Метод ифа результат

Скачать файл - Метод ифа результат

Иммуноферментный анализ сокращённо ИФА , англ. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала. Теоретические основы ИФА опираются на современную иммунохимию и химическую энзимологию, знание физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на основные принципы аналитической химии. ИФА является одним из наиболее активно развивающихся направлений химической энзимологии. Высокая стабильность реагентов, простота методов регистрации, возможность создания каскадных систем усиления различных химических сигналов, относительно низкая цена и многие другие достоинства метода ИФА способствовали его широкому внедрению в различные области медицины, сельское хозяйство, микробиологическую и пищевую промышленность, охрану окружающей среды, а также в научные исследования. По одним лишь вариантам регистрации ферментативной активности возможно применение фотометрических, флуорометрических, био- и хемолюминесцентных методов, а в ряде случаев особенно связанных с решением технологических задач успешно применяются электрохимические и микрокалориметрические датчики. Иммунохимическая реакция в растворе протекает в несколько стадий, первой из которых является обратимое образование комплекса между антителами и антигенами состава 1: Образование комплекса обеспечивается гидрофобными , ионными , ван-дер-ваальсовыми и водородными связями. Наиболее существенную роль играют силы гидрофобного взаимодействия, которые стабилизируют всю систему уменьшают её свободную энергию при одновременном увеличении энтропии. Эффективность таких взаимодействий возрастает с повышением температуры. В простейшем случае взаимодействие одного центра связывания антитела AT с одновалентным антигеном AG может быть представлено схемой. Очевидно, что чем меньше Kd или же, наоборот, больше Ka , тем прочнее образующийся иммунокомплекс. Константа комплексообразования является термодинамическим параметром, характеризующим изменение свободной энергии взаимодействия антиген-антитело, которое может быть рассчитано по формуле:. Изменение энтропии в большинстве случаев положительно, так как активные центры антител в свободном виде доступны растворителю и гидратированы, а при взаимодействии с антигеном из них высвобождаются связанные молекулы воды, что приводит к уменьшению общей упорядоченности системы. Таким образом, говоря об иммунологической специфичности антител, всегда проводят сравнительную оценку эффективности антиген-антитело, которое характеризуется константой равновесия или изменением свободной энергии системы при комплексообразовании. Ранее для количественного описания эффективности взаимодействия антиген-антитело за основу была взята простая модель взаимодействия одновалентного антигена и одновалентного антитела. Но так как молекула антитела имеет несколько антигенсвязывающих центров и, кроме того, способна взаимодействовать с несколькими антигенными детерминантами одной молекулы антигена, то такая характеристика образования иммунохимического комплекса является весьма упрощённой. Для описания более близкого к реальности процесса взаимодействия поливалентного антитела с поливалентным антигеном введён термин авидность , или функциональная аффинность функциональное сродство. С биологической точки зрения именно функциональная аффинность играет основную роль в иммунном ответе на инфицирование организма вирусами или бактериями, имеющими на своей поверхности повторяющиеся антигенные детерминанты. Процесс образования комплекса антиген-антитело состава 1: С энергетической точки зрения образование поливалентного комплекса намного выгоднее, чем моновалентного. Например, эффективная константа комплексообразования IgG может в и более раз превышать константу одиночных связей. Весьма важной и часто используемой на практике характеристикой ферментов является их каталитическая активность. Однако до сих пор часто употребляется старое обозначение каталитической активности, известное как международная единица МЕ , англ. Соотношение между этими единицами следующее:. Для сравнительной оценки различных препаратов фермента часто используют удельную каталитическую активность , то есть каталитическую активность, отнесённую к единицу массы белка. На скорость ферментативной реакции оказывают влияние различные факторы, среди которых основными являются:. Температурные зависимости имеют сложный вид, что обусловлено как термолабильностью белковых молекул, так и влиянием температуры на константы Михаэлиса , константы скоростей распада отдельных фермент-субстратных комплексов и положение pH -оптимума. В области низких температур, когда структура активного центра достаточно стабильна, константа скорости распада фермент-субстратного комплекса описывается уравнением типа Аррениуса. Диапазон pH -оптимума активности может быть весьма