Существует требование сделать Доклинические испытания для класса Роман «сирота» препаратов, называемых фармакологических сопровождающих, воспроизводимость, быстро и эффективно. Мы разработали на основе культуры пробирного высоко стандартизированных, простой и универсальный мобильный экран для право пациентов, а также сопровождающий Роман фармакологических препаратов. Использование персонализированной медицины для лечения редких моногенных заболеваний как лизосомальных хранения расстройства ЗПУ оспаривается сложных клинических судебного конструкции, высокой стоимости и незначительного числа пациентов. В большинстве СУРЛ вовлечены сотни мутантных аллелей. Заболеваний, обычно подразделяются на клинических типов зависимости от тяжести. Кроме того молекулярная характеристика генотипа может помочь предсказать клинических исходов и информировать пациентов. Поэтому мы разработали assay простой клетки культуры, основанные на HEKH клетки, участием чрезмерно выражая мутации, выявленных в Фабри и Pompe болезни. Аналогичный анализ недавно была введена как Доклинические испытания для выявления поддаются мутации для фармакологической Chaperone терапии РСТ в болезнь Фабри. Эта рукопись описывает assay культуры измененные клетки, которая позволяет быстрое фенотипические оценки аллельных вариантов в Фабри и Pompe болезни определить право пациентов на РСТ и может помочь в разработке новых pharmacochaperones. Есть более чем десятка лизосомальных хранения расстройств ЗПУ , связанных с гликозидазы дисфункции в результате первичного генных мутаций. По-прежнему определяются многочисленные новые варианты гена, многие из которых имеют неизвестное значение. Это приводит к ER удержания и преждевременной ухудшение иначе функционального энзима. Аналогичные выводы были сделаны в других ЗПУ, включая Pompe болезни 5. Кроме того молекулярная характеристика фермента вариантов может способствовать клинической интерпретации мутаций в момент диагностики 6 , предполагая, что ЛСД прогрессии является индивидуальный процесс, основанный на характер, мутации. Таким образом обычные классификации в различных клинических типов обычно должны быть пересмотрены с целью упорядочения клинических консультирования и лечения. Фермент заместительной терапии ERT доступен для обоих заболеваний. Кроме того ERT можно выявить иммуногенность ответ, которая ставит под угрозу его терапевтический эффект. Фармакологических сопровождающим шт являются альтернативой привлекательным лечения для пациентов с так называемой гибкой мутации. ПК в качестве молекулярных леску для сворачивания белка правильной и стабилизации, который в свою очередь предотвращает сохранение эндоплазменный ретикулум ER и ER-связанные деградации фермента. Кроме того компьютеры могут быть введены перорально и потенциально могут пересекать гематоэнцефалический барьер. Таким образом РСТ может быть более жизнеспособным вариантом для лечения больных с определенным генотипов. Обнаружение сотен болезнетворных мутантные аллели проблемы наркотиков Доклинические испытания и требует простой, быстрый и высоко стандартизованной оценки поддаются пациентов для персонализированной медицины подход. Чтобы оценить пагубное влияние мутаций гена ЛСД и тестирования кандидата мутации предсказать поддаются пациентов для РСТ, был высоко стандартизированных гиперэкспрессия системы в HEKH клетках, которая позволяет для измерения активности фермента быстрый и надежный разработано. Очень подобный метод запатентован даже как «Метод для прогнозирования реакции на фармакологические Chaperone лечение заболеваний» 17 , указывающее значение ячейки культуры системы, способной интегрироваться в клиническую практику. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Примечание: Клонирования стратегии гла и ГАА кодирования последовательностей cds были сообщалось ранее 15 , Процедура мутагенеза Чтобы оценить эффективность GLA генов мутагенезом, мутации были классифицированы в одну из следующих категорий. Категория 1: Мутагенезом PCR было эффективным с первой попытки. Категория 3: Больше усилий пришлось провести приносить желаемых клон например , обычно один или несколько новых наборов праймеров были разработаны. Оба выражения являются полезными, поскольку оборот всего субстрата иллюстрирует эффективность реакции и чувствительность системы, в то время как нормализованные значения могут дать важные подсказки для вероятность злокачественного мутации с одной стороны и эффективность лечения PC с другой стороны. Для экспериментального этапа был создан рабочий поток изображен на рисунке 1 , который планируется 60 h инкубационный период с соединения по техническим причинам, например быстрый рост HEKH клеток условиях введен. Даже несмотря на то, что она заявила что 10 мкм приблизительная максимальная достижимых плазменную концентрацию для DGJ 14 , 20 мкм использует текущий протокол как разумные концентрации для целей отбора для быстродействия, поддержанное многочисленные ранее работает 4 , - 20 , - 21 , - 22 , - Кроме того был постулируется, что выше уровня в плазме может быть достигнуто Рисунок 1 : Рабочий поток в пробирке измерения активности фермента. A Хронология эксперимент показывает усилия культуры клеток 90 h с относительно мало hands-on-время, необходимое в назначенное время точках. B представитель плазмида векторов pcDNA3. GLA и ГАА дикого типа плазмид и плазмиды, включая соответствующие вставленной мутации интерес были использованы для временно transfect клетки HEKH покрытием в 24 хорошо формате. После периода разрешить клетки синтезировать продукции соответствующих генов и позволить для обработки фермента, лизосомальных транспорта и PC действий клетки были лизированы и измеряется в reader пластины флуоресценции и проанализированы с использованием соответствующего программного обеспечения. C: морфология и роста статуса клеток HEKH клеток показываются эксперимента на протяжении времени. Для эндогенной ферментативной активности клеток HEKH была исправлена абсолютный фермента данных о деятельности. Чтобы оценить эндогенной ферментативной активности, клетки были transfected с pcDNA3. Соотношения T-тесты были использованы для расчета разницы между необработанных и обработанных PC фермента. Протокол, описанные здесь, обеспечивает надежные результаты оценки ущерба фермента в наследственных лизосомных заболеваний обмена веществ. Эта рукопись является поправка к протоколу публикации ранее Наиболее важных изменений включают жесткости то есть , в процессе подготовки мутант векторная конструкция , стандартизация протокол культуры клетки то есть , HEKH клетки обслуживания и transfection условия и высокая количество экспериментальных повторений по крайней мере 5 , которые весьма способствовали воспроизводимость результатов. В целом оба целевых генов были легко доступны для мутагенеза и разносторонность мутации могут быть собраны в параллельном режиме. Таким образом существует отличное разрешение между дикого типа и мутантов фермента. Как указывалось выше, пробирного параметры часто являются спорным, поскольку многие лаборатории разработали свои собственные анализы расследовать лизосомальных основу. Системы могут отличаться в тип клеток, дизайн вектор плазмиды, условия культивирования и периода воздействия наркотиков, только, чтобы назвать несколько из многочисленных параметров. Недавно опубликованные мета анализ для болезнь Фабри продемонстрировал, что записи активности фермента с и без ПК transfected клеток моделей например , HEK, COS-7 во многом в соответствии с результаты, полученные из клеток пациента производные преимущественно лимфоцитов или фибробластов в отношении вопроса, ли мутация реагировать PC Предыдущие доклады непосредственно сравнивать клетки пациента производные и трансфекции модели продемонстрировали, гиперэкспрессия системы отражают ситуацию в клетках больного без ущерба для заключения 13 , Можно таким образом сделать вывод, что, независимо от конкретного протокола, результаты, полученные разными авторами, не было изменено путем различных клеточных систем, несмотря на то, что ответчик определения могут быть разные. Достаточны ли эти критерии для прогнозирования клинические преимущества DGJ и DNJ остается неясной, так как уровень активности, необходимые для предотвращения