Мониторинг внутриклеточного протеасомо-опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин-лигазы - Биология и естествознание курсовая работа

Главная

Биология и естествознание
Мониторинг внутриклеточного протеасомо-опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин-лигазы

Протеасомо-опосредованный гидролиз белков. Функции и синтез липоевой кислоты в Escherichia coli. Использование LplA-лигазы в биохимических исследованиях. Методы работы с бактериями Escherichia coli. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http :// www . allbest . ru /
Мониторинг внутриклеточного протеасомо-опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин-лигазы
1. Протеасомо-опосредованный гидролиз белков и методы его мониторинга
1.1.1 Строение и функции протеасомы
1.2.3 Убиквитин-зависимый путь деградации белков
1.3 Система убиквитирования/деубиквитирования
1.4 Современные методы исследования белков
1.6 Функции и синтез липоевой кислоты в Escherichia coli
1.7 Использование LplA-лигазы в биохимических исследованиях
2.3 Работа с нуклеиновыми кислотами
2.4 Методы работы с бактериями Escherichia coli
2.5 Методы работы с эукариотическими клетками HEK
2.6 Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле
Модификация белков убиквитином, приводящая к направленной деградации внутриклеточных белков 26S протеасомой, является одним из фундаментальных клеточных процессов. На настоящий момент считается, что как минимум половина белков в клетке разрушается при участии системы убиквитинилирования, насчитывающей, в свою очередь, более тысячи индивидуальных представителей в составе клеточного протеома.
Несмотря на множество методик, предложенных для наблюдения протеасомо-опосредованного гидролиза белков, подавляющее большинство из них подразумевает добавление специфических веществ, останавливающих белковый синтез, и последующее необратимое разрушение клеток. Добавление к исследуемым белкам высокомолекулярных ДНК-кодируемых флуорофоров приводит к значительным изменениям субстратных свойств изучаемых мишеней, что также значительно ограничивает подобную методику. В настоящей работе нами предложен альтернативный подход к решению описанной задачи с использованием липоат-лигазы типа А (LplA).
Объект - убиквитин-протеасомная система.
Предмет - клеточный метаболизм протеасом-зависимых и независимых белков, а также важнейшего представителя убиквитин-протеасомной системы - убиквитина.
Цель исследования - анализ внутриклеточного протеасом- опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин-лигазы.
1. Теоретический анализ литературы отечественных и зарубежных авторов по теме исследования.
2. Создание генетических конструкций, кодирующих в составе полицистронной кассеты белковые субстраты и мутантную липоат-лигазу LplA, совмещенную с репортерным белком ZsGreen1.
3. Отработка оптимальных условий внутриклеточной конъюгации белков- мишеней с резоруфином, катализируемое LplA.
4. Изучение внутриклеточного метаболизма ряда белков и убиквитина с применением разработанной методики.
Для решения поставленных задач и проверки исходных положений была определена методологическая база и методы исследования: методы теоретического анализа; эксперимент; методы генетической инженерии; электрофоретическое разделение белков в полиакриламидных гелях; измерение флуоресценции; блоттинг по Вестерну; прижизненная флуоресцентная микроскопия; методы компьютерной математической обработки полученных данных с построением графиков (SigmaPlot 11.0).
– рассмотрены имеющиеся данные о убиквитин-протеасомной системе;
? проанализированы результаты научно-исследовательских публикаций по изучению методов анализа внутриклеточной деградации белков;
– описана методологическая основа специфического внутриклеточного мечения белков низкомолекулярными флуорофорами;
– обозначены молекулярно-биологические аспекты исследуемой проблемы.
– получены данные по времени полужизни важного аутоантигена при рассеянном склерозе основного белка миелина (МВР), уточнены параметры метаболизма одной из главных мишеней при терапии онкологических заболеваний дегидрофолатредуктазы (DHFR), а также главного элемента протеасомной системы деградации белков - убиквитина - в истинно физиологических условиях.
Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) в Лаборатории биокатализа (Отдел пептидно-белковых технологий).
