Методы определения нуклеиновой последовательности ДНК - Биология и естествознание курсовая работа

Главная

Биология и естествознание
Методы определения нуклеиновой последовательности ДНК

Структура дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Секвенирование как метод исследования нуклеиновых кислот. Определение нуклеотидовой последовательности модифицированным методом Максама и Гилберта. Новейшие методы определения последовательности ДНК.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ОРЛОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
ФАКУЛЬТЕТ БИОТЕХНОЛОГИИ И ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ
по дисциплине: «Прикладная генетическая и белковая инженерия»
на тему: «Методы определения нуклеиновой последовательности ДНК»
Автор работы Сдашникова А.Н. 1200441 Био-421_____
Направление 19.03.01-Биотехнология______
Курсовая работа защищена с оценкой _________________
Руководитель курсовой работы к.б.н., старший преподаватель
1.Нуклеиновые кислоты. Структура дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)
2. Секвенирование как метод исследования нуклеиновых кислот
3. Определение нуклеотидовой последовательности модифицированным методом Максама И Гилберта
4. Секвенирование ДНК методом Сегнера
5. Достоверность секвенирования ДНК
6. Новейшие методы определения последовательности ДНК
Актуальность исследования: Разработка методов клонирования и определения последовательности оснований (секвенирования) нуклеиновых кислот положила начало новому этапу развития молекулярной биологии. Знание первичной структуры участков генома, выполняющих определенные функции, дало возможность эффективно применить для их исследования целый арсенал новых методов генной инженерии. Эти методы (направленный мутагенез, рекомбинация in vitro и др.) позволяют модифицировать участки нуклеотидных последовательностей и исследовать их функции на молекулярном уровне. С их помощью комбинируются участки генетического материала и создаются геномы с совершенно новыми функциями [30].
К 1977 г. А. Максамом, У. Гилбертом и Ф. Сэнджером (Gilbert W., 1981; Sanger F., 1981) были разработаны специальные методы определения нуклеотидных последовательностей ДНК, которые получили название секвенирование (от англ. sequence - последовательность). Эти методы сыграли судьбоносную роль в становлении геномики и генной инженерии. Методы секвенирования основаны на создании набора одноцепочечных фрагментов ДНК, оканчивающихся определенным нуклеотидом, для чего используются специфические рестриктазы. Разработаны разные методические подходы секвенирования и способы выделения набора фрагментов. В настоящее время высокий уровень технического оснащения сделал секвенирование достаточно рутинной лабораторной работой [12].
Сейчас многие исследователи продолжают разработку более емких и быстрых способов и подходов секвенирования и добиваются в этом значимых успехов. Таким образом, вполне закономерно, что в ближайшем будущем появятся еще более совершенные автоматические секвенаторы, что приведет к резкому увеличению числа расшифрованных последовательностей. Исходя из этого, изучение методов определения нуклеиновой последовательности ДНК становится особенно актуальным.
Благодаря знанию генетического кода появилась возможность определять участки нуклеотидных последовательностей, кодирующих потенциальные белки. Этот источник и сегодня дает нам основную информацию о функциональном строении нуклеотидной последовательности.
Цель работы: Изучить методы определения нуклеиновой последовательности ДНК.
1. Дать определение нуклеиновой кислоты и изучить структуру дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК);
2. Рассмотреть метод секвинирования, его основные принципы и виды;
3. Изучить методы Максама-Гилберта и Сегнера как основные методы секвенирования;
4. Обозначить способы выявления достоверности секвенирования;
5. Выделить новейшие методы определения последовательности ДНК.
Прежде чем приступить к анализу методов секвенирования, необходимо определить понятие и значение нуклеиновых кислот, в частности ДНК.
Нуклеиновые кислоты - фосфорсодержащие биополимеры живых организмов, обеспечивающие хранение и передачу наследственной информации. Их макромолекулы состоят из неоднократно повторяющихся звеньев, которые представлены нуклеотидами. И их логично назвали полинуклеотидами [2]. Одной из главных характеристик нуклеиновых кислот является их нуклеотидный состав. В состав нуклеотида (структурного звена нуклеиновых кислот) входят три составные части:
- Азотистое основание. Может быть пиримидиновое и пуриновое. В нуклеиновых кислотах содержатся основания 4-х разных видов: два из них относятся к классу пуринов и два - к классу пиримидинов.
