Микроклональное размножение хризантемы сорта "Земба" методом органогенеза каллусной ткани - Биология и естествознание дипломная работа

Главная

Биология и естествознание
Микроклональное размножение хризантемы сорта "Земба" методом органогенеза каллусной ткани

Характеристика каллусных клеток. Этапы микроклонального размножения. Классификация методов микроклонального размножения. Успехи микроклонального размножения хризантемы. Стерилизация посадочного материала. Каллусогенез на эксплантах различной локализации.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИИ
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
ТВЕРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Микроклональное размножение хризантемы сорта Земба методом органогенеза каллусной ткани
1. МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ
1.1 Общая характеристика каллусных клеток
1.2 Этапы микроклонального размножения растений
1.3 Классификация методов микроклонального размножения
1.4 Факторы, влияющие на процесс микроклонального размножения
2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ХРИЗАНТЕМЫ
2.2 Успехи микроклонального размножения хризантемы
3.2 Стерилизация посадочного материала
4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Подбор оптимальных условий стерилизации растительного материала
4.2 Каллусогенез на эксплантах различной локализации
4.3 Влияние фитогормонов на органогенез в культуре in vitro
Хризантема является одной из наиболее популярных декоративно-цветочных культур. Их выращивают не только для срезки. В последние годы все большее распространение получили горшечные формы. Во многих странах хризантемы выращивают круглогодично и считают одной из самых рентабельных культур.
Значительный вред хризантемам причиняют вирусные болезни, резко снижающие урожайность и качество продукции. Наиболее эффективным методом освобождения от вирусной инфекции является метод культуры апикальных меристем. Этот метод является также способом массового размножения, значительно превосходящим традиционное вегетативное размножение по выходу конечной продукции. Используя клональное микроразмножение, можно за год получить от одного эксплантата 1010 растений вместо 104 при традиционном подходе. Важно, что растения-регенеранты, как правило, идентичны материнским растениям, не теряют своих сортовых признаков.
К недостаткам культуры апикальных меристем следует отнести необходимость целенаправленного выращивания материнских растений и ограниченное число апексов на нем. Преодолеть эту проблему в значительной мере позволяет использование другого способа микроклонального размножения, а именно, индукции морфогенеза в каллусной ткани. Причем каллус может быть получен практически из любых частей растения, в том числе и из материала, считающегося отходами работы флористов - листья, стебли, лепестки.
Сортовое многообразие хризантем в значительной степени проявляется на уровни тотипотентности клеток и регенерационном потенциале, что вызывает необходимость дифференцированного подхода к применению и совершенствованию технологии клонального микроразмножения для каждого изучаемого генотипа.
Цель работы: отработка технологии микроклонального размножения кустовой хризантемы сорта Зембла.
1. Подобрать оптимальные условия стерилизации растительного материала.
2. Определить зависимость каллусогенеза от локализации экспланта в материнском растении.
3. Выявить оптимальное сочетание фитогормонов для индукции каллусогенеза.
4. Оценить влияние фитогормонов на органогенез в культуре in vitro.
Микроклональное размножение - это выращивание в пробирке на специальной питательной среде из частей растения-донора полноценных дочерних растений, которые затем адаптируют к обычным климатическим условиям. Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения. Во-первых, все получаемые клоны - абсолютные генетические копии исходного «родительского» растения, освобожденные от вирусов. Во-вторых, от одного растения-донора возможно получить огромное количество потомков. В-третьих, растения быстрее развиваются и переходят к репродуктивной фазе, что имеет значение для селекции. Кроме того, в лабораториях такую работу можно проводить круглый год и значительно экономить посадочные площади. Важно, что процесс выращивания также возможно автоматизировать и внедрять в промышленных масштабах (Егорова, 2003).
Термин "клон" был предложен в 1903 году Уэбстером (от греческого klon - черенок или побег, пригодный для размножения растений). В соответствии с научной терминологией клонирование подразумевает получение идентичных организмов из единичных клеток. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:
- получение генетически однородного посадочного материала;
- освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;
- высокий коэффициент размножения (105 - 106 - для травянистых, цветочных растений, 104 - 105 - для кустарниковых древесных растений и 104 - для хвойных);
- сокращение продолжительности селекционного процесса;
- ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
- размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
- возможность проведения работ в течение всего года;
- возможность автоматизации процесса выращивания.
