Розпізнавання деревних поліфенолів ферментами Траметесу Різнокольорового

Гриби під час гниття деревини мають складні системи детоксикації, які дозволяють їм справлятися з вторинними метаболітами, що виробляються рослинами. Хоча кількість генів, що кодують глутатіонтрансферази, особливо розширена в лігнолітичних грибах, мало відомо про їхні молекули-мішені. У цій статті досліджуємо поєднання біохімічних, ферментативних і структурних підходів, взаємодію між поліфенолами та шістьма глутатіонтрансферазами гриба Trametes versicolor.

Читайте в цій статті:

• Процес розкладання
• Порівняльні підходи
• Взаємодія TvGSTO з флавоноїдами
• Кристалічна структура TvGSTO6S
• Omega GST 
• Ацетонові екстракти черемхи звичайної

Процес розкладання

Мікробне розкладання деревини було широко вивчено через його важливість у переробці органічної речовини та потенційному використанні в багатьох галузях промисловості.

Це розкладання в основному здійснюють гриби, зокрема гриб Траметес, який здатен розкладати та мінералізувати всі компоненти деревини. Дійсно, ще в середині минулого століття ця функціональна властивість була пов’язана зі здатністю цих грибів виділяти позаклітинні ферментні системи, здатні розкладати полімери деревини.

Окрім цих позаклітинних систем, нещодавні дослідження також підтвердили важливість внутрішньоклітинних систем детоксикації в процесі грибкової деградації деревини. Вважалося, що ці системи відіграють важливу роль у розкладання деревини.

Ефективність цих внутрішньоклітинних систем детоксикації, здається, пов’язана з розширенням мультигенних родин, залучених у фазу окислення, наприклад монооксигенази цитохрому P450, і у фазу кон’югації, наприклад глутатіонтрансферази.

Подібним чином такі розширення також зустрічаються у травоїдних комах, де ці мультигенні родини відіграють ключові функції в детоксикації хімічних речовин для захисту рослин, а також в еволюції метаболічної резистентності до хімічних інсектицидів 9, 10, 11.

Порівняльні підходи

Досі порівняльні геномні, біохімічні, структурні чи фізіологічні підходи до грибів, що розкладають деревину, давали лише небагато уявлень про функцію та специфічність цих ферментів у процесі розкладання деревини. Ця нестача знань зумовлена головним чином відсутністю специфічних субстратів, які дозволили б розрізняти ізоформи.

Розширення сімейства GST у цих грибах головним чином стосується трьох філогенетичних класів:

• GSTFuA
• Ure2p
• GST Omega 12

Ми припустили, що специфічний для грибів клас GSTFuA може брати участь у катаболізмі молекул лігніну 13.

Ure2pA мають класичну GSH-трансферазну активність, тоді як Ure2pB демонструють активність деглутатіонілювання (Ure2pB). Цікаво, що бактеріальні ортологи Ure2pB (названі GST Nu) діють як глутатіонліази в розриві β-арилового ефірного зв’язку лігніну.

GSTO беруть участь у шляхах детоксикації через реакції деглутатіонілювання, а дві ізоформи GSTO Phanerochaete chrysosporium (PcGSTO3 і PcGSTO4) зв’язують терпени в Trametes versicolor.

Деякі ізоформи GSTO взаємодіють з різними екстрактивними речовинами деревини. Ці взаємодії можуть дати розуміння хімічного складу екстрактів.

Взаємодія TvGSTO з флавоноїдами

У недавній дослідженні ми припустили, що GST з сапротрофів можуть взаємодіяти з флавоноїдами, які є фенольними сполуками, такими як HBP, і присутні в деревних екстрактах.

Щоб уточнити наші результати, TSA використовувався для перевірки набору комерційних флавоноїдів на їх взаємодію з TvGSTO.

Деякі з передбачуваних комплексів були додатково досліджені методом рентгенівської кристалографії. Вперше в GST одна структура виявила симетричний сайт лігандину (L-сайт), заповнений парою взаємодіючих лігандів.

У той час як TvGSTO4S і 5S показують змінну або слабку реакцію на флавоноїди, TvGSTO1S, 2S, 3S і 6S в основному демонструють позитивні зсуви їх температури денатурації.

Наприклад, на TvGSTO6S впливають усі молекули, крім катехіну. Цікаво, що ці флавоноїди нещодавно були виявлені за допомогою мас-спектрометрії в плодових тілах Траметесу .

Їх присутність може виникати через дерева або ґрунти, на яких ростуть гриби.

Кристалічна структура TvGSTO6S

Відсутність структури з лігандом, який зв'язується в H-сайті TvGSTO6S, перешкоджає його точному опису. Однак, якщо порівнювати з еквівалентною областю TvGSTO3S, значні відмінності легко помітні в TvGSTO6S. Більшість залишків, які вистилають сайт зв’язування бензофенону TvGSTO3S, відрізняються.