- Моносахарид - рибоза или 2-дезоксирибоза. Сахар, входящий в состав нуклеотида, содержит пять углеродных атомов, т.е. представляет собой пентозу. В зависимости от вида пентозы, присутствующей в нуклеотиде, различают два вида нуклеиновых кислот - рибонуклеиновые кислоты (РНК), которые содержат рибозу, и дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), содержащие дизоксирибозу [3].
Нуклеотид по своей сути - это фосфорный эфир нуклеозида. В состав нуклеозида входят два компонента: моносахарид (рибоза или дезоксирибоза) и азотистое основание.
Азомтистые основамния - гетероциклические органические соединения, производные пиримидина и пурина, входящие в состав нуклеиновых кислот. Для сокращенного обозначения пользуются большими латинскими буквами. К азотистым основаниям относят аденин (A), гуанин (G), цитозин (C), которые входят в состав как ДНК, так и РНК. Тимин (T) входит в состав только ДНК, а урацил (U) встречается только в РНК.В таблице 1 приведена структура главных азотистых оснований.
Структура главных азотистых оснований
Структура дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)
Первичная структура ДНК - порядок чередования дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (дНМФ) в полинукпеотидной цепи.
Каждая фосфатная группа в полинукпеотидной цепи, за исключением фосфорного остатка на 5'-конце молекулы, участвует в образовании двух эфирных связей с участием 3'- и 5'-углеродных атомов двух соседних дезоксирибоз, поэтому связь между мономерами обозначают 3', 5'-фосфодиэфирной [10].
Концевые нуклеотиды ДНК различают по структуре: на 5'-конце находится фосфатная группа, а на 3'-конце цепи - свободная ОН-группа. Эти концы называют 5'- и 3'-концами. Линейная последовательность дезоксирибонуклеотидов в полимерной цепи ДНК обычно сокращённо записывают с помощью однобуквенного кода, например -A-G-C-T-T-A-C-A- от 5'- к 3'-концу.
Вторичная структура ДНК. В 1953 г. Дж. Уотсоном и Ф. Криком была предложена модель пространственной структуры ДНК. Согласно этой модели, молекула ДНК имеет форму спирали, образованную двумя полинуклеотидными цепями, закрученными относительно друг друга и вокруг общей оси. Двойная спираль правозакрученная, полинуклеотидньхе цепи в ней антипараллельны, т.е. если одна из них ориентирована в направлении 3'>5', то вторая - в направлении 5'>3'.
Двойная спираль ДНК. Молекулы ДНК состоят из двух антипараллельных цепей с комплементарной последовательностью нукпеотидов. Цепи закручены относительно друг друга в правозакрученную спираль так, что на один виток приходится примерно 10 пар нуклеотидов.
Молекулы ДНК расположены 5'-конец одной цепи и 3'-конец другой цепи [25].
Все основания цепей ДНК расположены внутри двойной спирали, а пентозофосфатный остов - снаружи. Полинуклеотидные цепи удерживаются относительно друг друга за счёт водородных связей между комплементарными пуриновыми и пиримидиновыми азотистыми основаниями А и Т (две связи) и между G и С (три связи). При таком сочетании каждая пара содержит по три кольца, поэтому общий размер этих пар оснований одинаков по всей длине молекулы. Водородные связи при других сочетаниях оснований в паре возможны, но они значительно слабее. Последовательность нуклеотидов одной цепи полностью комплементарна последовательности нуклеотидов второй цепи. Комплементарые основания уложены в стопку в сердцевине спирали. Между основаниями двухцепочечной молекулы в стопке возникают гидрофобные взаимодействия, стабилизирующие двойную спираль.
Третичная структура ДНК (суперспирализация ДНК). Каждая молекула ДНК упакована в отдельную хромосому. В диплоидных клетках человека содержится 46 хромосом. Общая длина ДНК всех хромосом клетки составляет 1,74 м, но она упакована в ядре, диаметр которого в миллионы раз меньше. Чтобы расположить ДНК в ядре клетки, должна быть сформирована очень компактная структура. Компактизация и суперспирализация ДНК осуществляются с помощью разнообразных белков, взаимодействующих с определёнными последовательностями в структуре ДНК. Все связывающиеся с ДНК эукариотов белки можно разделить на 2 группы: гисгоновые и негистоновые белки. Комплекс белков с ядерной ДНК клеток называют хроматином [19].
