Наркотики бесплатные пробы Больцано
Наркотики бесплатные пробы БольцаноНаркотики бесплатные пробы Больцано
• • • • • • • • • • • • • • • • •
Наркотики бесплатные пробы Больцано
• • • • • • • • • • • • • • • • •
Гарантии ❗ Качество ❗ Отзывы покупателей ❗
• • • • • • • • • • • • • • • • •
👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇
Наши контакты:
▶️▶️▶️ (НАПИСАТЬ ОПЕРАТОРУ В ТЕЛЕГРАМ)️ ◀️◀️◀️
👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆
• • • • • • • • • • • • • • • • •
🚩 ИСПОЛЬЗУЙТЕ ВПН (VPN), ЕСЛИ ССЫЛКА НЕ ОТКРЫВАЕТСЯ!
🚩 В Телеграм переходить только по ссылке что выше! В поиске тг фейки!
• • • • • • • • • • • • • • • • •
Наркотики бесплатные пробы Больцано
Кроме того, мы стремимся оценить эффективность пробиотика для сохранения и колонизации кишечника человека, а также его способность модулировать микробиом кишечника человека. Поскольку это испытание фазы 1, будут набраны здоровые участники, чтобы избежать каких-либо триггеров симптомов целиакии. Образцы фекалий будут собираться в конце каждого периода, в течение которого было проглочено увеличивающееся количество глютена. Остаточное количество глютена в фекалиях будет оцениваться, а фекальный микробиом будет изучаться с помощью анализа метабаркодирования 16S. Метаболом фекалий также будет оцениваться с помощью количественной ПЦР до тех пор, пока сохраняется способность пробиотического препарата к колонизации. Изучите фекальный метаболизм летучие вещества и короткоцепочечные жирные кислоты между группами вмешательства. Мониторинг стойкости и колонизационной способности пробиотического препарата с помощью количественной ПЦР. Эта информация была получена непосредственно с веб-сайта clinicaltrials. Если у вас есть запросы на изменение, удаление или обновление сведений об исследовании, обращайтесь по адресу register clinicaltrials. Как только изменение будет реализовано на clinicaltrials. Эта страница была переведена автоматически, точность перевода не гарантируется. Пожалуйста, обратитесь к английской версии для исходного текста. Потребление глютена распространяется по всему миру, поскольку он является основным пищевым белком, потребляемым в западных диетах до 20 г глютена в день. Но глютен имеет уникальные и необычные свойства. Он устойчив к полному перевариванию в просвете желудка ферментами щеточной каймы желудка, поджелудочной железы и кишечника и восприимчив к посттрансляционной модификации деамидированию трансглютаминазами слизистой оболочки. Помимо частичного переваривания, глютен сам по себе оказывает негативное влияние на значительную часть населения мира, что в основном приводит к проявлениям глютеновой болезни ЦБ или другим связанным с глютеном заболеваниям. Это исследование позволит протестировать in vivo новый мультивидовой пробиотик, который, как было доказано in vitro, расщепляет глютен до неиммунотоксичных пептидов. Статус Завершенный. Условия Пробиотики. Конкретная цель 2: Изучите изменения кишечного микробиома между группами вмешательства и возможную модуляцию Конкретная цель 2: Изучите фекальный метаболизм летучие вещества и короткоцепочечные жирные кислоты между группами вмешательства. Конкретная цель 2: Мониторинг стойкости и колонизационной способности пробиотического препарата с помощью количественной ПЦР. Тип исследования Интервенционный. Регистрация Действительный Фаза Непригодный. В этом разделе приведены контактные данные лиц, проводящих исследование, и информация о том, где проводится это исследование. Места учебы Италия. Исследователи ищут людей, которые соответствуют определенному описанию, называемому критериям приемлемости. Некоторыми примерами этих критериев являются общее состояние здоровья человека или предшествующее лечение. Критерии приемлемости Возраст, подходящий для обучения От 18 лет до 65 лет Взрослый, Пожилой взрослый. Принимает здоровых добровольцев Да. Полы, имеющие право на обучение Все. Описание