клетки высевают в луночный планшет и инкубировали в течение 24 часов. Затем клетки предварительно инкубировали с серийными разведени ми тестируемых соединений в течение 3 часов, а затем инфицируют вирусом или WT или лекарственной устойчивостью. После 48 ч инкубации активность люциферазы измеряют. Наркотиками Скрининг серийного разведения Prototype. Более жесткими скрининга включает 11 серийных разведений, которые обычно начинаются в 10 мкМ и заканчиваются на 0, мкМ. Серийные разведения готовятся 10x; Есть мкл клеток и мкл вируса в каждой лунке. В этом объеме и в соответствии этих расчетов, серийные разведения будет достаточно для 3 рядов целой луночного планшета. На цитотоксичность готовятся аналогично; однако серийные разведения 11 начинаются от мкм и заканчиваются в 0,05 мкм. Только 11 мкл разведений в лунки добавляют в пластине, которые содержат мкл клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Таблица 2. Люциферазы сигнала считывания данных и определение процента ингибирования активности люциферазы. Таблица данных показывает типичный набор люциферазных данных для успешного соединения. В таблице также показаны дополнительные расчеты, необходимые для определения процента ингибирования активности люциферазы и CC 50 и IC 50 значений. Таблица 3. Линейная регрессия Анализ данных таблицы. Графические диапазон концентраций, используемый по отношению к процент ингибирования активности люциферазы в Kaleidagraph будет производить соответствующие кривые ингибирования. Часть B, Кривые ингибирования определены три параметрическихсигмоидальная функция и нужным в данных по линейной регрессии анализирует Опишем быстрый, эффективный и воспроизводимый анализ, который может быть использован для скрининга соединений на цитотоксичность и для их способности ингибировать репликацию как WT и прочной ВИЧ-1 препарата. Способность быстро идентификации соединений и проверить их эффективность и цитотоксичность имеет решающее значение в развитии новых и улучшенных препаратов против ВИЧ После соединения свинца идентифицированы, аналоги соединения свинца могут быть изготовлены и испытаны с использованием того же анализа. Анализ является относительно простым. Есть как положительные, так и отрицательные элементы управления, которые позволяют пользователю диагностировать наиболее распространенные проблемы токсических соединений, проблемы с вектором складе. Использование трех экземплярах множества скважин без добавления соединения показывает, что вирусная инфекция произошла. Тот факт, что цитотоксичность измеряется в качестве независимого анализа избегает неправильной интерпретации снижение люциферазы, вызванного цитотоксичности в качестве специфического эффекта на вирусную репликацию. Критические шагив протоколе готовят пластины таким образом, что клетки равномерно распределены в лунках, что скважины иметь соответствующие концентраций тестируемых соединений, добавляя такое же количество вируса в каждой из лунок, и измерения активности люциферазы в определить CC 50 и IC 50 значения. Анализ является безопасным, количественный, и воспроизводимым. Анализ безопасно, потому что вектор является репликация неисправен. Анализ количественный и воспроизводимым, поскольку она основана на одном круглого вектора, который экспрессирует люциферазы, который может быть оценена точно и удобно. В нескольких круглого анализа в репликации вируса, измеренная ИК 50 зависит от количества вирусных жизненных циклов; это особая проблема, когда анализы включают в себя как WT и лекарственной устойчивостью вирусов, которые могут иметь значительно различные возможности репликации. Там было несколько ферментативные анализы сообщалось ранее, что можетбыть использованы для выявления ингибиторов в. Анализы, которые включают в реальном времени технологию PCR для измерения интегрированную ДНК требуют очищенные рекомбинантные белки ы , и, в общем, и более трудоемким и дорогим 36, Хотя можно использовать ферментативные анализы для измерения воздействия соединений на других вирусных ферментов RT и протеазы , каждый фермент требует свою собственную систему анализа. Один круглый вектор анализ, как описано, может быть использован, без изменений, для скрининга ингибиторов обратной транскриптазы. Аналогичный анализ может быть использован для скрининга ингибиторов протеазы; Однако в ингибитора протеазы анализе соединения должны быть добавлены к клеткам, используемых для получения векторов. Связанных анализ, используя различные клетки и векторы, также могут быть использованы для выявления конверте ENV и ингибиторов запись слияния ВИЧ. Наконец, анализ может быть использован, в увеличенном масштабе, с роботизированные распылителей. Таким образом, анализ может быть использован для скрининга больших библиотек соединений против дикого типа и мutant ВИЧ. Однако тот факт, анализ может обнаружить ингибитор репликации ВИЧ, который действует на разных стадиях вирусных точек жизненного цикла до ограничения в интерпретации данных. Сам по себе анализ не определяет, какой этап в жизненном цикле заблокирован соединения. Если возникает вопрос, она может быть решена с помощью время добавления анализов 38, и путем проверки соединение от очищенных рекомбинантных вирусных белков. К сожалению, несмотря на успех анти лекарств против ВИЧ, есть еще проблемы и с сопротивлением и токсичности. В отсутствие эффективного противотанкового вакцины против ВИЧ, существует необходимость не только для разработки новых терапевтических препаратов, которые будут эффективны против существующих устойчивых мутантов наркотиков, но и для развития профилактических препаратов, которые могут уменьшить распространение вируса. Если профилактическое применение анти лекарств против ВИЧ incudes лечение неинфицированных людей, этот подход будет уделять особое бремя на разработке препаратов, которые имеют лIttle или нет долгосрочный токсичность. Это исследование было поддержано исследовательской программы Интрамурального от NCI. Smith, S. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing Подготовка материала по стандартной концентрации 20 мМ. Примечание: любая концентрация выше 10 мМ могут быть использованы. Обеспечить соединения растворяют в ДМСО при интенсивном перемешивании решений несколько раз в течение 15 секунд и инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа. Приблизительно 6 ч после осадка фосфата кальция добавляется, мыть клеток дважды забуференным фосфатом физиологическим раствором PBS и инкубируют в свежей средой в течение 48 часов. Урожай вирус, содержащий супернатантами по извлечением носителя из диаметра ммблюда, уточнить супернатантов от низкоскоростного центрифугирования при оборотах в минуту в течение 10 мин, отфильтровать супернатантами через 45 размер пор мкм шприцевой фильтр, лечить супернатантов с Turbo ДНКазы в течение 30 мин при комнатной температуре и разбавляют супернатанты в СМИ для подготовки в инфекционных анализах. Примечание: количество p24 в супернатанте определяется с помощью p24 иммуноферментного набора для анализа на ВИЧ Концентрацию p24 используется для контроля количества вируса в образце. После 48 ч инкубации клетки собирали, собирали центрифугированием, промывали и ресуспендировали в мкл PBS. Добавить равное количество люминесценции репортера гена анализа реагента и измеряют активность люциферазы, как описано в разделах 5. Исходя из этого, целесообразно разведение вируса может быть сделано, как описано в шаге 4. Соединение скрининг в луночных Экран каждого соединения в трех экземплярах и усреднить результаты. Определите эмпирическую диапазон концентраций быть экранированный. Один набор скважин трех экземплярах должны быть зарезервированы для контроля нет соединения. Наконец, является ли он или клеточную цитотоксичность анализ инфекционности будет диктовать если вирус добавляется. Готовитьсерийные разведения от 20 мМ маточного раствора. Концентрации выбирают в зависимости от эмпирически определенной области концентраций, подлежащего испытанию как показано в Таблице 1. Подготовьте разведения в СМИ в 10 раз конечная концентрация желании, то есть, если конечная концентрация будет мкм, сделать рабочую акции 1 мм. Примечание: соединения с IC 50 с выше мкм обычно не хорошими кандидатами для разработки лекарств. На начальных анализов мы испытаний соединений только против вектора мас. Перспективные соединения, которые эффективно подавляют вектор WT затем испытывают против панели лекарственной устойчивостью мутантов. Удалить луночных с из инкубатора и добавить серийные разведения соединений, которые будут протестированы в лунки в трех экземплярах как показано на рисунке 1, стадия 2. Вернуться луночных с в инкубатор. Инфекционность анализы только. Примечание: это позволяет соединение будет рассмотрен клеток до инфицирования ВИЧ вектора. Подготовка исходного разведения вируса 33, 34 как правило, примерно , который будет производить сигнал люциферазы между 0,,5 относительных люциферазных единиц RLUS в необработанных клетках. Вся пластинка займет около 10 мл DiluВирус Тед. Добавьте мкл вируса в каждой из лунок, с использованием либо 8 или 12 многоканальной пипетки. Примечание: запас разбавление вируса характерно разбавление что будет производить люциферазы сигнал между 0,2 -1,5 RLUS на основе p24 анализа, показывающие, что вирусный концентрация в надосадочной жидкости составляет примерно нг в 1,0 мл. Приготовление и оценка цитотоксичности и инфекционность в луночных Аспирируйте носители из скважин фенол красный в средствах массовой информации может влиять на сигнал люциферазы. Используйте стеклянную пипетку с кончика пипетки мкл, закрепленный на конце. Начало в верхней СМИ и медленно работать вниз к нижнем углу хорошо. Не тратьте слишком много времени на дне колодца, или клетки могут быть удалены из колодца. Это должно быть сделано сразу же после среду удаляют, так что клетки не высыхают. Только для цитотоксичность, добавить 5 мл субстратного буфера от реакции на обнаружение люминесценции АТФ в каждый флакон поставляемой лиофилизированного реагента. Один флакон достаточно для луночный планшет с. Добавить 50 мкл буфера для лизиса клеток от реакции на обнаружение люминесценции АТФ в каждую лунку. Встряхнуть луночного планшета при оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 5 мин с использованием компактного Thermomixer. Взболтать при оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 5 мин с использованием компактного Thermomixer. Инкубируйте пластин при комнатной температуре в течение 20 мин, чтобы дать время для развития сигнала. Читайте пластину а, используя микропланшетного люминометра. Только для анализы в отношении инфекционности, добавляют 10 мл субстратного буфера от гена-репортера анализа люминесценции в каждый флакон подаваемого лиофилизированного реагента. Один флакон достаточно для каждого луночного планшета. Добавить мкл восстановленного люминесценции репортера гена анализа реагента в каждую лунку. Выдержите при комнатной температуре в течение 20 мин, чтобы дать время для развития сигнала. Прочитать луночного планшета с использованием микропланшет-люминометра, как выполняется в разделе 5. Примечание: Процент ингибирования определяется как активность люциферазы в присутствии препарата, разделенной на активность люциферазы в отсутствие лекарственного средства, умноженное на Используйте программу Kaleidagraph получить CC 50 и IC 50 значения Передача, как эмпирически определенный диапазон концентраций и процент ингибирования активности люциферазы в Kaleidagraph. Участок данные с диапазоне концентраций по оси х и процент ингибирования активности люциферазы на оси у. Play Video. Cite this Article Smith, S. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close.

Закладки Кокс Аскона Швейцария