Автор выражает благодарность коллективу Лаборатории биокатализа ИБХ РАН, заведующему лабораторией чл.-корр. РАН, д.х.н., проф. Габибову Александру Габибовичу, старшему научному сотруднику к.х.н. Белогурову Алексею Анатольевичу за научное руководство и помощь на всех этапах работы, Кудряевой Анне Анатольевне за терпение и искреннюю помощь в выполнении практической части настоящего исследования.
1. Обзор литературы по теме протеасомо-опосредованный гидролиз белков методы его мониторинга
Протеасома - высокомолекулярный белковый комплекс, обладающий протеолитической активностью с широкой субстратной специфичностью. 20S протеасома в качестве протеолитического ядра входит в состав 26S протеасомы. Основной задачей протеасомы является расщепление отслуживших и дефектных клеточных белков. Есть несколько путей деградации белков протеасомой, но самым распространенным и высококонсервативным является АTP-зависимый путь с участием белка убиквитина (Ub), длиной 76 аминокислотных остатков. Около 90% короткоживущих и 70% долгоживущих белков разрушаются 26S протеасомой по убиквитин-зависимому пути. Для протеасомы основным сигналом для разрушения белка является полиубиквитиновая цепь связанная с субстратом. Маркировку белков осуществляет сложная система ферментов, называемая системой убиквитинилирования. Тем не менее, есть источники показывающие, что убиквитин-независимая деградация белков также возможна. При этом маркером для деградации может служить аминокислотная последовательность внутри самого белка, либо некая вспомогательная молекула. Протеасомы есть в клетках всех живых организмов, от архебактерий до высших эукариот, что свидетельствует об их огромной значимости для нормального функционирования клетки [1].
1.1.1 Строение и функции протеасомы
Протеасома - мультисубъединичный ферментный комплекс, осуществляющий расщепление белков в клетке [2]. 26S-протеосома состоит из надмолекулярных комплексов двух типов: центральной частицы в форме бочонка 20S и регуляторной частицы 19S на обоих ее концах (Рис. 1)[3]. 20S- протеасома представляет собой цилиндр длиной 15-17 нм и диаметром 11-12 нм, состоящий из четырех сложенных в стопку гептамерных колец, структура протеосомы была выяснена с помощью рентгеноструктурного анализа [4]. Внешние кольца цилиндра состоят из семи гомологичных субъединиц б-типа, а каждое из внутренних колец - из семи похожих консервативных субъединиц в- типа. Масса каждой субъединицы колец составляет около 20-35 кДа. Просвет образованный кольцами делится на три полости [5]. Центральная протеолитическая полость сформирована двумя в-кольцами и отделена от двух внешних полостей, сформированными другими сторонами в-колец и б- кольцами [6]. Каталитические центры расположены на N-концах в-субъединиц, лежащих во внутренней полости цилиндра[7]. в-субъединицы (в1, в2 и в5) ответственны за каталитическую активность, на каждой из них локализовано по одному каталитическому центру, а N-концевые остатки треонина этих субъединиц действуют как нуклеофилы [8].
Рис. 1 Схема строения и сборки 26S протеосомы
Механизм катализа был установлен методами рентгеноструктурного анализа, а каталитически важный остаток - методом мутагенеза [9]. В ходе реакции протон гидроксильной группы треонина переносится на аминогруппу этой же аминокислоты, а молекула воды в активном центре действует как основание. По подобному механизму работают еще три других фермента: пенициллинацилаза (в активном центре N-концевой серин), глутамин- амидотрансфераза (в активном центре N-концевой цистеин), аспартилглюкозаминидаза (в активном центре N-концевой треонин). В эукариотической протеасоме 4 из 7 в-субъединиц содержат N-концевой треонин. Существуют предположения, что аминокислотные остатки Lys33 и Glu17 также находятся в активном центре и участвуют в катализе. Функции остальных в-субъединиц неизвестна. Структура протеосомы поддерживается б-субъединицами, хотя они и не имеют каталитической активности. Важность роли взаимодействий между субъединицами можно доказать тем что при распаде протеосомы на субъединицы каталитическая активность утрачивается полностью.