Критерии включения: здоровые люди; приверженец средиземноморской диеты Критерий исключения: известное медицинское заболевание; симптомы известных заболеваний пищеварительной системы; известный семейный анамнез целиакии CD ; аллергия на пшеницу; и использование рецептурных лекарств включая антибиотики или пробиотики в предыдущие 2 месяца. Как устроено исследование? Количество рук 2. Пятьдесят здоровых добровольцев были случайным образом распределены в пробиотическую группу. Для устранения остаточных следов глютена и аналогичных белков из фекального материала обе группы подвергались безглютеновой диете БГД с 1-го по й день. Через 10 дней начали введение глютена. Комбинированный продукт: Применение пробиотиков и глютен. Пробиотический препарат, включающий многовидовые штаммы Lactobacillus и Bacillus. Пробиотик вводили на исходном уровне и прерывали через 32 дня. В то же время другая рука получала плацебо. Глютен был обеспечен после 10 дней безглютеновой диеты в возрастающих количествах. Двадцать здоровых добровольцев были случайным образом распределены в группу плацебо. Комбинированный продукт: Применение плацебо и глютен. Плацебо вводили на исходном уровне и прерывали через 32 дня. В то же время другая рука получала пробиотик. Первичные показатели результатов Мера результата Мера Описание Временное ограничение Количество гидролизованного глютена в фекалиях с помощью конкурентного антитела Elisa R5 глютен в частях на миллион. Временное ограничение: 6 месяцев. Эффективность разложения глютена пробиотиком будет оцениваться во всех вышеупомянутых временных точках с помощью конкурентного ELISA с использованием антитела R5. Затем концентрация глиадина млн будет преобразована в глютен в соответствии с коэффициентом умножения 2 , указанным производителем. Временное ограничение: 7 месяцев. ДНК образцов фекалий от исходного уровня, периода вмешательства и вымывания будет секвенирована, нацеленная на область V4 гена 16s рРНК, чтобы оценить изменения микробиома кишечника и возможную модуляцию в группе PR из-за вводимой пробиотической смеси. Образцы фекалий в начале вмешательства T1 , в конце вмешательства T5 и после вымывания T6 будут оцениваться на наличие органических летучих соединений с помощью ГХ-МС. Летучие соединения и состав короткоцепочечных жирных кислот будут сравниваться между группами вмешательства PL и PR. Образцы фекалий в начале вмешательства T1 , в конце вмешательства T5 и после вымывания T6 будут оцениваться на наличие короткоцепочечных жирных кислот с помощью ГХ-МС. Исходный раствор, содержащий смесь стандартов SCFA уксусная кислота, масляная кислота, пропионовая кислота, изомасляная кислота и валериановая кислота , будет растворен в сверхчистой воде для получения калибровочной кривой в диапазоне от 1 мкг мл-1 до мкг мл Калибровочная кривая будет построена путем построения нормализованной площади пика в зависимости от концентрации отдельных SCFAs. Стойкость и колонизирующая способность пробиотического препарата с помощью количественной ПЦР количество копий. Временное ограничение: 2 месяца. Для каждого вида, входящего в состав пробиотического препарата, будут использоваться видоспецифичные праймеры. Результаты qPCR порог цикла, CT будут преобразованы в число копий CN на основе стандартных кривых, ранее построенных с использованием серийных разведений ДНК, извлеченных из чистых культур. Здесь вы найдете людей и организации, участвующие в этом исследовании. Спонсор Free University of Bozen-Bolzano. Следователи Главный следователь: Olga Nikoloudaki, Ph. D, Free University of Bolzano-Bozen. Лицо, ответственное за внесение сведений об исследовании, добровольно предоставляет эти публикации. Это может быть что угодно, связанное с исследованием. Эти даты отслеживают ход отправки отчетов об исследованиях и сводных результатов на сайт ClinicalTrials. Записи исследований и сообщаемые результаты проверяются Национальной