Мефедрон Виго
Мефедрон ВигоМефедрон Виго
• • • • • • • • • • • • • • • • •
Мефедрон Виго
• • • • • • • • • • • • • • • • •
Гарантии ❗ Качество ❗ Отзывы покупателей ❗
• • • • • • • • • • • • • • • • •
👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇
Наши контакты:
▶️▶️▶️ (НАПИСАТЬ ОПЕРАТОРУ В ТЕЛЕГРАМ)️ ◀️◀️◀️
👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆
• • • • • • • • • • • • • • • • •
🚩 ИСПОЛЬЗУЙТЕ ВПН (VPN), ЕСЛИ ССЫЛКА НЕ ОТКРЫВАЕТСЯ!
🚩 В Телеграм переходить только по ссылке что выше! В поиске тг фейки!
• • • • • • • • • • • • • • • • •
Scientific Article | Здесь мы представляем протокол для анализа в пробирке нуля с использованием первичных фибробластов и для in vivo кожи.
Мефедрон Виго
Здесь мы представляем протокол для анализа в пробирке нуля с использованием первичных фибробластов и для in vivo кожи раны заживления анализа у мышей. Оба анализа являются простыми методами для оценки in vitro и in vivo заживления ран. Нарушение кожного заживления ран является серьезной проблемой для пациентов, страдающих диабетом и для пожилых людей, и есть необходимость в эффективном лечении. Соответствующие подходы in vitro и in vivo необходимы для идентификации новых молекул-мишеней для лечения лекарственными препаратами для улучшения процесса заживления ран. Мы определили субъединицу кальциевых каналов с напряжением,загнанные в напряжение Каве3 в качестве потенциальной целевой молекулы, способной влиять на заживление ран в двух независимых анализах, то есть в анализе миграции в пробирке и модели камеры in vivo dorsal skinfold. Царапина была применена на монослой соединительных клеток, и за закрытием разрыва последовало получение микроскопических изображений в определенных временных точках до полного перераспределения разрыва мигрирующими клетками. Эти изображения были проанализированы, и скорость миграции клеток была определена для каждого состояния. Закрытие ран было значительно быстрее у мышей Cacnb3-генно-дефицитных. Потому что результаты in vivo и in vitro assays коррелируют хорошо, анализ in vitro может быть полезен для скрининга высокой пропускной способностью перед проверкой in vitro хитов по модели заживления ран In vivo. Заживление ран ы кожи начинается сразу после повреждения кожи, чтобы восстановить целостность кожи и защитить организм от инфекций. Процесс заживления ран проходит через четыре перекрывающиеся фазы; коагуляция, воспаление, формирование новых тканей и ремоделирование тканей 1. Миграция ячеек имеет решающее значение на этих этапах. Воспалительные клетки, иммунные клетки, кератиноциты, эндотелиальные клетки и фибробласты активируются в разное время и вторгаются в рану области 2. Методы исследования заживления ран in vitro и in vivo представляют большой интерес не только для понимания основных механизмов, но и для тестирования новых препаратов и разработки новых стратегий, направленных на улучшение и ускорение заживления ран ы. Для мониторинга и анализа миграции клеток можно использовать анализ миграции царапин. Это часто называют in vitro раны заживления анализа. Этот метод требует объекта культуры клеток 3. Это простая процедура, нет необходимости в высококачественном оборудовании и анализ может быть выполнен в большинстве лабораторий клеточной биологии. В этом ассоциировании область, свободная от клеток, создается механическим нарушением монослойной клеток, предпочтительно эпителиальных или эндотелиальных клеток или фибробластов. Клетки на краю нуля будут мигрировать для того, чтобы заселить созданный пробел. Количественная оценка уменьшающейся области, свободной от клеток, со временем напоминает скорость миграции и указывает время, которое ячейки должны закрыть разрыв. Для этой цели, исследователи могут использовать либо остро изолированных клеток из WT мышей или мышей, не имеющих гена интереса 4 , или увековеченные клетки, доступные из надежных хранилищ клеток. Анализ царапин позволяет изучать влияние фармакологически активных соединений или влияние трансинфицированных cDNA или siRNAs на миграцию клеток. In vivo, заживление ран является сложным физиологическим процессом, требующим различных типов клеток, включая кератиноциты, воспалительные