Один из активных центров протеасомы катализирует протеолиз со специфичностью по типу трипсина (расщепление полипептидной цепи после положительно заряженных аминокислотных остатков), другой - по типу химотрипсина (после ароматических аминокислотных остатков), третий - по типу каспазы (после отрицательно заряженных аминокислотных остатков). Дополнительная активность протеасомы способная расщеплять полипептидную цепь практически между любыми аминокислотными остатками сильно зависит от того, какие именно аминокислоты находятся по обе стороны от сайта расщепления.
В норме 20S протеасома существует в неактивном состоянии, так как б- субъединицы за счет своих N-концевых гидрофобных участков блокируют вход в центральный канал, препятствуя случайному протеолизу. Изменение параметров центрального канала при взаимодействии б-субъединиц с 19S регуляторным комплексом и активатором PA28, приводит к активации 20S протеасомы. Основной задачей регуляторных комплексов протеасомы является узнавание белков и подготовка к их деградаци. Подготовка состоит из двух этапов, первое это узнавание полиубиквитиновой цепи и связывание субстрата, с дальнейшим отщеплением убиквитина, второе разворачивание и перенос субстрата в протеолитическую камеру 20S частицы[10].
PA700 (19S-частица) регуляторный комплекс протеасом эукариот состоит по крайней мере из 19 субъединиц и имеет молекулярную массу около 1 МДа. В его структуре можно выделить два основных элемента: “крышку” (lid) и “основание” (base). “Основание” состоит из шести субъединиц, имеющих АТФазную активность (Rpt1-6, Regulatory particle triple-A type1 proteins), членов ААА-семейства (ATPase Associated with different cellular Activities) и трех не АТФазных субъединиц (Rpn1, 2, 10), оно присоединяется непосредственно к б-кольцу каталитического ядра и обеспечивает разворачивание белковых субстратов. “Крышка” регуляторной частицы представляет собой комплекс массой 400 кДа, состоящий из 6 не АТФазных субъединиц (Rpn3, 5-9, 11-12, Regulatory particle non-ATPases) и отвечает за распознавание, связывание и деубиквитинилирование субстрата [11]. АТФазные субъединицы “основания” формируют гексамерное кольцо, которое непосредственно взаимодействует с гептамерным б-кольцом 20S протеасомы, открывая вход во внутреннюю протеолитическую камеру, а также разворачивают нативные белки [12]. “Основание” 19S-комплекса отвечает за связывание неправильно свернутых белков: для 19S комплексов дрожжей и млекопитающих была показана способность связывать некоторые неправильно свернутые белки и подавлять агрегацию последних [13].
Регулятор РА28 - гептамерный комплекс массой 180-200 кДа, состоит из IFNг- индуцибельных б и в-субъединиц. Он способен присоединяться к обоим концам протеолитического ядра или замещать 19S регулятор в 26S протеасоме. Существует гибридная протеасома, к которой с одного конца присоединен PA28, а с другого - 19S регулятор. PA28 связывается с 20S протеасомой обратимо, для этого процесса не требуется АТФ [14]. При этом открывается канал, ведущий в каталитическую полость протеасомы, что в десятки раз увеличивает ее активность [15].
Кроме разрушения отслуживших белков, протеасома выполняет множество различных функций:
1) Участие в регуляции клеточного цикла
2) Процессинг регуляторных белков и транскрипционных факторов
3) Участие в работе иммунной системы - гидролиз клеточных белков до антигенных пептидов
4) Защита клетки от воздействия высоких температур
Убиквитин (Ub) - это 76-аминокислотный белок с хорошо изученной б/в укладкой (Рис. 2). Он высококонсервативен среди эукариот, но отсутствует у бактерий и архей. У эукариот есть несколько генов, кодирующих убиквитин. Часто он синтезируется в виде неактивного полиубиквитинового предшественника, в котором число повторов моноубиквитина может отличаться у разных организмов. Для активации Ub (экспозиции С-концевого остатка Gly) необходим процессинг деубиквитинилирующими ферментами. Чаще всего Ub присоединяется к субстратам путем образования изопептидносвязи между С-концевым остатком Gly и е-аминогруппой остатка Lys в молекуле субстрата. Ub образует разные типы модификаций. Простейшая из них - моноубиквитинилирование - это присоединение к белку одной молекулы Ub [16].