медицинской библиотекой NLM , чтобы убедиться, что они соответствуют определенным стандартам контроля качества, прежде чем публиковать их на общедоступном веб-сайте. Изучение основных дат Начало исследования Действительный 1 октября г. Первичное завершение Действительный 30 апреля г. Завершение исследования Действительный 31 мая г. Первый отправленный 3 марта г. Впервые представлено, что соответствует критериям контроля качества 22 марта г. Первый опубликованный Действительный 4 апреля г. Последнее опубликованное обновление Действительный 4 апреля г. Последнее отправленное обновление, отвечающее критериям контроля качества 22 марта г. Последняя проверка 1 марта г. Термины, связанные с этим исследованием Ключевые слова Глютен Микробиом кишечника Целиакия. Другие идентификационные номера исследования GlutProbiotic. Изучает продукт устройства, регулируемый Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Еще не набирают. Клинические и микробиологические аспекты применения пробиотиков в нехирургической пародонтальной терапии: рандомизированное контролируемое исследование. Academisch Medisch Centrum - Universiteit van Amsterdam Изучение влияния потребления водного кефира на микробиом кишечника у здоровых взрослых. University of Athens Align Technology, Inc. Влияние пероральных пробиотиков на гигиену полости рта и неприятный запах изо рта у ортодонтических пациентов. Пробиотики Неприятный запах изо рта Осложнение ортодонтического аппарата. Loughborough University Biopolis S. Влияние пробиотиков на физическую работоспособность и восстановление. Эффекты пробиотиков в сочетании с глютамином в профилактике и лечении радиационного проктита. Пробиотики Микробиота кишечника Бифидобактерии Лучевой проктит Глютамин. Пробиотические добавки и физические упражнения в жару. Синдром раздраженного кишечника Пробиотики Колоноскопия Функциональный запор. Пероральные пробиотики при радиационном энтерите II стадии, вызванном одновременной химиолучевой терапией органов малого таза probiotics. Пробиотики регулируют уход за кожей у детей. Переносимость древнего зерна у пациентов с нецелиакической чувствительностью к пшенице. Эффективность L. Plantarum, снижающей уровень холестерина, на биомаркеры кардиометаболического здоровья у пациентов с целиакией ProCoChoL. Gfree - для улучшения уровня сахара в крови и уменьшения воспаления. Universidade do Extremo Sul Catarinense - Unidade Alexandre Faraco. Смесь пробиотиков при целиакии. Исследование введения пробиотиков в иммунотерапии уротелиального рака мочевого пузыря. Введение L. Paracasei Искать похожие исследования Клинические исследования по Пробиотики в Российская Федерация Искать все исследования. Спонсоры и соавторы Shenzhen Kexing Pharmaceutical Co. Ahmed Healthup Sp. Заболевания По алфавиту A-Z По категориям. Редкие заболевания По алфавиту A-Z. Медикаментозные вмешательства По алфавиту A-Z По категориям. Пищевые добавки По алфавиту A-Z По категориям. Места По алфавиту A-Z По категориям. Подпишитесь, чтобы получать уведомления о новых интересующих вас клинических исследованиях. Активный компаратор: Пиар Пятьдесят здоровых добровольцев были случайным образом распределены в пробиотическую группу. Комбинированный продукт: Применение пробиотиков и глютен Пробиотический препарат, включающий многовидовые штаммы Lactobacillus и Bacillus. Плацебо Компаратор: PL Двадцать здоровых добровольцев были случайным образом распределены в группу плацебо. Комбинированный продукт: Применение плацебо и глютен Плацебо вводили на исходном уровне и прерывали через 32 дня. Количество гидролизованного глютена в фекалиях с помощью конкурентного антитела Elisa R5 глютен в частях на миллион Временное ограничение: 6 месяцев. Микробиом кишечника Временное ограничение: 7 месяцев. Стойкость и колонизирующая способность пробиотического препарата с помощью количественной ПЦР количество копий Временное ограничение: 2 месяца.