Пионером клонального микроразмножения считается французский ученый Жан Морель, который в 50-х годах двадцатого века получил первые растения - регенеранты орхидей. В это время техника культивирования апикальных меристем in vitro была уже хорошо разработана. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы и т.д. В нашей стране работы по микроклональному размножению были начаты в 30-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН. Под руководством Р.Г. Бутенко были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы и других растений и предложены промышленные технологии. В дальнейшем исследования по клональному микроразмножению охватили и древесные растения (Микроклональное… 2011).
Первые работы по культуре тканей древесных растений были связаны с именем Готре, который показал, что камбиальные ткани некоторых растений способны к каллусогенезу in vitro. Но первые растения - регенеранты осины, доведенные до почвенной культуры, были получены лишь в середине 60-х годов Матесом. Культивирование тканей хвойных пород in vitro долгое время редко использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования тканей, изолированных из растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные растения характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и так далее), которые в изолированных тканях активируются. Окисленные фенолы обычно ингибируют деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или уменьшению способности тканей древесных растений к регенерации адвентивных почек, которая с возрастом растения-донора исчезает практически полностью. В настоящее время, несмотря на перечисленные трудности, насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, сосна, ель, секвойя и другие).
Области применения микроклонального размножения разнообразны, и имеют тенденции к их постоянному расширению. Это в первую очередь относится к размножению in vitro взрослых древесных пород, особенно хвойных и использованию техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений (Микроклональное… 2011).
Каллусом называют недифференцированные клетки, являющиеся тотипотентными и способными поэтому дать начало целому растению. Являются объектом генетической инженерии. В биологии растений каллусом называют также клетки, образующиеся на раневой поверхности растения в виде опробковевающей ткани, которая возникает в результате деления пограничных с раной клеток. Каллусная ткань способствует зарастанию ран, срастанию прививок и так далее (Получение… 2011).
Каллусная клетка имеет цикл развития такой же как у всех других клеток: деление, растяжение, дифференцировку, старение и отмирание. Дифференцировка каллусных клеток - вторичная. Рост каллусных тканей подчиняется общим закономерностям. Кривая роста каллусных тканей имеет характер S-образной кривой (ростовая кривая Сакса) и включает 5 фаз, длительность которых зависит от вида растения (рис. 1).
Первая фаза - латентная, или лаг-фаза, заключается в подготовке клеток к делениям.
Вторая - фаза экспоненциального роста (логарифмическая). В это время митотическая активность небольшая, рост идет с ускорением, масса каллуса увеличивается.
Третья фаза - линейная, характеризуется постоянной скоростью роста каллусной массы.
Четвертая - фаза замедленного роста, во время которой интенсивность деления клеток резко снижается.
Во время пятой фазы - стационарной - масса каллуса не увеличивается, так как начавшееся отмирание клеток еще компенсируется за счет их деления. Далее следует отмирание каллуса (Егорова, 2003).
Культивируемые in vitro каллусные клетки сохраняют многие физиолого-биохимические особенности, присущие нормальным клеткам, входящим в состав растительного организма. Каллусные клетки сохраняют способность к синтезу вторичных метаболитов, устойчивость к высоким, низким температурам и осмотически активным веществам, к засолению. Каллусным тканям присуща также фотопериодическая реакция, что связано с сохранением активности фитохрома. Вместе с этим каллусные клетки обладают отдельными свойствами, отличающими их от нормальных клеток. У них появляются специфические белки и уменьшается количество белков, которые характерны для фотосинтезирующих клеток листа, либо вообще исчезают. Каллус и каллусные клетки отличаются значительной генетической гетерогенностью и физиологической асинхронностью.
Физиологическая асинхронность характеризуется тем, что в одно и то же время ростового цикла одни клетки делятся, другие растут, третьи находятся в стадии физиологической зрелости, четвертые стареют. Однако общее физиологическое состояние оценивается асинхронной популяции оценивается по состоянию преобладающего числа клеток.