Методы исследования нуклеиновых кислот (молекулярно-генетические методы) -- большая и разнообразная группа методов, в конечном счете, предназначенных для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований [4]. В основе этих методов лежат «манипуляции» с ДНК и РНК. В результате бурного развития молекулярной генетики человека в 70--80-х годах и последующего успешного изучения генома человека молекулярно-генетические методы широко вошли в медико-генетическую практику. Часть ферментов, применяемых для исследования ДНК, представлена в таблице 2.
Основные ферменты, используемые в генной инженерии
Расщепляют ДНК по специфическим последовательностям нуклеотидов
Получение фрагментов ДНК, создание химерных молекул ДНК
Деградация как 5'-, так и 3 '-концов ДНК
Образование концевых делеций в молекулах ДНК
Катализирует образование связей между молекулами ДНК
Синтез двухцепочечной ДНК по ДНК-матрице
Вносит одноцепочечные разрывы в ДНК
Синтез кДНК по мРНК: картирование ДНК
В последнее время молекулярная биология достигла больших высот, которые стали во многом возможны благодаря разработанным во второй половине 1970-х годов быстрым методам секвенирования ДНК. Слишком важной и нужной оказалась информация о последовательности нуклеотидов в ДНК. При этом следует отметить, что нынешнее секвенирование ДНК уже только напоминает то, что было в самом начале [10]. Исходя из стоящих перед конкретными исследователями задач, можно сказать, что есть разное секвенирование ДНК. Многие лаборатории проводят обычное секвенирование отдельных генов и прочих фрагментов ДНК, в то время как другие начинают проводить секвенирование полных геномов некоторых организмов. Такая процедура превратилась в настоящее производство, где многие операции полностью автоматизированы. Последнее является достижением уже не только молекулярной биологии, а и смежных областей науки и техники [6].
Так, секвенирование ДНК, включая многочисленные его составляющие, за четверть века своего эволюционирования претерпело целый ряд многочисленных преобразований и улучшений. На данном этаперазвития науки не существует единого мнения о том, как продуктивнее использовать методы секвенирования. Так, в обычном секвенировании ДНК на нынешнем этапе кто-то предпочитает использовать одноцепочечные матрицы ДНК, кто-то - двуцепочечные, другие же определяют последовательность ДНК с помощью только циклического секвенирования. Сходная ситуация наблюдается и с типом используемых меток, где выбор простирается от классического радионуклида 32Р до самых последних флуоресцентных красителей.
Итак, секвенирование - это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. В настоящее время нет ни одного метода секвенирования, который бы работал для молекулы ДНК целиком; все они устроены так: сначала готовится большое число небольших участков ДНК (клонируется молекула ДНК многократно и «разрезается» её в случайных местах), а потом читается каждый участок по отдельности. Наработку интересующих последовательностей можно осуществить клонированием соответствующего фрагмента, например, методом ПЦР. Метод секвенирования по Максаму -- Гилберту основан на химическом расщеплении ДНК по определенному основанию. Другой ферментативный метод (метод Сэнгера) базируется на применении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез комплементарной цепи ДНК по одноцепочечной матрице в месте встраивания в цепь соответствующего аналога. Секвенирование позволяет определить полную нуклеотидную последовательность всех хромосом, всего ДНК любого генома, любого организма. Этот метод позволяет определить последовательность нуклеотидов любых генов, что дает возможность их синтеза [21].
Клонирование происходит либо просто выращиванием клеток в чашке Петри, либо (в случаях, когда это было бы слишком медленно или по каким-то причинам не получилось бы) при помощи так называемой полимеразной цепной реакции. В кратком и неточном изложении работает она примерно так: сначала ДНК денатурируют, т.е. разрушают водородные связи, получая отдельные нити. Затем к ДНК присоединяют так называемые праймеры; это короткие участки ДНК, к которым может присоединиться ДНК-полимераза - соединение, которое, собственно, и занимается копированием (репликацией) нити ДНК. На следующем этапе полимераза копирует ДНК, после чего процесс можно повторять: после новой денатурации отдельных нитей будет уже вдвое больше, на третьем цикле - вчетверо, и так далее [22].
Все эти эффекты достигаются в основном с помощью изменений температуры смеси из ДНК, праймеров и полимеразы; для наших целей важно, что это достаточно точный процесс, и ошибки в нём редки, а на выходе получается большое число копий участков одной и той же ДНК. Разные методы секвенирования отличаются друг от друга не методами клонирования, а тем, как потом прочесть получившийся «суп» из многочисленных копий одной и той же ДНК.