Рисунок 2 Строение убиквитина (ленточная диаграмма)
Существует несколько видов модификаций убиквитином:
1. Моноубиквитинилирование является распространенной регуляторной модификацией.
2. Мультиубиквитинилирование или множественное моноубиквитинилирование.
Регулирование транскрипции может влиять от моноубиквитинилирования гистонов и транскрипционных факторов. Присоединение одной молекулы убиквитина к белкам PCNA и FANCD2 играет важную роль при репарации ДНК. Моноубиквитинилирование различных поверхностных клеточных рецепторов является сигналом для их эндоцитоза и последующей деградации в лизосомах. Другая форма модификации - мультиубиквитинилирование или множественное моноубиквитинилирование - характеризуется тем, что несколько остатков Lys на субстрате могут связыватся с одиночными молекулами Ub. Такая модификация приводит к эндоцитозу субстрата и его последующей деградации в лизосомах [17].
Молекулы Ub могут конъюгироваться между собой, формируя различные варианты цепей. Присоединение таких цепей убиквитина к субстрату - это полиубиквитинилирование [18]. Убиквитин содержит семь остатков Lys (Lys-6, Lys-11, Lys-27, Lys-29, Lys-33, Lys-48 и Lys-63). Предполагается, что все остатки Lys могут участвовать в образовании полиубиквитиновой цепи. Наиболее изученными и распространёнными механизмами образования полиубиквитиновых цепей происходит с участием Lys-48 и Lys-63 [19]. Сигналами для деградации белка протеосомой служат Lys-48- полиубиквитиновые цепи [20]. В свою очередь Lys-63-полиубиквитиновые цепи вовлечены в регуляцию эндоцитоза, репарацию ДНК, активацию протеинкиназ [20]; в экспериментах in vitro они могут приводить к деградации субстратов [21]. Полиубиквитиновые цепи, образованные через Lys-6, Lys-11, Lys-27, Lys-29 и Lys-33, встречаются достаточно редко, и их функции до конца не ясны [22].
За распознавание полиубиквитинилированного белка ответственна одна из субъединиц регуляторной частицы 19S протеосомы - Rpn10 [23]. Rpn10 связывается с убиквитином благодаря наличию убиквитин-связывающего сайта в С-концевом гидрофобном кластере, содержащем мотив LALAL [24]. Изолированная субъединица Rpn10 с одинаковой эффективностью связывает разные формы поли-Ub, в которых отдельные молекулы убиквитина соединены через Lys-6, Lys-11 или Lys-48, тогда как 26S протеасома связывает убиквитин, сшитый через Lys-48 [25]. Это свидетельствует о существовании механизмов, обеспечивающих не только эффективное, но и правильное связывание субстрата. Вероятно, корректное узнавание четвертичной структуры полиубиквитиновой цепи и специфичность связывания субстрата обуславливают вспомогательные лабильно ассоциированные белки, такие как Rad23 (hHR23a, hHR23b) и Dsk2 (hPLIC) [26]. Опыты на S. cerevisiae по удалению Ub-связывающего сайта у Rpn10 показали, что фенотипически такие мутанты не отличаются от дикого типа [26]. Это свидетельствует о том, что Rpn10 - не единственная субъединица протеасомы, способная связывать полиубиквитиновую цепь. По-видимому, в связывание полиубиквитинированного субстрата вовлечены также субъединицы Rpn1, Rpn2, Rpn13 и Rpt5 [27,28].
1.2.3 Убиквитин-зависимый путь деградации белков
Деградация белков по убиквитин-зависимому пути проходит в два основных этапа:
1. Присоединение убиквитина (полиубиквитиновой цепи) к белку-мишени.
2. Гидролиз убиквитин-связанного белка 26S протеасомой с высвобождением свободного убиквитина.