симптомом заболевания является спорным. Monotherapeutical подход с DNJ было прекращено во время фазы II клинических испытаний из-за тяжелых побочных реакций в некоторых пациентов Однако лечение ПК в сочетании с утвержденными ERT показали значительно улучшить результаты в отношении болезни субстрата гликоген сокращения по сравнению с ERT монотерапия Следует позаботиться о том, чтобы выбрать подходящую ячейку метод срыв подготовить lysate клетки для определения активности фермента, потому что добавление моющих средств в литического буфера может быть показателем мембраны прыгните ферментов, таких как глюкоцереброзидазы в Болезнь Гоше в то время как аналогичные количество моющего средства может повредить другие ферменты. Авторы хотели бы признать Мэнди Loebert и Тина Чайка за отличную техническую поддержку. Lukas, J. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Medicine. Подготовка мутант pcDNA3. Есть набор соль бесплатно грунтовки высокой чистоты РВК синтезируется коммерческого поставщика услуг, с смысл и antisense грунты, перевозящих один из соответствующих последовательности изменения центральной их длины индивидуально ввести мутации. Используйте средство дизайн бесплатно грунтовка для поддержки грунтовка дизайн Для реакционной смеси используйте стандартные условия для решения реакции и условия PCR, предоставляемых производителем. Наконец добавьте 2. Как отрицательный контроль увлечь образец без грунт. Преобразование и скрининга для желаемого клон Трансформировать Алиготе ultracompetent клеток в соответствии с рекомендациями производителя. Затем выбрать 3 колоний и подготовить 3 мл ночи культур в среде LB отвара. Используйте подходящие молекулярной биологии инструмент для анализа последовательности. Определите чистоту ДНК путем измерения поглощения в спектрофотометре. Разделение клетки в свежих средних и семян новых T75 колбу для поддержания постоянного культуры. Не использовать ячейки с более чем 25 проходы. Осуществлять протокол transfection согласно инструкции производителя. Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре и добавить в ячейки в drop-wise манере впоследствии. Промойте клетки от плиты и передавать их на 1,5 мл реакции. Гомогенизация, замораживания и оттаивания Поместите образцы в соответствующей пены стойку и вихревые для 5 s, чтобы сделать более эффективным lysis. Поместите образцы, чередуя в жидком азоте для 10 s и в ванну воды комнатной температуры до оттаивания был полный 5 мин. Повторите эту процедуру 5 раз и затем спина образцы для 5 мин на x g. Сохраняют супернатант и пипетки в новой трубки реакции. С помощью bicinchoninic кислоты BCA анализа определения концентрации белка Подготовьте свежие трубки для каждого образца, содержащий 40 мкл дейонизированной H 2 O и 10 мкл пример. Mix решение vortexing кратко и передачи 10 мкл в полость 96 хорошо плиты каждый образец в трех экземплярах. Измерение оптической плотности на Нм в тарелку читателя. Примечание: Образцы обычно содержат от 1 до 1,5 мкг белка на мкл. Вихревой образцы для 5 s снова и пипетки 10 мкл этой разрежения в 96 хорошо пластины каждый образец в двух экземплярах. Прекратить реакцию путем добавления мкл 1,0 м, рН Мера активности ферментов в флуоресценции читателя с соответствующим фильтром установить и анализировать данные с помощью соответствующего программного обеспечения для устройства чтения флуоресценции. Выпущенное 4-му является флюрохром, которая может быть измерена на и Нм как волны возбуждения и выбросов, соответственно, с помощью Считыватель микропланшетов флуоресценции. AT AV RQ YF 41,1 5. PL 65,7 6. LP 0. Play Video. Cite this Article Lukas, J. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close.

Метамфетамин бесплатные пробы Ганновер

Купить Шишки Тиват Черногория закладкой

Метамфетамин бесплатные пробы Ганновер

Mdma купить наркотик Москва ЦАО

Вы точно человек?

Метамфетамин бесплатные пробы Ганновер

Кантхо купить мефедрон мяу 4mmc

Метамфетамин бесплатные пробы Ганновер

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

Вы точно человек?

Вы точно человек?

Вы точно человек?

Вы точно человек?

Report Page