Сейчас, все имеющиеся принципы и аналитические возможности современных методов секвенирования ДНК можно условно разделеть на три основных вида: классические - секвенирование с помощью капиллярного электрофореза и пиросеквенирование; новые («второго» поколения) - проводят одновременно секвенирование миллионов фрагментов ДНК, каждый из которых представлен кластером из многих тысяч или сотен тысяч своих клонов - это высокопроизводительное пиросеквенирование, циклическое лигазное и полупроводниковое секвенирование; секвенирование на молекулярных кластерах с использованием флуоресцентно меченных предшественников; новейшие («третьего» поколения) методы секвенирования, которые считывают информацию с миллионов единичных фрагментов ДНК без их предварительного клонирования. К ним относятся технология секвенирования одной молекулы, секвенирование единичных молекул в реальном времени и секвенирование через нанопоры. В нашем исследовании мы наиболее подобно рассмотрим два наиболее известных метода секвенирования: методы Максама-Гилберта и Сегнера. Также мы обсудим особенности новейших методов и технологий секвенирования [23].
Метод Максама и Гилберта основан на химической деградации ДНК. Он был предложен в 1976 году Максамом и Гилбертом и назван их именем. Суть метода сводится к следующему: один из концов фрагмента ДНК метят с помощью изотопа фосфора 32Р. В последнее время вместо радиоактивной вводят флюоресцирующую метку [1]. Ее можно «цеплять» и к нуклеотидам, причем для каждого типа нуклеотидов подбирать различную окраску. Препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно или два из четырех оснований, причем условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений.
Разрушение идет в 2 этапа. На первом этапе происходит модификация азотистого основания и последующее выщепление его. На втором этапе производят гидролиз ДНК в местах выщепления оснований. Пуриновые основания модифицируются диметилсульфатом. Адениновые остатки метилируются по третьему атому азота, гуаниновые - по положению N7. Если такую модификацию обработать 0,1 М HCl при 0оС, то выщепляется метиладенин. При последующей инкубации в щелочной среде (0,1 М NaOH) при температуре +90оС происходит разрушение сахаро-фосфатной связи в местах выщепления оснований. Обработка поврежденных молекул пиперидином приводит к гидролизу ДНК по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируются гидразином. В бессолевой среде модифицируется и цитозин, и тимин, в присутствии 2 М NaCl модифицируется только цитозин. При дальнейшей обработке пиперидином происходит расщепление ДНК по точкам модификации. Можно использовать и другие реакции химической модификации оснований и расщепления по ним молекул ДНК [31]. В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу в четырех соседних дорожках; затем проводят радиоавтографию, и те фрагменты, которые содержат радиоактивную метку, оставляют "отпечатки" на рентгеновской пленке. По положению отпечатков можно определить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разрушенное основание, а зная это основание - его положение. Так набор полос на рентгеновской пленке определяет нуклеотидную последовательность ДНК. Аналогично наблюдают флюоресцентное окрашивание. Если для каждого из четырех нуклеотидов был подобран свой цвет флюоресцентной метки, то при электрофорезе их наносят на 1 дорожку. Тогда расположение нуклеотидов отмечено штрихами разного цвета, а процедуру считывания легко автоматизировать [1].
Реакции селективной модификации по каждому типу гетероциклических оснований проводятся таким образом, чтобы в каждой молекуле ДНК в среднем модифицировалось только одно звено данного типа. Поскольку все звенья данного типа в составе молекулы эквивалентны и реагируют с модифицирующим агентом с одинаковыми скоростями, то в сумме каждое звено этого типа окажется частично модифицированным. Дальнейшая обработка ДНК вторичным амином или щелочью приводит к отщеплению модифицированных гетероциклических оснований от цепи ДНК и разрыву полинуклеотидной цепи в местах отщепления гетероциклов (рис. 1) [2].
Модификации подвергают ДНК, 32Р-меченные по 5'-концевому нуклеотидному звену. Радиоактивная метка вводится фосфорилированием с помощью -32Р-АТР и Т4-полинуклеотидкиназы [5].
Рисунок 1. Отщепление модифицированных звеньев от цепи ДНК после обработки вторичным амином или щелочью.