Причины асинхронности популяции клеток in vitro различны. Одной из причин асинхронности популяции может быть особенности вида, сорта, генотипа индивидуального растения и экспланта, выбранных для получения первичного каллуса. Асинхронность популяции может быть вызвана также стрессами культивирования, в частности неоптимальной средой для данного типа клеток. Изменение баланса эндогенных гормонов в течение цикла выращивания и концентрации экзогенных гормонов в среде, физические факторы, такие как свет, температура, аэрация, также могут влиять на физиологическое состояние клеток. И, наконец, причина асинхронности популяции может быть связана с генетической гетерогенностью клеток и клонов.
Генетическая гетерогенность - нестабильность генома. Из известных причин этого можно выделить следующие:
1. Генетическая гетерогенность определенного вида, сорта, органа, ткани, которые используются как экспланты для получения первичного каллуса.
2. Обычно клетки экспланта выходят из митотического цикла в G1-фазе. Таким образом, деление клеток экспланта связано с синтезом ДНК в необычных для клеток экспланта условиях, что может привести к аномалиям митоза.
3. Условия in vitro, в которых культивируется эксплант и возникает первичный каллус при перепрограммировании клетки первых делениях каллуса, могут быть аномальными.
4. Мутагенное действие экзогенных гормонов и стимуляторов.
5. Длительное субкультивирование каллусных культур, приводящее к накоплению в популяции генетически измененных клеток и клонов.
В результате действия перечисленных факторов популяция клеток может иметь в своем составе полиплоидные, моноплоидные и анеуплоидные клетки, а также клетки с хромосомными аберрациями.
После периода перестройки наступает период стабилизации генома популяции. Процесс стабилизации кариотипа разных штаммов клеток, полученных либо от первичного каллуса, либо от разных эксплантов и трансплантов, обычно требует около 5-6 субкультивирований при обязательном сохранении неизменных условий выращивания. В процессе генетических изменений в клетках растений происходит их адаптация к измененным условиям. После 5-6 пересадок стабилизация кариотипа завершается и цитогенетическая характеристика популяции в константных условиях выращивания бывает сравнительно устойчивой.
Следует особо отметить, что генетическую гетерогенность клеток любой популяции не следует рассматривать как недостаток, более того, это, как правило, необходимое условие ее существования, основа адаптационных возможностей популяции (Биотехнология… 2011).
Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают (Урманцева, 1988):
- рыхлые, сильно оводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки;
- средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;
- плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов. Как правило, в длительной культуре на средах, содержащих ауксины, каллусные ткани теряют пигментацию и становятся рыхлыми.
В цикле выращивания каллусной ткани клетки после ряда делений приступают к росту растяжением, дифференцируются как зрелая каллусная ткань и деградируют. Для того, чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и дальнейшему росту, а также отмирания каллусных клеток, первичный каллус переносят на свежую питательную среду через 28-30 дней, то есть проводят пассирование или субкультивирование каллусной ткани.
Неорганизованно растущая каллусная ткань характеризуется тремя типами клеток: мелкими, средними и крупными. При пассировании ткани на среду, содержащую индукторы органогенеза, мелкие клетки приступают к делению и формируют меристематические очаги. Деление клеток меристематического очага приводит либо к формированию почек и последующему развитию из них побегов (геммогенез), либо к ризогенезу.
Каллусы с высоким морфогенетическим потенциалом обычно матовые, компактные, структурированные, имеют зеленые хлорофиллсодержащие участки, которые представляют собой зоны морфогенеза. Впоследствии там формируются побеги или растения-регенеранты. В культуре также встречаются каллусы рыхлые, не имеющие глобулярного характера. Такие каллусы либо совсем не способны к органогенезу, либо формируют только корни. Появление корней свидетельствует о сдвиге гормонального баланса в сторону ауксинов, что препятствует образованию побегов. Эти каллусы могут остаться ризогенными, и регенерировать из них растения не удастся (Баев,1984).
микроклональный размножение хризантема каллусный
Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:
1) Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.
2) Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.
3) Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).
4) Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.
Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.
На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100-200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.
На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4-24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4--5 мг/л), дитиотриэтол (1--3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2--5 мг/л), поливинилпирролидон (5000--10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5-1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.
Второй этап - собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.
Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов - ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.
При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5-10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.
Последующие этапы - укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5-1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют в-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК (Загоскина, 2009).