узким. Он зависит от ионной силы и вида используемого буфера, меняется с температурой. Определяемая каталитическая активность сильно зависит от используемого субстрата, которые могут быть как природными, так и синтетическими, при этом скорости их превращения также значительно варьируют. К эффекторам относят как ингибиторы, так и активаторы ферментативных реакций, то есть вещества, оказывающие замедляющее или ускоряющее действие на превращение субстрата. В некоторых случаях для ферментативных реакций наблюдается ингибирование высокими концентрациями субстрата или одним из продуктов реакции. Наличие в реакционной среде эффекторов может приводить к нежелательному отклонению скорости ферментативной реакции от линейной зависимости с количеством фермента в системе. В ИФА наибольшее распространение получил фотометрический метод регистрации активности ферментов. В качестве субстратов ферментов при этом используют такие вещества, продукты превращения которых являются окрашенными соединениями или, наоборот, окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции. Поглощение света подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера , в соответствии с которым оптическая плотность раствора в определённом диапазоне прямо пропорциональна концентрации вещества. Для измерения оптической плотности используется спектрофотометр. В последнее время в ИФА получили распространение субстраты, которые образуют продукты, регистрируемые флуориметрическим методом. Молекула при поглощении фотона переходит из основного электронного состояния в возбуждённое. Возбуждённая молекула может вернуться в основное состояние, при этом избыток энергии перейдёт в теплоту, но может произойти обратный процесс перехода электрона на основной уровень, сопровождающийся выделением кванта света, который носит название флуоресценции. Благодаря частичной потере энергии при переходе молекулы из возбуждённого состояния в основное длина волны испускаемого света всегда больше длины волны поглощаемого света. Интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству света, адсорбированного образцом. Таким образом, она прямо пропорциональна концентрации растворённого вещества и абсолютному значению начальной интенсивности света, в то время как в фотометрии сравниваются относительные интенсивности, адсорбированные образцом. За скоростью таких реакций следят по интенсивности свечения реакционной системы, регистрируемой с помощью люминометра. Реакции биолюминесценции катализируются люциферазами светляков и бактерий, а реакция окисления циклических гидразидов перекисью водорода реакция хемолюминесценции катализируется пероксидазой хрена. Известны также электрохимические способы определения активности ферментов, используемых в качестве меток в иммуноанализе. Такие датчики позволяют определить скорость ферментативных реакций в мутных средах и удобны для создания проточных иммуноферментных ячеек. В иммуноферментных методах анализа в качестве метки антигенов и антител могут использоваться как ферменты, так и их субстраты. После проведения всех иммунохимических стадий любого метода ИФА необходимо установить концентрацию меченного ферментом компонента иммунохимической реакции, то есть определить каталитическую активность фермента в пробе. По наблюдаемой скорости реакции судят о концентрации фермента-маркёра в системе. Следует отметить, что ИФА всегда строится на сравнительном определении в идентичных условиях стандартного и измеряемого образца, в связи с чем требование пропорциональности скорости и концентрации является скорее желательным, чем обязательным. Достаточным является существование взаимно однозначного соответствия между количеством образовавшегося продукта ферментативной реакции и количеством фермента в системе. Принципиальная возможность применения ферментов в качестве меток в ИФА обусловлена чрезвычайно высокой чувствительностью регистрации ферментов в растворе. Причём принципиально возможным является значительное уменьшение пределов обнаружения ферментов как за счёт увеличения времени ферментативной реакции, так и увеличения чувствительности регистрации образовавшегося продукта. К выбору ферментных меток в ИФА предъявляется ряд общих требований. Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций. Наиболее доступной является пероксидаза хрена. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислению перекисью окрашенные соединения. Каталитическую активность глюкозооксидазы регистрируют с теми же хромогенами, что и активность пероксидазы, однако чувствительность её определения по сравнению с пероксидазой несколько ниже. Основным достоинством фермента служит полное отсутствие его в плазме крови, что даёт возможность использования этого фермента в гомогенных методах ИФА реагенты для всех стадий ИФА находятся в водном растворе. Щелочная фосфатаза и её конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако имеет относительно высокую стоимость. Разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы НАДФ. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт НАД определяется в ферментативной системе регенерации кофактора. Она катализирует гидролиз лактозы с образованием глюкозы и галактозы. Во всех коммерческих тест-системах используется пероксидаза хрена, выбор которой определяется её высокой удельной каталитической активностью, доступностью, стабильностью, простотой детекции. В качестве субстратного реагента наиболее часто применяется орто-фенилендиамин ОФД или тетраметилбензидин ТМБ с перекисью водорода, продукт окисления которых регистрируется фотометрически. К настоящему времени разработано большое число различных вариантов проведения ИФА, имеющих как принципиальные, так и второстепенные отличия. Единая чёткая классификация всего многообразия методов ИФА в литературе отсутствует, что затрудняет выявление общих закономерностей и проведение сравнительной оценки возможностей различных методов. Обычно рассмотрение методов ИФА осуществляется с позиций разделения на гетерогенные и гомогенные, то есть по принципу проведения всех стадий анализа с участием твёрдой фазы или же только в растворе. Так как процесс образования иммунохимических комплексов происходит в строго количественном соотношении, обусловленном аффинностью, концентрациями компонентов и условиями реакции, то достаточным для определения исходной концентрации анализируемого соединения является количественная оценка образовавшихся иммунных комплексов. В случае анализа антигенов для проведения такой оценки существует два подхода:. Очевидно, что в последнем случае число образовавшихся иммунных комплексов определяется по разности общего числа добавленных антител и числа антител, оставшихся свободными. Классические методы ИФА основаны на образовании антителами в присутствии антигена преципитата осадка , однако для визуальной регистрации процесса преципитации необходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. К тому же, результаты такого анализа не всегда можно однозначно интерпретировать и в большинстве случаев они носят качественный или полуколичественный характер. Кроме того, для многих одновалентных антигенов гаптенов , например, гормонов и лекарственных соединений, эти методы непригодны. Индикация образовавшегося комплекса антиген-антитело в растворе может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов. Так как процесс комплексообразования происходит в строго количественном отношении, то концентрация метки, входящей в состав комплекса, однозначно связана с исходной концентрацией антигена. Для осуществления анализа эффективности комплексообразования необходимо провести полную очистку комплексов от свободных компонентов. Эту задачу оказалось легко решить, если один из компонентов пары антиген-антитело прочно связать иммобилизировать на твёрдом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и осуществить физическое разделение образующихся комплексов от свободных компонентов. Использование иммобилизации антител на твёрдом носителе положило начало методам твердофазного гетерогенного ИФА. Факт сорбции антител на поверхности полистирола был установлен в середине х годов и использован первоначально в методах радиоиммунологического анализа РИА. Введение полистирольных плат в практику ИФА позволило значительно увеличить число проводимых анализов и упростить методическую процедуру его выполнения. Были сконструированы специальные приборы, позволяющие автоматизировать стадии добавления реагентов, промывки и осуществлять одновременную регистрацию каталитической активности фермента-метки в каждой из лунок планшеты. Гетерогенный твердофазный ИФА в микропланшетном варианте получил наибольшее распространение в тест-системах для клинических лабораторных исследований. В качестве твёрдой фазы используется поверхность лунок полистиролового микропланшета, на которую адсорбированы входящие в состав тест-системы известные антигены или антитела называемые в этом случае иммуносорбентом. В ходе специфической реакции иммуносорбента с определяемыми в исследуемом образце антителами или антигенами образуются иммунные комплексы, которые оказываются фиксированными на твёрдой фазе. Субстанции, не участвовавшие в реакции, а также избытки реагентов, удаляются при многократной промывке. Такая схема позволяет упростить процесс эффективного разделения компонентов реакции. В прямом иммуноферментном анализе вносимый материал антиген закрепляется во время инкубации на поверхности чистых лунок. Количество исследуемого материала детектируется с помощью антител к выявляемому антигену, соединенных со специфической меткой, обеспечивающий ферментативную реакцию. Биологический материал кровь, соскобы со слизистых, мазки