Крім того, подовження С-кінцевої α-спіралі двома додатковими витками призводить до відкритого та неглибокого H-сайту, на відміну від прихованого H-сайту в TvGSTO3S, покритого та закритого петлею, що відповідає додатковим виткам.

Існують також невеликі відмінності між димерними інтерфейсами обох ізоформ. Більшість залишків на межі розділу зберігаються, за винятком кількох, розташованих у спіралі α4.

Більші залишки TvGSTO6S (L112 і T115 замість T110 і A113 у TvGSTO3S) і втрата взаємодії між мономерами між Y118 (замінений на E120 у TvGSTO6S) і E80, присутні в TvGSTO3S, ймовірно, пояснюють більш відкритий димер у TvGSTO6S. Його інтерфейсні залишки утворюють кишеню з центром на подвійній осі димеру (прямокутний перетин 8 × 6 Å 2 ), більший, ніж еквівалентна область, знайдена в TvGSTO3S (прямокутний перетин 7 × 4 Å 2.

У цьому регіоні знаходиться третій сайт зв’язування, названий сайтом лігандину (L-сайт) у людському GST Omega 1 (hGSTO1) 30.

Omega GST 

Структурні порівняння дозволяють припустити, що Omega GST мають два гідрофобних сайти зв’язування ліганду:

• H-сайт поблизу α4 і α6 і L-сайт на межі розділу димерів. У випадку TvGSTO6S L-сайт може приймати флавоноїди. Вирівнювання розкритих структур із послідовностями TvGSTO1S, −2S, −4S і −5S показує варіації в передбачуваних H- та L-сайтах, що може пояснити специфічні для ізоформ моделі TSA.

Однією з найбільших проблем у характеристиці GST є ідентифікація природних лігандів 33.

Афінна кристалографія є дуже новим методом, який нещодавно був розроблений для вибору та ідентифікації нових інгібіторів із натуральних сирих екстрактів як потужних лікарських каркасів для фармацевтичних мішеней.

Ми успішно застосували цей метод на кристалах TvGSTO3S для виділення флавоноїду дигідровогоніну з частково очищеного екстракту черемхи.

Ацетонові екстракти черемхи звичайної

Методом зворотної хроматографії фракціонували ацетонові екстракти черемхи звичайної. Потенційне інгібування різними фракціями активності естерази TvGSTO було проаналізовано з використанням як хлорметилфлуоресцеїну діацетату (CMFDA), так і метилумбелліферилацетату (MUA) як субстратів.

У попередніх дослідженнях ці субстрати мали підвищену чутливість виявлення флуоресценції та уникали ефектів гасіння деревних екстрактів. Фракції, які елюювалися через 46 і 47 хвилин, викликали сильне пригнічення обох виміряних активностей. Об’єднану суміш перевіряли на її здатність взаємодіяти з TvGSTO3S за допомогою TSA.

Аналіз цього розчину за допомогою РХ-МС виявив наявність щонайменше двох сполук з молекулярною масою 254 і 286 г.моль -1 відповідно. Елюат через 46–47 хвилин також аналізували за допомогою H1 ЯМР. Показали характерні сигнали флаванонового скелета з, крім того, типовими синглетами метилоксигрупи при 3,75 або 3,81 м.д.

На цій стадії кілька сполук, уже описаних у екстрактивній композиції, могли відповідати таким даним (наприклад, дигідровогонін або сакуранетин) так що було неможливо остаточно визначити молекулярні структури, зокрема щодо положення групи MeO або в кільці.

Висновок

У цій статті ми продемонстрували, що GST T. versicolor , які належать до класу Omega, взаємодіють з поліфенольними сполуками, які містяться в деревині, і зокрема з флавоноїдами, такими як дигідровогонін і нарингенін.

Молекулярні взаємодії між TvGSTO і поліфенолами виявляються дуже різноманітними. Вони потенційно включають два структурні сайти для кожної ізоформи. Спокусливо встановити кореляцію між різноманітністю цих взаємодій і розширенням класу Омега (щонайменше 16 ізоформ) у Траметесі, який зустрічає велику різноманітність поліфенолів у своєму природному середовищі.

Однак точна функція цієї мережі GST залишається незрозумілою, оскільки не було виявлено жодної каталітичної активності проти перевірених поліфенолів.

Здатність TvGSTO зв'язувати поліфеноли через різні сайти свідчить про те, що грибкові GST можуть брати участь у транспортуванні різних поліфенолів. Ці GST можуть діяти як носії флавоноїдів і глутатіону, забезпечуючи транспортери ABC обома молекулами для їх спільного транспортування.

Цей транспорт вимагає вільного глутатіону, але не має активності глутатіонілювання.

Наше дослідження показує, що грибкові GST як їхні рослинні гомологи можуть брати участь у транспортуванні та секвестрації флавоноїдів.