Укоренение микропобегов проводят двумя способами:
1) выдерживание микропобегов в течение нескольких часов (2-24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20-50 мг/л) и последующее их культивирование на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);
2) непосредственное культивирование микропобегов в течение 3-4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1-5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта). В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Для картофеля возможно использовать безсубстратную гидропонику для получения мини-клубней. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствует укоренению микропобегов.
Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений -- весна или начало лета.
Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85-90° С в течение 1-2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).
Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20-22° С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65-90%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.
Через 20-30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.
Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.
Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость (Бутенко, 1987).
Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. В основе клонального микроразмножения лежит явление тотипотентности, то есть способности растения структурно и функционально восстанавливаться из части, органа или отдельной клетки. Тотипотентность проявляется в клетках, называемых меристемоидами - морфогенетически компетентными клетками, которые отвечают на индукторы дифференцировки и состав сред образованием побегов, корней, зародыша. Их отличает крупное ядро, густая цитоплазма и небольшая вакуоль. Такие активно делящиеся клетки расположены в недифференцированной ткани верхушечных (апикальных) меристем, а также меристем пазушных и спящих почек, стебля и т.п.
Образование меристематических тканей может быть индуцировано в культуре in vitro из специализированных тканей. В этом случае возникают добавочные меристематические ткани (процесс дедифференциации) в виде точек роста или соматических эмбриоидов. В дальнейшем происходит регенерация из меристематических тканей по пути органогенеза или соматического эмбриогенеза. Добавочные меристемы формируются непосредственно в родительской ткани, из промежуточного каллуса или клеток суспензионных культур.
Существующие методы клонального микроразмножения можно классифицировать в зависимости от типа меристематической ткани, используемой для регенерации, а также особенностей протекания процесса регенерации на три основных подхода:
1. Активация развития уже существующих в растениях меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля);
2. Индукция образования новых стеблевых почек или эмбриоидов непосредственно на тканях экспланта
3. Возникновение почек или эмбриоидов из первичного и пересадочного каллуса, суспензионной культуры клеток или протопластов.
Принципиальное отличие второго и третьего подходов от первого заключается в образовании новых меристематических зон среди специализированных клеток в результате процесса дедифференциации. Первый подход является наиболее естественным и предпочтительным, поскольку в нем участвуют уже сформировавшиеся меристемы, особенностью которых является генетическая стабильность. При использовании в качестве эксплантов дифференцированных тканей растений, образующих адвентивные почки или эмбриоиды, вероятность появления мутантных форм возрастает. Особенностью третьего подхода является образование почек или эмбриоидов через стадию каллуса, суспензионной культуры или протопластов, что еще более повышает возможность возникновения мутаций.
Активация развития уже существующих в растениях меристем является основным методом клонального микроразмножения. Метод основан на снятии эффекта апикального доминирования. При удалении верхушечной точки роста в пазушных почках возрастает концентрация цитокининов, снижается концентрация ауксинов, индуцируется клеточное деление и рост пазушных почек. Снять эффект апикального доминирования также можно путем добавления в питательную среду цитокининов (6-БАП, кинетин, зеатин). Под воздействием цитокининов происходит также реювенилизация, то есть омоложение тканей. Такие ткани обладают большей способностью к активному росту и регенерации побегов и корней.
Эксплантами для введения в культуру in vitro при этом методе служат апикальные меристемы или кончики побегов после их стерилизации. Апикальные меристемы используются с целью оздоровления посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции. Если проблема вирусов не является актуальной, целесообразно использовать кончики побегов. Следует иметь в виду, что чем больше размер экспланта, тем больше вероятность его успешной пролиферации в культуре in vitro. Однако при этом повышается и опасность инфицирования среды.
Р. Пиерик (1987) предлагает выделять метод однопочковых черенков и метод придаточных почек. Первый не требует применения цитокининов и успешно используется для культуры картофеля, томатов, огурцов и других культур. Второй основан на добавлении в состав среды цитокининов и применяется для размножения декоративных (гербера, гвоздика, розы и других), плодовых (яблоня, груша, вишня, слива и других), ягодных (земляника, смородина, малина, ежевика и других), лесных (береза, тополь, туя, можжевельник) растений.
