Молекулярно-генетические методы исследования туберкулеза

Накопленное знание о молекулярных основах лекарственной устойчивости за последние 20 лет дало толчок разработке целого ряда генетических методов ускоренного определения чувствительности и устойчивости к противотуберкулезным препаратам. К преимуществам молекулярного тестирования, помимо быстрой диагностики, можно отнести возможность работы непосредственно на клинических образцах (без необходимости выделения штамма на плотной или жидкой среде) и образцах, содержащих нежизнеспособные бактерии (например, бактерии, убитые нагреванием или химической инактивацией), потенциально высокую пропускную способность и сравнительно низкие требования к лабораторной безопасности. К ним относятся: Xpert MTB/Rif, Hain-test (GenoType®MTBDRplus, GenoType®MTBDRsl).

Xpert MTB/Rif

·        представляет собой автоматизированный тест амплификации нуклеиновых кислот на картриджной основе для работы с ТБ с использованием платформы GeneXpert, предназначенный для многих заболеваний.

·        Система GeneXpert обеспечивает полную интеграцию и автоматизацию трех процессов (подготовка образца, амплификация и выявление), необходимых для молекулярного тестирования, в основе которого лежит ПЦР реального времени.

·        Система GeneXpert состоит из аппарата, персонального компьютера, сканера штриховых кодов и установленного программного обеспечения. В ней используются одноразовые картриджи с лиофилизированными реактивами, буфером и отмывающим раствором. Обнаружение и определение характеристик проводится в режиме реального времени с использованием шестицветного лазерного детектора. Разработка анализа Xpert MTB/Rif для платформы GeneXpert завершилась в 2009г.  В Кыргызской Республике имеется 24 аппарата GeneXpert и распределены равномерно по регионам.

·        Xpert MTB/Rif выявляет микобактерии туберкулеза, а также мутации, указывающие на устойчивость к рифампицину используя три особых праймера и 5 уникальных молекулярных зондов в гене rpoB, содержащим в себе подавляющее большинство мутаций, для обеспечения высокой степени специфичности.

·        Перекрестная реактивность с нетуберкулезными микобактериями отсутствует, поэтому туберкулёз и устойчивость к рифампицину правильно выявляется в присутствии ДНК нетуберкулезных микобактерий или смешанных чувствительных и устойчивых штаммов.  

·        Анализ выдает результат при работе с патологическим материалом менее чем за 2 часа.    

·        Точность исследования – однократный тест Xpert MTB/Rif, проведенный непосредственно с мокротой, позволил выявить 99% пациентов с положительным мазком и 80% пациентов с отрицательным мазком мокроты. Общая чувствительность однократного исследования Xpert MTB/Rif с использованием непосредственно мокроты, полученной от случаев с положительным посевом, составила 91% по сравнению с 59,9% чувствительности однократной прямой микроскопии мазка.  

Hain-test

В 2008 году ВОЗ одобрила использование молекулярной гибридизации с типоспецифическими зондами (LPA) в отношении препаратов 1-ряда GenoType®MTBDRplus, затем в 2011 году разработан GenoType®MTBDRsl для препаратов 2-ряда. В Кыргызской Республике имеется только один аппарат Хайн-теста, который находится в г.Бишкек РРЛ.

·        Принцип теста молекулярной гибридизации с типоспецифическими зондами:

Тесты молекулярной гибридизации с типоспецифическими зондами (LPA) представляют собой семейство ДНК-тестов на основе полосок (стрипов), которые определяют профиль лекарственной устойчивости штамма МБТК посредством паттерна связывания ампликонов (продуктов амплификации ДНК) с зондами, которые нацелены на наиболее распространенные мутации, связанные с устойчивостью к препаратам первого и второго ряда, и зондами, которые нацелены на соответствующую последовательность ДНК дикого типа. Наличие мутаций выявляется путем связывания ампликонов с зондами, нацеленными на наиболее часто встречающиеся мутации (МУТ-зонды), либо предполагается в том случае, когда не происходит гибридизации (т.е. связывания) ампликонов с соответствующими зондами дикого типа. Реакция после гибридизации проявляется в виде окрашенных линий на тест полоске в месте связывания зондов.   

Чувствительность и специфичность:

·        GenoType®MTBDRplus продемонстрировал чувствительность 96,7% и специфичность 98,8% при определении устойчивости к рифампицину и чувствительность 90,2% и специфичность 99,2% при определении устойчивости к изониазиду.

·        GenoType®MTBDRsl показал совокупную чувствительность 86,2% и специфичность 98,6% при определении устойчивости к фторхинолонам и совокупную чувствительность 87,0% и специфичность 99,5% при определении устойчивости к инъекционным препаратам второго ряда.      

·        Тест GenoType®MTBDRplus нацелен на выявление специфических мутаций на участке определения устойчивости к рифампицину гена rpoB, а также мутаций в промоторе inhA и на участке katG с целью выявления устойчивости к изониазиду.

·        GenoType®MTBDRsl Version 2 – охватывает участок определения устойчивости к хинолонам генов gyrA и gyrB с целью выявления устойчивости к фторхинолонам, а также участок промотора rrs и eis с целью выявления устойчивости к инъекционным препаратам второго ряда.

·        Существуют 2 версии GenoType®MTBDRsl: version 1.0 может обрабатывать из образцов с положительным мазком. Version 2.0 еще более чувствительна, и поэтому может выполняться с использованием образцов с отрицательным мазком.   

·        Результаты можно получить через 5 часов.

Молекулярные тесты не подходят для мониторинга состояния пациента, т.к. эти тесты также выявляют ДНК нежизнеспособных микобактерий.