Таким образом, в результате химической деградации получается набор фрагментов ДНК различной длины. Длины этих фрагментов соответствуют положению мономерных звеньев того типа, который подвергался модификации. Концевая радиоактивная метка служит точкой отсчета при определении длины продуктов химической деградации ДНК (рис. 2)
Набор полученных фрагментов фракционируется электрофорезом в ПААГ, который позволяет разделять олиго (поли) нуклеотиды, отличающиеся по длине всего на одно мономерное звено. Последовательность нуклеотидов в ДНК читается непосредственно с радиоавтографа геля [8].
Метод Максама и Гилберта, разработанный для анализа первичной структуры достаточно длинных ДНК, применим и для коротких (8 - 16 звенных) оли-годезоксирибонуклеотидов. Однако в этом случае реакции химической модификации проводят в более жестких условиях (увеличивая время и температуру реакции) с целью повышения степени модификации.
Рисунок 2. Химическая деградация ДНК.
Набор реакций, применяемых для расщепления ДНК по мономерным звеньям определенного типа достаточно велик и постоянно пополняется: по остаткам гуанина - обработка диметилсульфатом (рис. 3); по остаткам аденина и гуанина - апуринизация 50%-ной муравьиной кислотой (по Бартону); по остаткам аденина и цитозина - расщепление гетероциклических оснований под действием 1,2 н. гидроксида натрия и по остаткам тимидина и цитозина - обработка гидразином (рис. 4).
В настоящее время широко используются два основных варианта секвенирования по Максаму -- Гилберту. В первом из них реакции химической модификации ДНК проводят в растворе, а во втором ДНК предварительно иммобилизуют на твердой фазе (например, ДЭАЭ-целлюлозе). Первый метод более традиционен, его многочисленные модификации с успехом использовались для секвенирования фрагментов ДНК различных размеров, в том числе олигонуклеотидов. В то же время второй метод имеет ряд преимуществ. Он менее трудоемок и занимает меньше времени, проще в освоении, позволяет обойтись минимальным набором оборудования. В целом оба метода обеспечивают получение вполне приемлемых результатов, а выбор одного из них определяется конкретными условиями лаборатории.
Рисунок 3. Реакция селективного расщепления по остаткам гуанина
Рисунок 4. Реакция селективного расщепления по остаткам тимидина и цитозина.
Несмотря на относительно низкую производительность метода секвенирования ДНК путем химической деградации по Максаму-Гилберту в сравнении с ферментативным методом секвенирования ДНК по Сэнгеру, этот метод в настоящее время все же продолжает пользоваться популярностью. Так, метод химической деградации применяется для секвенирования синтетических олигонуклеотидов в тех случаях, когда это необходимо. Данный метод используют в том случае, когда особо "трудные" участки с сильной вторичной структурой не возможно секвенировать с помощью ферментативного построения новой цепи ДНК. К одному из преимуществ метода секвенирования ДНК химической деградацией можно отнести то, что здесь определяется последовательность фрагмента ДНК, или геномного, или клонированного, в каком-либо подходящем векторе (т.е. реплицировавшегося in vivo), а не новосинтезированная in vitro копия, как в ферментативном методе с дидезокситерминаторами. Еще одно отличие метода секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту от метода Сэнгера заключается в том, что его осуществление может начаться практически с любого сайта узнавания какой-нибудь рестрикционной эндонуклеазы, присутствующего во вставке и поэтому не требуется предварительного знания даже небольшого участка нуклеотидной последовательности, окружающего данное место. В этой связи метод секвенирования ДНК путем химической деградации иногда выступает в качестве стартового при выполнении крупномасштабных проектов по определению нуклеотидных последовательностей протяженных фрагментов ДНК [9].
Главным недостатком метода секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту, является высокая токсичность большинства используемых реагентов, обращение с которыми и их дальнейшая утилизация требуют соблюдения определенных правил.
Подводя итог, можно выделить основные компоненты процесса секвенирования по методу Максама-Гилберта: принцип секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту, мечение фрагментов ДНК по Максаму-Гилберту, подготовка фрагментов ДНК по Максаму-Гилберту, расщепление ДНК по модифицированным основаниям, электрофорез и радиоавтография по Максаму-Гилберту.