Петропавловск купить Гашиш Бошки
Использование выбранной смеси пробиотических штаммов для деградации глютена во время пищеварения
Мефедрон купить наркотик Иваново
Наркотики бесплатные пробы Больцано
Накуру купить Марихуана закладки
Наркотики бесплатные пробы Больцано
Купить Лирику Москва Южнопортовый
Вы точно человек?
Костанай купить Амфетамин закладки
Наркотики бесплатные пробы Больцано
Липецкая область купить Меф закладки
Тротуарная плитка
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки ИПСК представляют собой источник конкретного пациента тканей для клинического применения и фундаментальных исследований. Здесь мы представляем подробный протокол для перепрограммирования человека мононуклеарных клеток периферической крови PBMNCs , полученные из замороженных лейкоцитарных пленок в вирусные свободной ИПСК с использованием не-интегрирующие Эписомные плазмиды. Для того чтобы получить клетки, пригодные для клинического применения, трансгенные свободной иПСК должны быть сгенерированы, чтобы избежать трансгена реактивации экспрессии измененного гена и неправильно дифференциацию. Кроме того, очень эффективный и недорогой способ перепрограммирования необходимо получить достаточные ИПСК для терапевтических целей. Учитывая эту потребность, эффективность неинтегрирующих подход эписомными плазмида предпочтительно выбором для IPSC выводе. В настоящее время наиболее распространенный тип батарей, используемых для целей перепрограммирования фибробласты, изоляция которых требуется биопсия тканей, яnvasive хирургическая процедура для пациента. Таким образом, в периферической крови человеческой представляет собой наиболее доступный и наименее инвазивный ткани для производства IPSC. В этом исследовании, протокол экономически эффективным и вирусно-бесплатно с помощью неинтегрирующих Эписомные плазмиды сообщается для генерации ИПСК из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови PBMNCs , полученных из замороженных лейкоцитарных пленок после центрифугирования крови всего и без градиента плотности разделения. В году группа Шинья Яманака 1 продемонстрирована впервые, что соматические клетки взрослых мышей и человека может быть преобразован в плюрипотентных государства эктопической экспрессии четырех перепрограммирования факторов октябрь-4, Sox-2, КФК-4, и C-Мус , генерации так называемых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ИПСК 2. Конкретного пациента иПСК напоминают человеческие эмбриональные стволовые клетки ЭСК в терминах морфологии, распространения и способности различать в трех типов зародышевых клеток- мезодерма, энтодермы и эктодермы , а не хватает этические проблемы, связанные с использованием ЭСК и обход возможно иммунное отторжение 3. Таким образом, иПСК в качестве одного из самых важных источников конкретного пациента клетки для фундаментальных исследований, скрининга наркотиков, моделирования заболевания, оценки токсичности и регенеративной медицины целей 4. Несколько подходы были использованы для генерации IPSC: вирусные векторы, интегрирующие Ретровирус 5, лентивирус 6 , вирусный без учета векторов аденовирус 7 , Сендай-вирус 8, 9 ВАС транспозонов, эписомные векторы 10, белки 11 или доставка РНК Хотя использование вирусных опосредованной методов может привести к высокой эффективности перепрограммирования, вирусные векторы интеграции в геном клеток-хозяев и, следовательно, потенциальным случайным инсерционного мутагенеза, постоянное изменение экспрессии генов, и реактивации молчащих трансгенов во время дифференцировки не может быть исключена Хотя подакцизных вирусные векторы и транспозоны были разработаны, до сих пор неясно ли короткие последовательности вектора, которые неизбежно остаются в трансдуцированных клеток после удаления, и транспозазы выражение, может вызвать изменение в клеткеулар функционировать Несмотря на высокую эффективность перепрограммирования, вирус Сендай представляет собой дорогостоящий подход и сквозные проблемы лицензирования с компанией, которая разработала эту систему есть потенциал, чтобы ограничить его применение в трансляционных