Наркотики бесплатные пробы Брадфорд
Наркотики бесплатные пробы БрадфордНаркотики бесплатные пробы Брадфорд
• • • • • • • • • • • • • • • • •
Наркотики бесплатные пробы Брадфорд
• • • • • • • • • • • • • • • • •
Гарантии ❗ Качество ❗ Отзывы покупателей ❗
• • • • • • • • • • • • • • • • •
👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇
Наши контакты:
▶️▶️▶️ (НАПИСАТЬ ОПЕРАТОРУ В ТЕЛЕГРАМ)️ ◀️◀️◀️
👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆
• • • • • • • • • • • • • • • • •
🚩 ИСПОЛЬЗУЙТЕ ВПН (VPN), ЕСЛИ ССЫЛКА НЕ ОТКРЫВАЕТСЯ!
🚩 В Телеграм переходить только по ссылке что выше! В поиске тг фейки!
• • • • • • • • • • • • • • • • •
Управление ООН по наркотикам и преступности, Международная сеть людей, употребляющих наркотики,. Совместная программа ООН по ВИЧ/СПИД, Программа развития.
Наркотики бесплатные пробы Брадфорд
Представлен протокол по подготовке свободно плавающих срезовых культур из мозга взрослого человека. Протокол представляет собой вариацию широко используемого метода культуры срезов с использованием мембранных вставок. Это простой, экономически эффективный, и рекомендуется для запуска краткосрочных анализов, направленных на разгадать механизмы нейродегенерации за возрастных заболеваний мозга. Organotypic, или срез культур, были широко использованы для моделирования аспектов центральной нервной системы функционирования в пробирке. Несмотря на потенциал среза культур в неврологии, исследования с использованием взрослых нервной ткани для подготовки таких культур по-прежнему скудны, особенно из человеческих субъектов. Использование взрослых человеческих тканей для подготовки среза культур особенно привлекательна для углубления понимания человеческих нейропатологий, так как они имеют уникальные свойства, характерные для зрелого человеческого мозга, не хватает ломтиков, произведенных у грызунов обычно неонатальных нервной ткани. Этот протокол описывает, как использовать ткани мозга, собранные из живых человеческих доноров, представленных на резекцивную операцию на головном мозге, чтобы подготовить краткосрочные, свободно плавающие культуры среза. Также представлены процедуры поддержания и проведения биохимических и клеточных анализов биологии с использованием этих культур. Репрезентативные результаты показывают, что типичная ламинирование корковой линии человека сохраняется в ломтиках после 4 дней in vitro DIV4 , при ожидаемом присутствии основных типов нейронных клеток. Кроме того, ломтики на DIV4 проходят надежную гибель клеток, когда оспаривается с токсичным стимулом H 2 O 2 , что свидетельствует о потенциале этой модели, чтобы служить в качестве платформы в анализсмерти смерти клеток. Этот метод, более простой и экономически эффективной альтернативой широко используемому протоколу с использованием мембранных вставок, в основном рекомендуется для проведения краткосрочных анализов, направленных на распутывание механизмов нейродегенерации за возрастными заболеваниями мозга. Использование человеческих образцов в исследованиях однозначно отличный вариант для изучения патологий человеческого мозга, и современные методы открыли новые пути для надежных и этических экспериментов с использованием пациента полученных тканей. Понимание механизмов, лежащих в основе патологий человеческого мозга, зависит от экспериментальных стратегий, которые требуют большого количества испытуемых. И наоборот, в случае срезаных культур, хотя доступ к пробам человека по-прежнему затруднен, возможность генерации до 50 ломтиков из одного коркового образца частично обходит необходимость найма нескольких добровольцев за счет увеличения количество репликатов и выполненных анализов на собранную ткань В зависимости от особенностей экспериментального дизайна, каждая техника имеет свои преимущества и недостатки. Краткосрочные, свободно плавающие культуры ломтиков из мозга взрослого человека в некоторых случаях выгодно по сравнению с методом, используемым Stoppini и др. В этих условиях использование свободненских культур представляет собой преимущество более простого и экономичного, а также более точного напоминания первоначального состояния тканей человека, чем ломтики, хранящиеся в культуре в течение недель. Несмотря на потенциал среза культур к неврологии, исследования с использованием взрослых нервной ткани для подготовки таких культур по-прежнему скудны, особенно от человека. В этой статье описывается протокол об использовании собранной ткани мозга от живых человеческих доноров, представленных на резекцивную операцию на головном мозге для подготовки свободно плавающих культур среза. Процедуры для поддержания и выполнения биохимических и клеточных анализов биологии с использованием этих культур подробно. Этот протокол оказался ценным для анализа жизнеспособности и нейронной функции в исследованиях механизмов нейропатологии, связанных с взрослой жизнью. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Ткани мозга живых взрослых были получены от пациентов, проходящих резецкую нейрохирургию для лечения фармакорезистентной эпилепсии височной доли рисунок 1 А. ПРЕДУправление: При работе с образцами человека следуйте соответствующим протоколам безопасности, установленным Учреждением. Шаги 7. Критическим аспектом для оценки качества и здоровья культивированных ломтиков является наличие и типичная морфология ожидаемых типов нервных клеток, нейронов и глиальных клеток. Типичная архитектура ламинирования корковой ламинирования человека наблюдалась в ломтике на DIV4, выявленном нейрональной иммуномаркировкой рисунок 2 D. Кроме того, наблюдалось ожидаемое присутствие микроглии и астроглии рисунок 2 B,C. На основе этих результатов, свободно плавающий формат культуры, связанный с уменьшенной толщиной ломтика до мкм по сравнению с широко используемыми мкм при использовании мембранных вставок , способствовал лучшему распространению кислорода и питательных веществ во внутренние клеточные слои в ломтиках, которые ранее были продемонстрированы, чтобы иметь решающее значение для здоровья культурных ломтиков 39 , Количественная оценка клеточной смерти в ломтиках также является ценным подходом в ex vivo моделях нейропатологий, таких как срез культур рассмотрено Lossi et al. В предыдущем исследовании, мы использовали MTT ассседля для определения уровня гибели клеток в течение периода в культуре В дополнение к жизнеспособности, то же исследование также показало, что культурные ломтики до DIV4 сохранили способность выпускать нейротрансмиттеров на KCl-индуцированной деполяризации Здесь, эти выводы были расширены путем изучения нейронов ответ на KCl-индуцированной деполяризации на ЭРК фосфорилирования, центральная киназа, участвующих в таких процессах, как синаптической пластичности и памяти 42 , Наконец, ответ ломтиков на DIV4 на токсичные проблемы была оценена с известным окислительным индуктором стресса, H 2 O 2. Обоснование заключалось в том, что степень смерти клеток должна быть пропорциональна уровню жизнеспособности клеток в культурных срезах. Взятые вместе, массовая гибель клеток наблюдается в DIV5 после H 2 O 2 вызов и KCl индуцированной деполяризации результаты показывают, что сохранившееся общее состояние здоровья ломтиков на DIV4 адекватно реагирует на токсичные стимулы, такие как окислительный Стресс. Рисунок 1 : Сбор образцов, транспортировка, нарезка и культивирование корковой ткани у взрослых людей. Процедура начинается в хирургическом кабинете со сбором корковой ткани из височной лобэктомии для лечения фармакорезистентной эпилепсии A,B. C Фрагмент ткани n No 1 немедленно передается в трубку, содержащую ледяную кислородную транспортную среду см. D В лаборатории, оболятели удаляются с помощью тонкой офтальмологических пинцета. Избыток жидкости высушивается с помощью фильтровальной бумаги, и фрагмент superglued E к диску образца вибратом с белым веществом вниз и pial поверхности вверх. F Использование коммерческой бритья бритвы, образец разрезается на мкм ломтиками, которые собираются с деликатной кистью и переданы обратно в чашку Петри для дальнейшей обрезки избыточного белого вещества и свободные концы не показано до G покрытие и культирование в свободно плавающем формате. H Фрагменты культуры сохраняются жизнеспособными в течение нескольких дней и могут быть использованы в различных экспериментальных протоколов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2 : Морфологический анализ нервных клеток в срезах культур из мозга взрослого человека. Фрагменты были зафиксированы на четвертый день в пробирке. A,B, C Представительные этапы процедуры секционирования до иммуногистохимии. Ткань была окрашена в цифровой цвет для улучшения визуализации. D Нормальное распределение нейронов в корковых слоях римские цифры. E Микроглия и F астроциты также были четко соблюдены n - 1 ломтик на маркировку типа клеток. Все ломтики были получены из ткани от одного донора. Шкала баров мкм. Рисунок 3 : Функциональные и клеточной жизнеспособности анализы во взрослом человеческом мозге срез культур. A Представитель иммуноблот результат, полученный с гомогенатов из одного ломтика. Полученные значения оптической плотности нормализовались массой каждого среза. Изображения представительных ломтиков после инкубации с MtT показаны над решетками. Результаты представлены как средняя погрешность стандартной погрешности из данных, полученных от трех