помещается в чистые лунки на некоторое время обычно 15—30 минут , достаточное, чтобы антигены могли приклеиться к поверхности лунок. Далее в лунки добавляют антитела к выявляемому антигену. Это значит, что выявляя антигены, например, сифилиса, добавляются антитела против антигенов сифилиса. Чем больше в биологической пробе антигенов, тем больше антител свяжется с ними. Поскольку антитела добавляются в избытке, то не все они свяжутся с антигенами, а если антигена вообще нет в пробе, то, соответственно, ни одно антитело не свяжется с искомым антигеном. В промытые лунки добавляют раствор с ферментом и оставляют на 30—60 минут. Данный фермент имеет сродство к веществу специфической метке , с которым связаны антитела. Фермент проводит реакцию, в результате которой эта специфическая метка субстрат превращается в окрашенное вещество продукт. Поскольку добавленная специфическая метка связана с антителами, значит, концентрация окрашенного продукта реакции равна концентрации антител. А концентрация антител равна концентрации антигенов. В прямом иммуноферментном анализе используют антитела к выявляемому антигену, соединенные со специфической меткой. Эта специфическая метка и есть субстрат ферментативной реакции. По типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа в которой происходит связывание определяемого вещества среди гетерогенных методов различают неконкурентный и конкурентный. Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания антиген и специфические антитела , то метод является неконкурентным. Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе , конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным. В лунки, на твёрдой поверхности которых предварительно сорбирован антиген, вносится исследуемый биологический материал чаще всего сыворотка или плазма крови человека , содержащий антитела к антигену. Образец исследуется на содержание антител. Исследуемые антитела из внесённого образца биологического материала во время инкубации связываются с антигеном и таким образом иммобилизируются на поверхности лунки. Несвязавшиеся антитела удаляют отмыванием. В лунку вносят конъюгат, то есть антитело с заранее прикреплённым к нему ферментом например, пероксидазой хрена , способное связаться с антителом, иммобилизированном на первой стадии. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии иммунные комплексы, то конъюгат соединяется с ними во время второй инкубации, а несвязавшийся конъюгат удаляется последующим отмыванием. Далее в лунку добавляется субстратно-хромогенный реагент, который превращается в окрашенный продукт под влиянием ферментного компонента конъюгата. Таким образом, отличие от прямого метода состоит в том, что исследуемые антитела не приклеиваются к поверхности чистой лунки, а связываются с иммобилизированным на планшете антигеном. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. Ферментативная реакция цветная реакция проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически или визуально. По аналогичной схеме работают тест-системы для определения антител, но в качестве иммуносорбента в них используется антиген, а конъюгат содержит раствор антигена, меченного ферментом. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция , вирусные гепатиты , цитомегаловирусная , герпесная , токсоплазменная и другие инфекции. В настоящее время получили распространение тест-системы с использованием стрептавидина и биотинилированных моноклональных антител которые представляют собой смесь высокоочищенных специфичных моноклональных антител к различным эпитопам. Стандарты, контроли и пробы пациентов добавляются в микроячейки, покрытые стрептавидином, затем добавляют биотинилированные антитела, и антитела, меченные ферментом конъюгат. Несвязавшиеся компоненты удаляются промывкой. После инкубации с субстратным раствором фотометрически определяется относительная плотность растворов в лунках. Особенностью таких систем является отдаление ферментной реакции от стенки планшета, поэтому окраска развивается в объёме и тест-система аналитически становится более чувствительной. В случае конкурентного ИФА определяемые антигены или антитела конкурируют с аналогичными меченными антигенами или антителами конъюгата за места связывания с иммуносорбентом. Анализ этого типа часто используют для определения антигенов, присутствующих в высоких концентрациях или гормонов, имеющих только один антиген-связывающий центр. Прямой конкурентный формат ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела , а меченый ферментом и немеченый антиген конкурируют за связь с иммобилизованным антителом. В лунку планшета, на поверхности которой сорбированы антигены, вносят исследуемый образец сыворотку или плазму крови человека и конъюгат, который представляет собой антитела, меченные ферментом. После инкубирования образуются иммунные комплексы двух видов: Чем больше определяемых немеченных антител содержит исследуемый образец, тем больше конкуренция с меченными антителами и, следовательно, образуется меньше меченных иммунокомплексов. Далее, после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов, добавляют субстрато-хромагенный реагент и регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Таким образом, величина детектируемого сигнала, получаемого прямым конкурентным ИФА, находится в обратной зависимости от концентрации антигена. Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента. В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антивидовые антитела специфические или вторичные и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген -белок-носитель. Одна из наиболее распространенных схем ИФА. На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген -белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют. После удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых вторичных антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала также, как и при использовании прямого конкурентного метода, находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий. Данный метод применяется для качественного и количественного выявления, например, опиатов морфин, героин , каннабиноидов марихуана, гашиш , амфетаминов и метамфетаминов, барбитуратов. Метод получил название гомогенного ИФА англ. Суть его состоит в связывании низкомолекулярного антигена с ферментом лизоцимом вблизи активного центра. В комплексе с антителами активный центр фермента становится стерически недоступен макромолекулярному субстрату, которым являются стенки бактериальных клеток. При увеличении концентрации определяемого антигена концентрация неактивного комплекса конъюгата с антителами снижается, а следовательно, возрастает регистрируемый параметр ферментативной реакции. На основе данного подхода были разработаны наборы для определения широкого круга токсических, наркотических и лекарственных средств. Как любые иммунохимические методы анализа, ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Например, ложноположительные результаты при определении антител к различным инфекциям могут возникнут за счёт ревматоидного фактора , представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Помимо этого, причиной ложнопололожительных результатов может быть синдром поликлональной активации. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям. Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяют на:. Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог практически любого отдельного антигена. Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы иммуногенными то есть, в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам и высоко специфичными то есть, характерными лишь для данного возбудителя и, по возможности, не дающими перекрёстных реакций с антителами к другим антигенам. Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. На данное время, на основании пептидного имунноферментного анализа, можно сказать, успешно реализован квантифероновый тест для быстрой и высокоточной диагностики туберкулеза. Широкие возможности открывает использование моноклональных антител , специфичных строго к определённому антигенному участку анализируемого соединения. Путём подбора соответствующих антител можно создавать довольно сложные иммунохимические системы, позволяющие идентифицировать соединения самого разнообразного круга. Метода ИФА находится в постоянном развитии. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идёт постоянный поиск всё новых и новых ферментов, используемых в качестве маркеров. Всё возрастающее влияние на ИФА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИФА. Материал из Википедии — свободной энциклопедии. Теория и практика иммуноферментного анализа. Издательство 'Высшая школа', ООО 'Издательство 'Триада'', Для улучшения этой статьи желательно: Найти и оформить в виде сносок ссылки на независимые авторитетные источники , подтверждающие написанное. Исправить статью согласно стилистическим правилам Википедии. Серологические методы Методы биологических исследований. Страницы, использующие волшебные ссылки ISBN Википедия: Статьи без ссылок на источники Википедия: Статьи без источников тип: Статьи к викификации Википедия: Навигация Персональные инструменты Вы не представились системе Обсуждение Вклад Создать учётную запись Войти. Пространства имён Статья Обсуждение. Просмотры Читать Править Править вики-текст История. Эта страница последний раз была отредактирована 16 июля в Текст доступен по лицензии Creative Commons Attribution-ShareAlike ; в отдельных случаях могут действовать дополнительные условия. Свяжитесь с нами Политика конфиденциальности Описание Википедии Отказ от ответственности Разработчики Соглашение о cookie Мобильная версия.