исследований. Кроме того, необходимость прямого введения белков и РНК требует многократного перепрограммирования доставку молекул с присущими технических ограничений Это вносит, и общая эффективность перепрограммирование очень низкая Следует отметить, что рентабельные вирусные свободные и неинтегрирующих методы, основанные на использовании Эписомные плазмид успешно отчиталась за перепрограммирования фибробластов кожи В частности, в настоящей работе мы решили использовать коммерческие доступные интеграции, свободной Эписомные плазмиды, как сообщалось ранее 10, На сегодняшний день, фибробласты кожи представляют собой наиболее популярный тип донорских клеток 5. Тем не менее, другие источники клеток были Successfully перепрограммировать в ИПСК, включая кератиноциты 16, костного мозга мезенхимальных стволовых клеток жировой, 17 стромальных клеток 18, волосяных фолликулов 19, и пульпа клетки Выделение таких клеток требуется хирургических процедур, и через несколько недель, необходимых для расширения в пробирке клеток для того, чтобы установить первичной культуры клеток. В этом свете, выбор, начиная тип клеток имеет решающее значение, и это в равной степени важно, чтобы иметь возможность производить ИПСК из легко доступных и менее инвазивных тканей, таких как кровь. ВДело в том, выборки PBMNC имеет то преимущество, что минимально инвазивных, и, кроме того, эти клетки не требуют экстенсивного расширения в пробирке Перед перепрограммированием экспериментов. На сегодняшний день, различные протоколы сообщили, что после разделения PBMNCs градиента плотности могут быть заморожены и разморожены дней до нескольких месяцев после замораживания и расширена в течение нескольких дней, прежде чем перепрограммирования в ИПСК 22, Тем не менее, насколько нам известно, никаких сообщений не описано перепрограммирование PBMNCs из замороженных лейкоцитарных пленок. Важно отметить, что замороженные охристые пальто, собранные без разделения в градиенте плотности представляют собой наиболее общие образцы крови, хранящиеся в крупных биобанках из популяционных исследований, тем самым обеспечивая легкодоступный бассейн материала для производства IPSC, чтобы избежать дальнейшего сбора образца. В этом мы сообщаем впервые поколение вирусных свободной ИПСК из замороженных лейкоцитарных пленок человека, на основе ранее описанной протокола Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Мононуклеарных клеток крови PBMNCs были выделены из периферической крови человека здоровых доноров после подписанных информированное согласие и одобрение этического комитета провинции Южный Тироль. Эксперименты были проведены в соответствии с принципами, выраженными в Хельсинкской декларации. Все данные были собраны и проанализированы анонимно. Примечание: Выполнение изоляции из четырех коммерческих услуг интеграции, свободной Эписомные плазмид, несущих гены плюрипотентности с помощью коммерческого набора для очистки плазмиды и оценить качество очищенных плазмид с использованием анализа в агарозном геле, в соответствии с инструкциями изготовителя. Примечание: В дней после трансфекции, IPSC колонии должны быть готовы к комплектации и replating. В этом исследовании простой и эффективный протокол для генерации свободных вирусных ИПСК по перепрограммированию PBMNCs выделенных из замороженных лейкоцитарных пленок после центрифугирования всей крови и по сравнению с перепрограммирования PBMNCs, полученных после разделения в градиенте плотности сообщается. После оттаивания, изолированные PBMNCs, показывая типичный округлую форму, расширены в определенной культурой крови среды в течение 14 дней рис 1B , а затем трансфицировали Эписомные плазмид. Через дней после трансфекции, небольшие округлые светлые колонии с определенными полями и клеточной морфологией эмбриональных стволовых начинают появляться рисунок 1С. Примерно дней после трансфекции, IPSC колонии становятся очень компактный, с острыми краями, увеличить их размер и готовы для сбора и расширение рис 1D. После шагов первый пассажей проходов ,IPSC колонии поддержания их недифференцированного состояния