независимых срезов от одного донора. Этот протокол для производства свободно плавающих, краткосрочных срезовых культур является альтернативным методом для культивирования взрослых человеческих неокортикальных ломтиков. Использование образцов из тканей взрослого человека особенно важно для понимания человеческих нейропатологий, из-за уникальных свойств, типичных для человеческого мозга, не хватает ломтиков, полученных из нервной ткани грызунов Кроме того, срез культур из мозга грызунов обычно готовятся из неонатальных, незрелых мозгов, которые являются очень пластиковыми и содержат мигрирующие клетки, которые могут изменить оригинальный кусок cytoarchitecture адаптироваться к среде in vitro 26 , 53 , 54 , Такие пластиковые события приводят к изменениям в схеме, которые следует избегать, когда цель состоит в том, чтобы имитировать состояние in vivo, как заявил Ting et al. Таким образом, хотя метод, посвященный краткосрочной культивирования может первоначально рассматриваться как ограниченный, долгосрочный культивирование не требуется для получения соответствующих результатов во многих экспериментальных конструкций 32 , 33 , 34 , 35, 56, Двумя критическими шагами протокола являются уменьшенная толщина ломтиков мкм и дополнение культуры среды с BDNF. В предыдущей работе 32 , мы показали сохранение жизнеспособности клеток до 4 DIV и обсудили вероятный вклад сокращения толщины ломтика до мкм по сравнению с более часто используемыми мкм ломтиками 12 , В основном, уменьшение толщины ломтиков может способствовать лучшей оксигенации и поглощения питательных веществ в свободно плавающих ломтиках, уменьшая шансы на гипоксию ядра и нейродегенерации 31 , 32 , 57 , 58 , 59, 60 , Кроме того, рекомендуется держать ткани в холодной, насыщенной кислородом носителей из хирургического отделения до нарезки шага на вибратом, учитывая высокий спрос на O 2 со стороны взрослого человека центральной нервной. Дополнение среды с BNDF ранее было замечено, чтобы немного увеличить жизнеспособность у взрослого человеческого мозга ломтики культивируется свободно плавающих 32 , в соответствии с рекомендациями для средних добавок с нейротрофическими факторами другими авторами 62 , В заключение, этот протокол описывает методы для подготовки и запуска анализов с краткосрочными, свободно плавающими срезкультуры из взрослого человеческого мозга. Использование ресектированной ткани человека представляет собой преимущество сохранения цитоархитектуры мозга и местных схем, добавляя трансляционную силу полученным выводам. Кроме того, разрыв использования человеческих образцов из нейрохирургии в нейробиологии может помочь уменьшить потребность в экспериментах на животных. Мы благодарим пациентов и их семьи за пожертвование резецированных тканей для этого исследования. Мы хотели бы отметить поддержку жителей, медсестер, техников и команды CIREP из клинической больницы в Медицинской школе Рибейран Прето, Университет Сан-Паулу, которые помогали на различных этапах этого процесса. Fernandes, A. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Neuroscience. Стерилизовать все хирургические инструменты и вибратом нарезки материала нож держатель, образец диска, буфер лоток в сухой стерилизации духовки для 4 ч при температуре градусов по Цельсию. Стерилизовать чувствительный к температуре материал или оборудование с помощью УФ или гамма-облучения. Стерилизовать средства массовой информации и растворы путем автоматической или фильтрации через 0,22 мкм пор мембраны. Заблокируйте буферный лоток вибратомна к основанию вибратом и добавьте лед, чтобы держать его в холодильнике до получения нарезки раствора и образца, а также на протяжении всей процедуры нарезки. Соберите и транспортировать образец рисунок 1 B немедленно в лабораторию. Погружайте образец в холодный транспортный раствор постоянно пузырится карбогенной смесью. Нарезка Перенесите образец в чашку Петри мм х 20 мм , содержащую нарезку раствора и, с помощью тонких хирургических инструментов, тщательно удалите как можно больше оставшихся олова в образце рисунок 1 D. Выберите лучшую ориентацию образца для производства ломтиков с особыми характеристиками экспериментального дизайна, и с No 24 скальпель лезвие, обрезать плоскую поверхность, чтобы быть основанием приклеены к образцу диска. Используя одноразовую пластиковую ложку и нежные кисти, соберите фрагмент из чашки Петри и сухой лишний раствор с помощью фильтровальной бумаги сухой капиллярностью и не прикасайтесь к фрагменту ткани бумагой. Используя суперклей, прикрепите ткань к диску образца вибратом, пока он не прочно прилип нет к диску и в контакте с блоком агарозы рисунок 1 E. Поместите диск образца