Второй метод клонального микроразмножения - индукция образования новых стеблевых почек или эмбриоидов непосредственного на тканях экспланта. Он включает ряд процессов: дедифференциацию специализированных клеток, клеточное деление и образование новых меристем, образование и развитие органов. Процесс этот может происходить по пути органогенеза или соматического эмбриогенеза. Эксплант для прямого органогенеза или соматического эмбриогенеза может быть вычленен из многих органов растения (листа, стебля, зародыша, семядолей, чешуй и донца луковиц, корней, апикальных или пазушных меристем). По мнению Р. Пиерик, процесс образования адвентивных побегов лучше происходит в молодых частях растения (зародыши, проростки) или после реювенилизации тканей. Важную роль при этом играют углеводы, а гиббереллины и абсцизовая кислота его ингибируют. Процесс образования адвентивных побегов из тканей листа in vitro известен у 350 видов растений. Двудольные растения образуют почки на листьях чаще, чем однодольные (Микроклональное… 2011).
Важным фактором является соотношение эндогенных регуляторов роста в экспланте и экзогенных - в питательной среде. Некоторые растения (например, цикорий) не требуют для образования адвентивных побегов ни ауксинов, ни цитокининов. Для большинства растений, образующих адвентивные побеги, необходимо наличие цитокининов, которому должно предшествовать наличие ауксинов. Как правило, для таких растений необходима высокая концентрация цитокининов и низкая - ауксинов (бегония, цветная капуста и др.). Для отдельных растений (лилия, гиацинт) достаточно наличия в среде только экзогенных ауксинов. В некоторых случаях возникают эмбриоиды. Такой путь характерен для моркови, льна, рапса. Образование адвентивных почек на сегментах листьев и чешуй чаще всего происходит из эпидермиса.
Адвентивные побеги получены при культивировании сегментов листьев, соцветий и цветочных почек таких двудольных растений как гербера, сенполия, бегония, маргаритка, каладиум и др; сегментов гипокотиля, семядолей, листьев - у представителей рода Вrassica (капуста кочанная, цветная, брюссельская, листовая, брокколи); из сегментов корней - у петунии. Достигнуты успехи в клональном микроразмножении однодольных растений на основе получения адвентивных почек у представителей семейств Liliaceae, Amaryllidaceae, Iridaceae (фрезия, гиппеаструм, амариллис, гиацинт, нарцисс, гладиолусы, лилии, тюльпаны и др.). Эксплантами в этом случае служили луковичные чешуи, сегменты донца луковицы, листья. Третий метод клонального микроразмножения - возникновение почек или
Микроклональное размножение хризантемы сорта "Земба" методом органогенеза каллусной ткани дипломная работа. Биология и естествознание.
Реферат: Спасательные и неотложные аварийно-восстановительные работы в очагах поражения. Скачать бесплатно и без регистрации
Дипломная работа: Государственное регулирование малого и среднего бизнеса
Глобальные Проблемы Человечества Эссе Обществознание
Курсовая работа: Формирование корпоративной культуры, как способ повышения эффективности деятельности фирмы
Курсовая работа: Ревизия и аудит. Скачать бесплатно и без регистрации
Курсовая Работа Маркетинг Новых Товаров
Контрольная работа: Культура кочевого общества
Курсовая Работа На Тему Налог На Транспорт
Реферат: В.Распутин "Пожар". Скачать бесплатно и без регистрации
Курсовая работа по теме Автоматизация учета готовой продукции
Иностранные Произведения Для Итогового Сочинения
Курсовая работа по теме Сравнительная характеристика русской и чеченской народной педагогики
Курсовая работа по теме Принципы российского уголовного права
Ответ на вопрос по теме ГОСы по технологии швейного производства
Дипломная работа по теме Организация документационного обеспечения деятельности службы кадров и направления его совершенствования на примере Акционерного общества 'Информационные спутниковые системы'
Дипломная работа: Содержание авторского права на литературные произведения в России
Эссе По Теме Рациональное Природопользование
Реферат по теме Юридические и финансовые аспекты хозяйствования
Русские Народные Песни Сочинение
Курсовая работа по теме Социализация личности сущность, этапы, содержание
Вплив випромінювання та тиску на мікроорганізми - Биология и естествознание презентация
Донные и придонные рыбы прибрежных вод Керченского пролива (видовой состав, биологическая характеристика, промысел) - Биология и естествознание дипломная работа
Моделирование биохимических и генетических процессов в клетке - Биология и естествознание дипломная работа