клетки, фибробласты, иммунные клетки и эндотелиальные клетки для того, чтобы восстановить физическую целостность кожи как можно быстрее 1. Различные методы для изучения in vivo заживление ран были разработаны и используются в прошлом 5 , 6, 7 , 8. Дорсальная камера скожа, описанная в этой статье, ранее использовалась для анализов заживления ран 9. Он используется в качестве модифицированного складной шкуры подготовки к коже для мышей. Модифицированная модель камеры для стежков имеет ряд преимуществ. Удаление гена Cacnb3 у мышей приводит к повышенной чувствительности IP3R для IP3, усиленной миграции клеток и увеличению ремонта раны кожи 4. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Все экспериментальные процедуры были утверждены и проведены в соответствии с правилами этики и комитетами по защите животных Саарландского и Саарского университетов. Эти клетки играют решающую роль в заживлении ран и ремоделирования тканей После выполнения 'царапины' с помощью наконечника пипетки л, клетки из обоих генотипов мигрируют в область нуля и закрывают зазор. Изображения были сделаны после 6, 10 и 30 ч рисунок 1 a. Для подтверждения эффекта, зависимого от Каве3, наблюдаемого в фибробластах, фибробласты дикого типа были трансинфицированы сиРНК для снижения регулирования белка Кав-3 рисунок 1 e. В качестве контроля за даун-регуляцией были проведены иммуноблоты для подтверждения эффективности лечения siRNA. In vivo была имплантирована спинная кожная камера рисунок 2 a,b , а на бритовой спине рисунок 2 б диких мышей типа и Каве3-дефицитных мышей 8 животных на генотип, недель и г веса. Рана была выполнена путем удаления полной кожи с эпидермисом и дермой. Для сравнения заживления раны кожи между обоими генотипами, область раны в камере складки кожи была сфотографирована сразу после ранения день 0 , а затем были сделаны фотографии 3, 6, 10 и 14 дней после ранения рисунок 2 c. Замыкание ран увеличивается у мышей с дефицитом 3-х по сравнению с элементами управления дикого типа. В отличие от дикого типа, рана у мышей с дефицитом 3 была почти полностью закрыта уже через 10 дней. На следующий день 14 после ранения, раны были полностью закрыты в обоих генотипов рисунок 2 c,d. Рисунок 1 : In vitro нуля миграции анализ. Изображения были преобразованы в 8-битную серую шкалу, а контрастность, а также яркость, были адаптированы для максимальной визуализации области, свободной от ячейки. Белок No3 55 кДа присутствует в мозге дикого типа используется в качестве контроля и фибробластах, но отсутствует в белковых экстрактах мозга и фибробластов, приготовленных из мышей Кав Данные отображаются как средние значения SEM, значения p были рассчитаны с помощью непарного двуххвостого теста Студента. Панели a и b были изменены из «Belkacemi et al. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2 : In vivo кожа раны заживления у мышей. Титанкадр внутренней стороны вид показывает одну половину титановой камеры и вид передней стороны показаны собраны титановой камеры с двумя симметричными половинками прилагается с винтами и гайками. Панели c и d были изменены из «Belkacemi et al. В этой рукописи мы описываем in vitro и in vivo анализ заживления ран и соотносим полученные результаты. Для анализа in vitro мы использовали первичные фибробласты мыши 4, 14, 15, которые играют важную роль в заживлении ран и ремоделирования тканей Другие типы клеток адептов, растущие как монослои например, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты также могут быть использованы. Покрытие такого же количества жизнеспособных и здоровых клеток и применение нуля при той же степени сближания имеет первостепенное значение для получения точных и воспроизводимых результатов. Настоятельно рекомендуется выполнять биологические и технические репликации. В настоящем методе использовались 6-колодные пластины, но или нужные пластины могут также использоваться, особенно когда клетки доступны только в ограниченном количестве. В случае лечения siRNA, иммуноблотный анализ после каждого набора экспериментов является обязательным, чтобы убедиться, что целевой белок эффективно регулируется. Реагент трансфекции и временное окно должны быть проверены и выбраны