вибратом с правильно прикрепленной тканью в буферный лоток вибратом, наполненный нарезным раствором, который должен бурлять в течение всего процесса. Заблокируйте держатель ножа на месте с лезвием бритвы твердо закреплены. Нарезка раствор должен покрывать как образец, так и лезвие, только после этого начинайте нарезку рисунок 1 F. Нарежьте образец на ломтиков мкм. Откажитесь от первоначальных нерегулярных ломтиков. Плита один ломтик в хорошо с помощью кисти Рисунок 1 G. Если в тарелке есть неиспользованные колодцы, заполните их л стерильной воды. На следующем этапе объем средней скважины корректируется до кЛ. Удалите л условного носителя из каждой скважины и добавьте л свежей bDNF-дополненной среды. Повторите процесс средней замены каждые 24 ч, заменив одну треть условного носителя на свежую bDNF-дополненную среду. В ламинарном шкафу потока замените одну треть среды на свежую среду. Вымойте ломтики фосфат-буферированным сольником PBS и перенесите на микротрубку. Тщательно удалите любой оставшийся раствор путем пипетки. Взвесьте микротрубки, содержащие ломтики, чтобы определить массу каждого ломтика это ключ к нормализации полученных показаний абсорбции. Центрифуга при комнатной температуре RT в течение 2 мин при х г. Соберите супернатант и измерьте абсорбцию на уровне нм. Перенесите ломтики из тарелки в микротрубки. На этом этапе, ломтики могут храниться при градусов по Цельсию для последующей обработки. Экстракты centrifuge при 4 градусах по Цельсию в течение 10 мин при х г, собирают супернатант и определяют общую концентрацию белка с помощью метода Брэдфорда. После электрофореза перенесите содержание геля на мембрану нитроцеллюлозы. Показать с предпочтительным субстратом HRP. Имейте в виду, что резекция культивированный кусок является важным шагом к производству как можно больше высококачественного материала, насколько это возможно для морфологического анализа. Фиксация, криозащита и резекция ломтиков Перенесите ломтики из колодцев со средой культуры в новую 24 хорошо пластины, содержащие PBS. Важно, чтобы срезы оставались плоскими до добавления PFA. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия. Инкубировать 48 ч при 4 градусах Цельсия. Установите замораживание микротома до градусов по Цельсию. Подготовьте основание сахарозы на стадии микротома, где следует разместить ломтики рисунок 2 А. Пусть он полностью заморозить и осторожно вырезать некоторые из замороженных сахарозы для получения плоской поверхности, на которой ломтик будет размещен. Поместите каждый ломтик на растянутую пластиковую пленку и используйте кисть, чтобы плоские ткани. Перенесите растянутый срез на замороженную основу сахарозы одним ходом. Выполняйте этот шаг передачи тщательно. Пусть ломтик отдохнуть в течение минут для правильного замораживания. Нарежьте нарезку на 30 мкм секций. Перенесите 30 мкм секций в чашку Петри, содержащую PBS. Переход к гистологии протокола более адекватной экспериментальной конструкции. Для подробной версии протокола, используемого здесь, обратитесь к Horta et al. Первичные антитела, используемые для иммуносохранения, представленные на рисунке 2, включают нейронные ядра NeuN , здоровый зрелый нейронный маркер, глиальный фибрилловый кислотный белок GFAP , маркер асторцитов, ионизированный адаптер кальция Iba-1 и микроглии Маркер. Инкубировать на ночь с первичными антителами под мягким возбуждением при 4 градусах Цельсия. После мытья pbS, инкубировать в течение мин с биотинилатированных вторичных антител под мягким возбуждением на RT. Смонтируйте окрашенные секции на слайдах с микроскопией с покрытием с желатином и дайте им высохнуть. Обезвоживание в этаноле, диафанизировать в ксилене, закончить с монтажом среды Таблица материалов , крышка с крышкой, и изображение. Play Video. Cite this Article Fernandes, A. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close.
Scientific Article | Здесь описан метод для изоляции микрососудов мозга крыс и для подготовки проб мембраны. Этот протокол имеет явное.
Купить Лирику Агуалва-Касен Португалия
Наркотики бесплатные пробы Брадфорд
Наркотики бесплатные пробы Брадфорд
Германия Мюнхен купить Метадон закладки
Bradford and Craig Jones, 'The effect of methamphetamine and heroin price on наркотики для дости- жения существенных результатов. Что касается со.
Бургундия купить Амфетамин закладки
Наркотики бесплатные пробы Брадфорд
Амфетамин купить наркотик Петрозаводск
С тех пор, как в отчетах, опубликованных в и годах, было выявлено 15 возможных ассоциаций «воздействие – результат».
Наркотики бесплатные пробы Брадфорд
Купить Мефедрон Авиньон Франция
Наркотики бесплатные пробы Брадфорд
Наркотики бесплатные пробы Брадфорд