Другой метод, разработанный Сэнгером и носящий его имя, основан не на химическом, а на ферментативном подходе. Cэнгер использовал ДНК-полимеразу I. В клетке этот фермент участвует в процессе репликации, заполняя пробелы между вновь синтезированными фрагментами ДНК (фрагментами Оказаки) [22]. Для работы фермента в пробирке требуются предшественники ДНК - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), а также одноцепочечная матрица, на которой должен быть небольшой двухцепочечный участок - затравка, с которого начинается синтез (рис. 5).
Рисунок 5. Ферментативный метод секвенирования ДНК
Были также синтезированы модифицированные дидезоксирибонуклеотиды, в которых дезоксирибоза 3'-ОН отсутствует, для каждого из четырех оснований ДНК. ДНК-полимераза включает эти предшественники в ДНК. Однако, включившись в ДНК, модифицированное основание не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В результате рост (элонгация) данной цепи останавливается (терминируется) в том месте, где в ДНК включился дидезоксирибонуклеотид (ddNTP). Поэтому их называют терминаторами элонгации
Реакционная смесь по Сэнгеру состоит из цепи ДНК, нуклеотидную последовательность которой надо определить, короткого фрагмента "меченой" ДНК, комплементарной концевому отрезку этой цепи (затравка), одного из четырех ddNTP и соответствующего dNTP в строго определенном соотношении (чтобы они конкурировали), а также остальных трех dNTP. Готовят четыре смеси, каждая из которых содержит один из четырех ddNTP. В каждой из пробирок образуется набор меченых фрагментов разной длины. Длина их зависит от того, в каком месте в цепь включен дефектный нуклеотид. Полученные меченые фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном геле (с точностью до одного нуклеотида), проводят радиоавтографию и по картине распределения фрагментов в четырех пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК [24].
Сразу вслед за разработкой быстрых методов секвенирования появились столь же быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной последовательностью. Теперь за три-четыре дня можно синтезировать последовательность из 12 - 20 нуклеотидов. Автоматизация этой процедуры еще более облегчает и ускоряет синтез. Появились приборы - ДНК-синтезаторы, которые выполняют эту работу за несколько часов.
В настоящее время выделение фрагментов ДНК, создание рекомбинантных генов, а так же прямое секвенирование ДНК и кДНК становятся общедоступными методами благодаря широкому внедрению ПЦР (полимеразной цепной реакции). Сущность ПЦР заключается в использовании двух олигонуклеотидов-праймеров, способных специфически гибридизоваться с последовательностями нуклеотидов на противоположных концах двух цепей участка ДНК, в качестве затравки для одновременного синтеза комплементарных цепей с противоположных концов матрицы с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. В ходе повторяющихся циклов (температурной денатурации ДНК, отжига и энзиматической достройки праймеров) экспоненциально увеличивается количество дискретного фрагмента, фланкированного последовательностями нуклеотидов, соответсвующих первичной структуре праймеров [23].
Применимость метода Сэнгера зависит от возможности получения одноцепочечных копий клонированных ДНК. Для этой цели можно использовать векторы на основе бактериофага М13. Двухцепочечную чужеродную ДНК можно клонировать в двухцепочечной репликативной форме (РФ) фаговой ДНК, при этом после трансформации в белковую оболочку будет упаковываться только одна из цепей ДНК. Во всех векторах типа М13тр используются сходные полилинкерные последовательности, поэтому для инициации полимеразных реакций пригоден один и тот же универсальный праймер. При амплификации смеси генов (например, семейства генов) необходимо провести клонирование ПЦР-продуктов в векторах типа М13, в результате каждый фаг будет содержать только одну вставку. При прямом секвенировании смеси генов наблюдается несколько одинаково расположенных полос в разных дорожках геля. При амплификации же одного гена можно проводить прямое секвенирование, не прибегая к промежуточному субклонированию[23] .
Выбор оптимального праймера для ПЦР зависит от 5 '- и 3 '-концевых последовательностей амплифицируемого фрагмента ДНК. Кроме того, для встраивания ПЦР-продукта в полилинкерный сайт вектора М13 в 5'-конец праймеров должны быть включены подходящие рестрикционные сайты. В этом случае ПЦР-амплификация с последующей рестрикцией продукта позволит провести его встраивание в ДНК М13, рестрицированную тем же ферментом. В разные концы амплифицируемого фрагмента лучше включать сайты для разных рестриктаз, поскольку это позволит избежать отжига векторной ДНК самой на себя и обеспечит положение клонированной вставки в определенной ориентации (так называемое направленное клонирование). При подборе праймеров необходимо учитывать следующие факторы [27].