для каждого типа ячейки, прежде чем начать с миграционного асссе. В случае фибробластов и гена Cacnb3, потребовалось от 3 до 4 дней, чтобы достичь желаемого уровня вниз регулирования. В отличие от этого, анализ миграции царапин требует более короткого времени 6 ч до 24 ч. Чтобы избежать высокой изменчивости размера нуля, обязательно, чтобы тот же следователь применяет царапины для каждого набора экспериментов, что равное давление осуществляется пипетка отзыв и держать рану как можно больше вертикальной к отмеченной линии на нижней части пластины через монослой ячейки. Применение механической царапины по всему монослой клетки приводит к высвобождению различных клеточных факторов например, АТФ из поврежденных клеток во внеклеточное пространство. Эти факторы будут вызывать паракриновые сигнализации в том числе Ca 2 'сигнализации в соседних клетках, которые, в свою очередь, будет влиять на клеточные ответы Чтобы избежать этих эффектов, культура вставки могут быть использованы для покрытия клеток и после удаления этих вставок ячейки свободной разрыв создается без повреждения соседних клеток Для высокой пропускной пробы, следователи могли бы рассмотреть вопрос об использовании инструментов, доступных на рынке для создания воспроизводимых и последовательных царапин в колодец пластин. Чтобы непрерывно следить за кинетикой миграции клеток, пользователи могут также рассмотреть возможность использования высококачественных коммерческих систем для автоматического захвата изображения. Однако автоматизированные системы для применения нуля и захвата изображений не всегда доступны из-за высоких затрат. Более доступным и экономичным решением для визуализации замедленного времени было бы, например, с помощью системы ATLIS: доступная система визуализации и инкубации времени , описанная Эрнандесом Верой и коллегами При отсутствии каких-либо ингибиторов пролиферации клеток, репопуляция пробела в анализе миграции царапин представляет собой сочетание миграции клеток и пролиферации клеток. Для мониторинга только миграции клеток, пролиферация клеток может быть подавлена, например, путем лечения либо актиномицин C 19 или митомицин C Адекватные концентрации этих соединений должны быть тщательно определены и протестированы, чтобы избежать токсического воздействия этих соединений, которые могут повлиять на жизнеспособность клеток и их способность мигрировать. Как описано в настоящей статье, голод в сыворотке крови или снижение концентрации сыворотки в культуре среды является еще одним способом уменьшить последствия пролиферации клеток. Сывороточное голодание используется в нескольких других клеточных анализов. Это может вызвать большое количество клеточных реакций, которые могут помешать полученным результатам и интерпретациям Сывороточный голод должен быть тщательно применен и его влияние на жизнеспособность клетки должны быть оценены перед началом эксперимента. Скорость миграции, как и ожидалось, медленнее при низких концентрациях сыворотки. Тем не менее, фибробласты с дефицитом 3 мигрируют быстрее, чем клетки дикого типа в обоих условиях; высокая и высокая концентрация сыворотки. Кожа раны заживления ассссс с помощью царской кожи камеры является относительно простой процедурой для расследования закрытия раны кожи с течением времени in vivo. Имплантация титановой складки кожи была описана впервые у крыс Sorg et al. Модель камеры скожного диска, описанная в этой статье, имеет много преимуществ по сравнению с классическими анализами заживления ран, выполненными на пстевой коже, на ухе 23 или задней конечности 7 мышей. Покрытие раны с помощью стеклянного покрывала предотвращает инфекции и травмы тканей и ограничивает высыхание раны. Murine раны кожи процесс заживления состоит как из сокращения и эпителиизации Использование складной сыщика сыщика камеры у мышей сводит к минимуму сокращение кожи и дает возможность изучать в основном процесс эпителиализации. Он также обеспечивает четкое окно для наблюдения и контроля процесса закрытия раны. Это может вызвать некоторый дискомфорт для мыши, хотя кажется, что мыши хорошо переносят эту камеру, и они удобны и могут легко достичь пищи и воды. Модель заживления ран