Последний процесс осуществляется деубиквитинилирующими ферментами (deubiquitinating enzymes, DUBs). Ковалентное присоединение убиквитина к белками, предназначенными для расщепления, происходит с помощью трех групп ферментов (E1, E2 и E3) (Рис. 3)[29]
Рисунок 3. Схема убиквитин-зависимого пути деградации белков
1.3 Система убиквитинилирования/деубиквитинилирования
В эукариотической клетке белки, направленные на гидролиз в протеасому, помечены не одним убиквитином, а полиубиквитиновой цепью. Процесс присоединения убиквитина к белку-мишени проходит в три стадии. На первом этапе убиквитин-активирующий фермент Е1, используя АТР, активирует убиквитин с образованием промежуточного комплекса (E1-S~Ub). Затем, один из убиквитин-переносящих ферментов Е2 через образование еще одного промежуточного комплекса (E2-S~Ub) переносит активированный убиквитин к Е3-лигазе, специфично связанной с субстратом. В случае RING-домен- содержащих Е3-лигаз убиквитин переносится лигазой сразу на субстрат. В случае НЕСТ-домен-содержащих Е3-лигаз перенос убиквитина на субстрат проходит через образование еще одного промежуточного комплекса - E3-S~Ub. После того как присоединен первый убиквитин к субстрату, Е3-лигаза последовательно присоединяет еще несколько молекул убиквитина к остатку Lys на первой молекуле [30].
Свободная карбоксильная группа С-конецевого остатка Gly Ub формирует изопептидную связь с е-аминогруппой остатка Lys в молекуле субстрата, но в некоторых случаях Ub может конъюгировать через N-конец субстрата или через боковую цепь цистеина [31]. Считается, что для большинства белков минимальным сигналом деградации для протеасомы является цепь из четырех молекул Ub, последовательно соединенных изопептидной связью между С- концом одной молекулы и Lys48 другой молекулы [32].
Система убиквитинирования у млекопитающих содержит несколько сотен разных ферментов, включая один Е1-фермент, ~50 Е2-ферментов и ~500 Е3- лигаз. Е3-лигазы играют ключевую роль в убиквитин-зависимой протеасомной деградации белков, так как именно они обеспечивают специфичность полиубиквитинирования субстрата (Рис. 4).
Рисунок 4 Трехстадийный процесс присоединения убиквитина ферментативным комплексом лигаз к белку
Перед попаданием субстрата в протеолитическую полость протеасомы с него должен быть удален Ub. Реакция деубиквитинилирования осуществляется деубиквитинилирующими ферментами (DUBs). Все известные DUB-ферменты являются цистеиновыми протеазами, которые специфично гидролизуют изопептидную связь сразу после С-концевого остатка Ub (Gly-76). У млекопитающих обнаружено ~100 деубиквитинирующих ферментов, и по крайней мере четыре из них (Rpn11, Ubp6, UCH37, Doa4) являются компонентами 26S протеасомы или часто обнаруживаются в комплексе с ней. Основываясь на данных об их молекулярной массе, гомологии в аминокислотной последовательности и каталитически важных остатках в пептидазном центре, их подразделяют на два больших подсемейства: UCHs (ubiquitin COOH-terminal hydrolases) и USPs (или UBPs, ubiquitin-specific proteases). Ферменты UCH - это, как правило, небольшие белки (20-30 кДа), отщепляющие Ub от коротких и неструктурированных полипептидных цепей. Как и все цистеиновые протеазы, в пептидазном центре они содержат каталитическую триаду аминокислотных остатков - Cys, His и Asp - и дополнительный консервативный остаток Glu. Ферменты USP - более гетерогенная группа белков (30-100 кДа), которые расщепляют изопептидую связь как между Ub и субстратом, так и между двумя молекулами Ub. Белки этого семейства также содержат каталитическую триаду аминокислотных остатков (Cys, His и Asp) в пептидазном центре[33].
1.4 Современные методы исследования белков
Метаболизм большинства внутриклеточных белков зависит от работы убиквитин-протеасомной системы, называемой также UPS. Как уже упоминалось, убиквитин-протеасомная система состоит приблизительно из 1000 белков и основная часть из них имеют решающее значение для нормального функционирования клеток [34]. Одним из наиболее важных характеристик UPS-субстратов является время полураспада в клетке. Знание метаболизма белков является основной составляющей в понимании функционирования белковой машинерии, которая участвует во всех без исключения внутриклеточных процессах от ее деления до апоптоза.