и показать типичный морфология эмбриональных стволовых клеток-человека. В течение первых проходов, ручной сбор является более эффективным способом по сравнению с расширением фермента диссоциации с целью выбора полностью недифференцированная, компактный и плотно упакованы колоний 2А. Более Увеличение IPSC колонии показаны отдельные клетки в колонии и высокий ядро соотношение цитоплазмы легче наблюдается рис 2б. После первоначального механического сбора, выбранные IPSC клоны будут расширены с использованием фермента диссоциации коллагеназы IV. Через проходов расширения в пробирке, цитогенетический анализ проводится на IPSC колонии. Около 20 метафаз из по меньшей мере двух независимых культур, примерно уровне группы, анализируются и все образцы показывают нормальную кариограмму фиг. Это наблюдение предполагает, что иПСК генетически стабильными. Кормовойэр расширения в пробирке проходов , иПСК характеризуются для экспрессии маркеров стволовости и их плюрипотентность потенциала. После всего лишь 5 пассажей в культуре, экспрессии экзогенных Эписомные трансгенов не может быть обнаружен в ИПСК, что указывает на успешное активацию эндогенных генов плюрипотентных. PBMNCs 5 дней после трансфекции с сильным уровнем экспрессии трансгена, оценивали с помощью специфических праймеров Эписомные для EBNA-1, используют в качестве положительного контроля. PBMNCs, которые никогда не подвергаются плазмидами, несущими 4 экзогенных генов плюрипотентности, используются в качестве отрицательного контроля Fi фигура 3D. Рисунок 1. Протокол для генерации ИПСК из периферической крови человека и клеточных морфологических изменений в ходе протокола. Масштабная линейка мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. Морфология и анализ кариотипа. Типичные изображения IPSC колонии после ручных шагов пассажей. Рисунок 3. Ipsc характеристики: активность щелочной фосфатазы, повторно экспрессии эндогенных генов плюрипотентности ИПСК и оценки трансгенной молчания А и Б Типичные изображения, показывающие положительное окрашивание на щелочную фосфатазу.. Рисунок 4. Иммунофлуоресценции анализ эмбриональных стволовых клеток плюрипотентности маркеров. Ядра контрастно DAPI. Рисунок 5. Рисунок 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этот показатель. Таблица 1: Список Qrt-ПЦР праймеров Primer последовательности, используемые для оценки эндогенной экспрессии генов плюрипотентности, трансгенной молчания и выражения из трех зародышевых слоев маркеров.. В прошлом, единственным способом получения человеческих плюрипотентных стволовых клеток, несущих определенную генетическую мутацию, был завербовать родителей, перенесших доимплантационная генетическую диагностику и произвести эмбриональные стволовые клетки из бластоцисты их выброшенных 31, Использование перепрограммирования подход, исследователи теперь может генерировать ИПСК из пациентов, несущих практически любой генотип. Возможность начать с конкретного пациента клеточной линии и легко доступным источником очень важно, поскольку оно позволяет исследовать патофизиологии расстройств и последующей идентификации новых терапевтических подходов. Использование Баффи пальто вместо градиента плотности, разделенных PBMNCs всехпотоки нам сократить расходы, рабочее время и ручных операций для операторов при обработке образца. Настройка протокола недорогим используя PBMNCs из замороженных охристыми пальто имеет важное значение для исследований с повышенной числа участников и образцов коллекций в многоцентровых исследованиях. Важно отметить, что способность производить ИПСК из замороженных лейкоцитарных пленок позволяет получить доступ к многочисленным замороженных биопроб уже хранящихся в банках крови, используя простой, экономически эффективный и не так много времени метод для сбора образца. Примечательно, мы обнаружили, что все отобранные колонии IPSC получено от обоих типов исходного материала отображения сопоставимых особенностей плюрипотентности и сохранения клеточных и молекулярных сходства с ЭСК, Indicaка успешным IPSC вывод и согласуется воспроизводимость протокола. Кроме