а. Следует убедиться в том, что амплифицируемое семейство генов не содержит консервативного внутреннего рестрикционного сайта, идентичного сайту, включенному в праймер.
б. После включения рестрикционного сайта 5' - конец праймера нужно удлинить, в противном случае рестриктаза не будет расщеплять праймер. Необходимая для каждого фермента длина выступающего участка и время рестрикции указаны в каталоге фирмы New England BioLabs.
Перед секвенированием двухцепочечную рекомбинантную ДНК М13 необходимо перевести в одноцепочечную форму. Для этого ее вводят путем трансформации в компетентные клетки E. сoli. Бляшки, содержащие одноцепочечные рекомбинантные фаги, необходимо выколоть, нарастить в бактериальной культуре и депротеинизировать [27].
Затем переносят культуру в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и центрифугируют в микроцентрифуге при 12 000 g в течение 5 минут. Переносят 1 мл супернатанта (содержащего чистый фаг) во вторую пробирку на 1,5 мл, добавляют 200 мкл полиэтиленгликоля и инкубируют при комнатной температуре как минимум 15 минут. Собирают фаг центрифугированием в течении 5 минут при 12 000 g и отбирают супернатант. Быстро повторяют центрифугирование и полностью удаляют все следы супернатанта. Затем осаждают ДНК ацетатом натрия, промывают ее 70%-ным этанолом и высушивают под вакуумом. Растворяют ДНК в 30 мкл воды. Полученная ДНК представляет собой одноцепочечную матрицу для секвенирования.
В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого сегмента ДНК умеренной длины - вполне разрешимая задача. Уже определена последовательность нескольких сотен генов про- и эукариот. Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка. Раньше для определения структуры белка приходилось делать тщательный и весьма трудоемкий анализ выделенного и очищенного белка. Сейчас часто бывает проще определить структуру белка через нуклеотидную последовательность, чем с помощью прямого секвенирования. Если секвенирование белка занимает месяцы и даже годы, то ДНК удается секвенировать за несколько недель.
Определение последовательности ДНК привело также к тому, что были обнаружены области, которые не кодируют белки, но принимают участие в регуляции экспрессии генов и репликации ДНК. В 1996 году был секвенирован геном дрожжей, в 1998 г. - геном арабидопсиса, в 2000 году - геном человека, однако в данном случае речь идет только об установлении последовательности нуклеотидов, так как генетическая структура и функции отдельных участков генома еще не идентифицированы, это более сложная задача [29].
Исходя из вышесказанного видно что, за время, прошедшее со дня разработки метода ферментативного секвенирования ДНК п
Методы определения нуклеиновой последовательности ДНК курсовая работа. Биология и естествознание.
Курсовая работа по теме Оценка стоимости предприятия доходным подходом
Реферат по теме Редкие и исчезающие птицы Ставропольского края
Проверка На Плагиат Курсовой Работы Онлайн
Курсовая работа: Международные валютные отношения и валютная система. Скачать бесплатно и без регистрации
Реферат: Охраняемые природные комплексы. Скачать бесплатно и без регистрации
Дипломная работа по теме Особенности управления проектами на предприятии
Эссем Симпл Палитра
Реферат: Предоставление финансовой отчетности
Принципы и схемы лицензирования программного обеспечения
Реферат по теме Вклад арабских ученых в развитие науки в средние века
Курсовая работа по теме Качественный сравнительный анализ влияния политико-партийных систем постсоциалистических стран на процессы их Европейской интеграции
Образные И Жанровые Основы Музыкального Искусства Реферат
Возведение подземных сооружений методами: ''стена в грунте'', опускным, щитовой проходкой
Реферат Прокуратура Рф Правоохранительные Органы Адвокатура Нотариат
Реферат: Рекреационные ресурсы и их классификация
Дипломная работа по теме Теория реформирования системы налогообложения и практика ее применения в Республике Беларусь
Реферат: Hardness Of Water Essay Research Paper Water
Сочинение На Тему Разговорный Стиль
Курсовая работа: Проектирование станочного приспособления для фрезерного станка
Контрольная Работа Квадратные
Правила пожарной безопасности и первая медицинская помощь - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда контрольная работа
Здоровый образ жизни - Биология и естествознание презентация
Требования безопасности при аварийных ситуациях с аппаратурой для газосварки - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда шпаргалка