В настоящий момент возможно использовать несколько методов определения скорости убиквитин-протеасомного гидролиза белков. Классический метод «pulse-chase» требует введения радиоактивных элементов в клетки (например 35S-метионин) с последующей промывкой «холодной» средой и дальнейшей изоляцией интересующего белка с использованием аффинных реагентов в выбранных точках времени. Другой классический метод основан на ингибировании белкового синтеза (например циклогексимидом [35]) и последующим анализом количества белка в разные периоды времени с помощью Вестерн-блоттинга. Самым очевидным недостатком этого метода является клеточный стресс после полной остановки синтеза белка, что приводит к значительным изменениям в клеточном метаболизме и к трудностям в изучении долгоживущих белков [36]. Объединение таких методов как масс-спектрометрия и «pulse-chase» привели к методу, известному как стабильная маркировка белков изотопными аминокислотами в клеточной культуре (SILAC, [37]). SILAC не требует изоляции интересующего белка и позволяют анализировать время полураспада сотен белков в одном эксперименте, однако, он чрезвычайно чувствителен к подготовке образцов и требует специального масс-спектрометрического оборудования.
Мониторинг деградации белков в реальном времени стал возможным с помощью слияния белка-мишени с ДНК-закодированным флуоресцентным зондом (например, GFP). Использование фотоактивируемых флуоресцентных белков (PAFP) делает возможным отслеживание деградации внутриклеточных белков-мишеней без добавления циклогексимида [38,39]. Другой метод, называемый «bleach-chase», позволил исследователям наблюдать динамику флуоресцентно-меченых белков в живых клетках H1229. Различия в флуоресценции между клетками, обесцвеченными коротким импульсом света, и нативными клетками были использованы для оценки периода полураспада белков. Периоды полураспада в диапазоне 0.75-22.5 ч были измерены на 100 YFP-меченных белках [40]. Развитие различных флуоресцентных меток можно также рассматривать в качестве подхода для мониторинга стабильности белка в физиологических условиях [41]. Несмотря на очевидные выгоды, слияние белка с более чем 20-килодальтонной флуоресцентной меткой несомненно несет опасность изменения структуры, функции, связывающих свойств, локализации и стабильности белка, что в свою очередь может непредсказуемо изменить его синтез или деградацию [42].
Последние достижения в маркировке белков химическими флуорофорами внутри живых клеток также можно применять для мониторонга стабильности белка. Удаление флуорофора из среды имитирует классическую "pulse-chase" методологию, вновь синтезированный белок не будет подвергаться мечению. Относительно недавно был разработан метод PRIME (Probe Incorporation Mediated by Enzymes), в основе которого лежит использование лигазы липоевой кислоты Escherichia coli, содержащей ряд замен в активном центре (LplA).
Данная лигаза способна присоединять химический флуорофор к ?-аминогруппе лизина в составе короткого 13-членного пептида [43,44]. Этот метод сочетает в себе преимущества высокоспецифических белковых меток и небольших химических флуорофоров [45-47]. Мы предполагаем, что метод PRIME может быть эффективно использован для мониторинга стабильности белка в физиологических условиях в режиме реального времени.
1.5 Функции и синтез липоевой кислоты в Escherichia coli
Серия генетических, биохимических и физиологических исследований в Escherichia coli пролили свет на механизм синтеза липоевой кислоты - так были выяснены функции белков-ферментов, которые участвуют в присоединении липоевой кислоты, а также ферментов, которые катализируют сопряженные реакции модификации. Некоторые аспекты механизмов синтеза и присоединения липоевой кислоты имеют сильное сходство с метаболизмом биотина [48].