того, мы успешно создали иПСК из более чем 10 человека фибробластов кожи и 3 мезенхимальных стромальных клеточных линий как сердечных здоровых доноров и пациентов с сердечной и скелетных мышечных заболеваний , используя этот метод данные не показаны , таким образом, предположить, что описано протокола могут быть использованы для успешного перепрограммирования различных типов клеток. Однако выбор из крови в качестве исходного материала является предпочтительным по сравнению с фибробластами, особенно если учесть, что экстенсивное расширение фибробластов в пробирке может повлиять на эффективность перепрограммирования, на основе фибробластов числом пассажей и пролиферации скоростью 33, Наш протокол также позволяет генерировать трансгенных свободной ИПСК из замороженных лейкоцитарных пленок после минимального времени культуры, тем самым уменьшая около недель время, необходимое для вывода ИПСК по сравнению с другими источниками, такими как Интернетфибробластов. Несмотря на успешное поколение ИПСК из замороженных лейкоцитарных пленок, должны быть рассмотрены в этом протоколе несколько ограничений. Перед перепрограммированием индукции, усиления PBMNCs из замороженных лейкоцитарных пленок может представлять собой важный шаг протокола. Это в основном из-за внутренней биологической изменчивости образцов, но также технических вопросов. Действительно, усиление PBMNCs из замороженных лейкоцитарных пленок является менее эффективным по сравнению с PBMNCs полученных от разделения в градиенте плотности, из-за сильного дехарактера температурной зависимости от ручной изменчивости оператора. В целях повышения воспроизводимости и эффективности PBMNC усиления от замороженных охристыми пальто без разделения в градиенте плотности, использование автоматизированных систем настоятельно рекомендуется собирать Баффи пальто фракций. Для того чтобы получить клинико-класса ИПСК, фидерных свободной культуры может быть Стараяrnative метод для дальнейших исследований. В заключение, этот протокол представляет собой действенный метод для создания ИПСК из легкодоступной пациента источника клеток с большим преимуществом, используя не-интегративный системы, которые потенциально могут быть использованы для вывода клинико-класса ИПСК, не только для моделирования болезней, но Также для будущей персонализированной медицины. Meraviglia, V. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing Процесс в крови в пределах 12 ч после сбора. Соберите облачно Баффи пальто слой между верхней фазе плазмы и нижефазу, содержащую большую часть эритроцитов , содержащий обогащенный PBMNC фракцию мкл в криопробирку трубки. Храните ячейки в жидком азоте в течение более длительных периодов. PBMNCs, полученный после отделения градиента плотности Соберите 12 мл венозной периферической крови в цитрат натрия буфером пластиковую трубку, и магазин при комнатной температуре. Развести крови с стерильной PBS до конечного объема 35 мл. Центрифуга трубки при х г в течение 30 мин при комнатной температуре вротора ведро размахивая, отключение центрифуги тормоза. Аспирируйте верхний, желтый фазы, содержащей плазму и отбросить его. Осторожно, передать непрозрачный белый слой, содержащий межфазный PBMNCs к новому 50 мл коническую трубку. Доведите общий объем до 30 мл с стерильной PBS и центрифугировать при х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 30 мл PBS. Подсчитайте число жизнеспособных клеток, основанный на трипанового синего Центрифуга PBMNCs в мкг в течение 10 мин при комнатной температуре, аспирата супернатант и отбросить его. Передача поглощающее покрытие разбавленного в 50 мл коническую пробирку, добавляют 10 мл буфером для лизиса эритроцитов и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Для приготовления мл буфером для лизиса эритроцитов, добавляют 0,5 г бикарбоната калия, 4, г хлорида аммония добавляют мкл 0,5 М ЭДТА в мл сверхчистой воды, рН 7. Доведите общий объем до 50 мл с стерильной PBS и центрифугировать при х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают и промывают осадок с 50 мл стерильной PBS, центрифугируют