Липоевая кислота представляет собой серосодержащие кофакторы, которые найдены в большинстве прокариотических и эукариотических организмах. Гомологи липоевой кислоты найдены во всех царствах жизни. В Escherichia coli и других организмах липоевая кислота необходима для функционирования нескольких ключевых ферментов, участвующих в окислительных реакциях и метаболизме пируватдегидрогеназы (PDH), 2- оксоглутарат дегидрогеназы (2-OGDH), разветвленной цепью 2- оксиддегидрогеназы и ацетоиндегидрогеназы [49,50]. В каждом ферменте определенная субъединица модифицируется присоединением липоевой кислоты к конкретным остаткам лизина в доменах этих субъединиц. При этом амидная связь образована между карбоксильной группой липоевой кислоты и аминогруппой боковой цепи лизина [51]. Наш интерес был направлен не на саму липоевую кислоту, а на механизмы присоединения липоевой кислоты и ее предшественника, октановой кислоты, к белкам.
Существование липоил-лигазы (Lipoate-Protein Ligase LplA) было впервые описано Ридом и его сотрудниками (1958) в E. Faecalis и в E.coli. Очищенная LplA-лигаза представляет собой белок с массой 38 кДа, которая представлена мономерной формой [52]. Липоил-лигаза катализирует как АТФ-зависимую активацию липоата до липоил-AMP, так и передачу этого активированного липоила к апопротеинам с сопутствующим высвобождением AMP. Липоил- лигаза способна использовать липоат и несколько его аналогов в качестве доноров для посттрансляционной модификации E2 апобелков в естественных условиях [53].
1.6 Использование LplA-лигазы в биохимических исследованиях
Химические флуорофоры имеют много преимуществ по сравнению с флуоресцентными белками, но является более сложными в работе. Флуоресцентные белки используются повсеместно в биовизуализации, но их большие размеры (~27 кДа) могут нарушать сворачивание и функцию белка. Сайт-специфическая маркировка белка является сложной задачей, потому что эти флуорофоры генетически не кодируются, следовательно, они должны быть посттрансляционно доставлены внутрь клетки. Для достижения специфической маркировки, по эффективности, сопоставимой с флуоресцентными белками, ранее группой авторов был разработан метод внутриклеточного мечения рекомбинантных белков с использованием липол-лигазы E.coli путем присоединения химического флуорофора к остатку лизина в составе 13- членной аминокислотной последовательности. Авторами былсделан ряд замен в активном центре лигазы для распознавания низкомолекулярного химического флуорофора резоруфина [54,55].
Клетки линии HEK293^ стабильно трансдуцированные следующими конструкциями:
pLХ303 MBP-LAP2_IRES-ZsGreen1-LplA(AAG) pLХ303 DHFR-LAP2_IRES-ZsGreen1-LplA(AAG) pLХ303 Ub-DHFR-LAP2_IRES-ZsGreen1-LplA(AAG) pLХ303 LAP2-Ub_IRES-ZsGreen1-LplA(AAG)
Ингибиторы рибосом: циклогексимид, анисомицин. Ингибиторы протеасомы: PS341, MG-132.
Модифицированный химический флуорофор: резоруфин
2.3 Работа с нуклеиновыми кислотами
Амплификация фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции. Полимеразную цепную реакцию проводили на приборе PTC-200 M&J Research, США.
Готовили инкубационную смесь следующего состава:
• однократный буфер для Tersus-полимеразы
• по 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата
Амплификацию проводили по следующей схеме: А
предварительная денатурация 95°С, 1 мин. 1 цикл.
Расчет температуры отжига праймера (Х) производили по формуле: Х = 2°С Ч n (А/Т) +4°С Ч n (G/C) -5°С,
где n - число соответствующих нуклеотидов. Для праймеров длиной более 24 нуклеотидов использовали температуру отжига 65°С или максимальную возможную температуру, определенную экспериментально.
Рестрикция. Рестрикцию ПЦР продуктов вели 14-16 часов, плазмидной ДНК - 1-2 часа, в термостате при 37°С. При рестрикции плазмидной ДНК, добавляли рибонуклеазу до конечной концентрации 1 мкг/мл.
Лигирование. Лигирование вели в объеме 20 мкл, при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 1-12 часов при комнатной температуре. Затем в лигазную смесь очищали китом для выделения ДНК из реакционных смесей Cleanup Standard(Евроген, Россия)
Выделение плазмидной ДНК. Выделение плазмидной ДНК в большинстве случаев проводили китом для выделения плазмидной ДНК Plasmid Mini- или Midiprep (Евроген, Россия). Одну колонию бактерий инкубировали в 5 мл LB или 2xYT с добавлением селективного антибиотика и растили при 37°С с хорошей аэрацией в течение 18-22 часов. Осаждали клетки центрифугированием на скорости 5000 об/мин в течение 3 минут при комнатной температуре последовательно в одну микропробирку. Ресуспендировали в 250 мкл «ресуспендирующего раствора». Затем добавляли 250 мкл «лизирующего раствора» осторожно перемешивали содержимое пробирки до тех пор пока лизат не стал прозрачным. Затем быстро нейтрализовали 350 мкл «нейтрализирующего раствора», перемешивали переворачиванием и 1 минуту инкубировали при комнатной температуре до образования белого осадка, который осаждали центрифугированием на скорости 13200 oб/мин при комнатной температуре в течение 10 минут(Далее все центрифугирования проводили на скорости 13200 oб/мин). Супернатант переносили в, микроколонку и центрифугировали 1 минуту. Дальше добаляли 200 мкл «раствора для удаления эндотоксинов» и центрифугировали 1 минуту. Далее промывали 600 мкл «промывочного раствора» и центрифугировали 1 минуту. Спин-колонку помещали в новую пробирку и элюировали 30-50 мкл автоклавированной водой. Выделение плазмидной ДНК для секвенирования производилось согласно приведенной выше методике 300 нг в 6 мкл воды.
Электрофорез ДНК в агарозном геле. Для проведения электрофореза использовали 1% агарозный гель, приготовленный на однократном TBE с бромистым этидием в концентрации 0.5 мкг/мл. Пробы смешивали в соотношении 1:10 с буфером нанесения, содержащим 0.1% бромфеноловый синий, 0.5% ДСН, 0.1 М ЭДТА, pH 8.0, 50% глицерина. Электрофорез вели в буфере TBE при напряжении 5 В/см. По окончании электрофореза ДНК визуализировали в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм.
Гомологичная рекомбинация. Данную процедуру проводили согласно протоколу фирмы-производителя (Invitrogen, США).
Электроэлюция. Фрагменты ДНК элюировали из однопроцентных агарозных гелей. После завершения электрофореза, гель окрашивали в растворе бромистого этидия (1 мкг/мл) и визуализировали в ультрафиолетовом свете, далее вырезали нужный фраг
Мониторинг внутриклеточного протеасомо-опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин-лигазы курсовая работа. Биология и естествознание.
Реферат: The Three Key Concepts Of Sociology In
Реферат: Экономико-статистический анализ производства молока в ЗАО Оглухинское Крутинского района
Курсовая работа по теме Пути снижение издержек при осуществлении процесса хранения
История Развития Железных Дорог В России Реферат
Дипломная работа по теме Теоретические и методологические положения сущности конкурентоспособности розничного торгового предприятия
Дипломная работа по теме Север Vs Юг: две ипостаси американской цивилизации
Габариты Детской Мебели Реферат
Дипломная работа по теме Проект будівництва консервного заводу з переробки плодів та овочів потужністю 28 моб за рік
Реферат по теме Выдающийся советский педагог А.С.Макаренко
ПОСТКОНТРАКТНЫЙ ОППОРТУНИЗМ
Дипломная работа по теме Использование сети Интернет в системе маркетинговых коммуникаций: состояние и перспективы развития на примере ОАО 'Брестский райагросервис'
Внутренний Мир Сочинение Пример Из Текста
Курсовая работа: Стороны как субъекты гражданского процесса
Доклад: Развитие техносферы
Дипломная работа по теме История взаимоотношений христианских миссий в Китае с конфуцианством
Учебное Пособие На Тему Теxніко-Тактична Підготовка Гри У Баскетбол
Собрание Сочинений В 22 Томах
Контрольная работа по теме Инфраструктура рынка кофе в Украине
Дипломная Работа На Заказ Ростов
Реферат по теме Оппозиция любви и долга в Сиде Корнеля
Вода в жизни растений - Биология и естествознание презентация
Противопожарные водопроводы, спринклерные и дренчерные установки - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда презентация
Методы исследования медицинской генетики - Биология и естествознание контрольная работа