поглощающее покрытие при х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Центрифуга при х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Трансфекция PBMNCs с Эписомные плазмид день 14 Примечание: Выполнение изоляции из четырех коммерческих услуг интеграции, свободной Эписомные плазмид, несущих гены плюрипотентности с помощью коммерческого набора для очистки плазмиды и оценить качество очищенных плазмид с использованием анализа в агарозном геле, в соответствии с инструкциями изготовителя. Сбор PBMNCs в 15 мл коническую пробирку и подсчитывают количество жизнеспособных клеток на основе трипанового синего Аспирируйте трансфекции смесь, содержащую клетки в мкл кончика и вставьте пипетку с образцом вертикально в трубку, заполненную 3 мл электролитического буфера Е2, размещенных в пипетки станции электропорации машины, в соответствии с инструкциями изготовителя. Эффективно электропорации клетки, используя следующую программу: В, 10 мс, 3 импульса. Ресуспендируют электропорации клетки 2 х 10 6 клеток в 2 мл подогретого PBMNC среды, добавляя 0,25 мМ натрий бутират NAB и подсчитывают количество жизнеспособных клеток после электропорации протокола на основе трипанового синего День после электропорации, страт количество GFP-положительных клеток при флуоресцентной микроскопии с случайных полей, с тем чтобы оценить эффективность трансфекции. Поддерживать трансфицированных клеток без разделения на 3 дня, пока покрытие их на MEFs см раздел 6. Замените 2 мл свежей среды IPSC каждый день, и проверить клетки ежедневно. Вручную рассекают с иглой одной колонии в каждый момент времени при вскрытии микроскопом в захватного капотом, чтобы получить сетку, собирать мелкие комки с помощью пипетки и передавать их по отдельности друг в одну лунку луночного планшета, покрытого MEFs. Прохождение и расширение каждого луночного планшета на 6-луночный планшет в соотношении 1: 2, а затем каждый 6-луночный планшет в соотношении 1: 4 для дальнейшего распространения. Проанализируйте и расширить ИПСК вручную в течение первых проходов как тщательно описано в шаге 7. Для протокола фермент диссоциации, чистый IPSC колоныES аспирационных дифференцированные части, под микроскопом рассекает в подхвата капотом. Центрифуга при х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Пятно фиксированные клетки, использующиекоммерческий щелочной фосфатазы окрашивания комплект в соответствии с инструкциями изготовителя. Удалить дифференцированные части из IPSC колонии аспирационных под микроскопом рассекает в подхвата капотом. Пластинчатый Ipsc колонии в суспензии в течение 6 дней на сверхнизких крепления 6-луночных планшетах, с тем чтобы обеспечить образование сфероидальных трехмерных эмбриональных телец EBS. Изменить 2 мл свежей среды EB каждые два дня. Выполнение реакции обратной транскрипции на 1 мкг общей РНК, используя коммерческий набор обратный транскриптазы в соответствии с инструкциями изготовителя. Нормализация экспрессию других генов с использованием GAPDH в качестве гена 28 см праймеров, перечисленных в таблице 1. Нормализация экспрессии специфических эписомными плазмиды EBNA-1 гена с использованием FBX в качестве гена 29 см праймеров, перечисленных в таблице 1. Кариотип анализ Культура колонии IPSC в течение дней на тарелку с покрытием фидерных бесплатно базальной мембраны матрицы с коммерческой определяется, подающего свободной поддерживающей среде для ИПСК, следуя инструкциям изготовителя. Собирают клетки и центрифуги при мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют иПСК в 2 мл среды, специально разработанный для культивирования клеток для пренатальной диагностики техники. Погрузитесь и пятен фиксированной клетки с Акрихин решение для мин при комнатной температуре в темноте чтобы получить Q-полосы Приобретать клеток метафаз под флуоресцентным микроскопом при увеличении X Play Video. Cite this Article Meraviglia, V. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close.
Наркотики бесплатные пробы Больцано
Наркотики бесплатные пробы Больцано
Заявка грузоотправителя
Наркотики бесплатные пробы Больцано