кожи, представленная в этой статье, может изучать только одну рану на мышь. Другие опубликованные методы 25 , 26 предлагают применять две раны на мышь, которая позволит уменьшить количество животных, необходимых для исследования. Очень важно создать круговую рану аналогичного размера для всех мышей, чтобы получить объективную информацию, а также надежные и воспроизводимые результаты. Чтобы сделать снимки ран с течением времени, мышей фиксировали на ласфолителе мыши, помещали на сцену, а кожная камера расположена под стереомикроскопом. Использование удерживающего помогает избежать анестезии и минимизации стресса для мышей. Мышей можно принести в жертву, а ткани из раненой области можно высаживать и собирать на разных стадиях процесса заживления либо после полного заживления, либо в более ранние моменты времени для гистологического анализа, сбора РНК или биохимии белка. Таким образом, мы показали два метода, в пробирке нуля анализ с использованием первичных фибробластов и in vivo кожи раны заживления анализ у мышей. Мы благодарим д-ра Петру Вайсгербер и подразделение Transgene животного комплекса SPF проект P2 SFB медицинского факультета и животное в Институте клинической и экспериментальной хирургии на медицинском факультете Саарлендского университета в Хомбурге. Мы благодарим доктора Андреаса Бека за критическое чтение рукописи. Belkacemi, A. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Medicine. Это акционерное решение siRNAs. Aliquot этот запас раствор на 10 qL на трубку 20 мКм концентрации и хранить при градусов до использования. Используя ультратонкий перманентный маркер, отметьте 6-ну колодую пластину с горизонтальной линией в нижней части каждой скважины, чтобы иметь возможность всегда определить одну и ту же область царапин, представляющих интерес, и следить за ее закрытием. Если доступно ограниченное число ячеек, то альтернативным и, вероятно, экономичным способом было бы использование или колодцев культуры. Тесты могут быть необходимы, если с помощью или хорошо клеточной культуры пластин или других типов клеток, которые могут быть различными по размеру. Клетки должны обрабатываться в стерильной среде, такой как биологическая безопасность шкафов класса II. Пометьте 6-колодецную пластину клеточного типа, генотипа и даты. На следующий день, возьмите пластину из инкубатора, аспирировать среды клеточной культуры из колодца, отбросить его и заменить его 2,25 мл свежей среде культуры, добавив его тщательно к стене колодца. Для того, чтобы трансфектировать фибробласты с siRNAs, используйте липидный трансфекционный реагент, как это рекомендовано производителем. Для каждого трансфекции, этикетка две микроцентрифуги труб. В первом, добавить 9 л трансфекционного реагента и разбавить его л уменьшенной среде сыворотки. Добавьте разбавленную siRNA в трубку, содержащую разбавленный трансфекционный реагент и вихрь в течение 2 с. Инкубировать смесь в течение 5 мин при 21 градусов по Цельсию. Добавьте в клетки кЛ смеси реагента siRNA-transfection. Для того, чтобы проверить эффективность заглушения гена Cacnb3, собирать трансинфицированные клетки и выполнять иммуноблотный анализ, как описано ранее 4. In vitro раны заживления анализ царапина миграции анализ Возьмите пластины культуры клеток из инкубатора и изучить клетки под микроскопом с помощью 10x цели. Поэтому важно сеять одинаковое количество клеток в культурные колодцы, исследовать каждую скважину на случай стыковки и применять царапину в одно и то же время день 0. Используйте наконечник пипетки л , чтобы вручную создать повертичную царапину к горизонтальной линии, отмеченной в нижней части скважины, поперек монослойа сольственных ячеек в середине скважины. Добавить 2 мл PBS тщательно против стены колодца, чтобы избежать отсоединения клеток от клеточной культуры хорошо. Чтобы отобразить всегда одну и ту же область нуля, используйте горизонтальную линию, которая была подготовлена в шаге 1. После 6, 10 и 30 ч, переместить пластину на стадии микроскопа снова и захватить изображения так же, как описано в шаге 2. В ходе первого экспериментального эксперимента было проверено больше временных точек, чтобы увидеть, как быстро фибробласты заселяют этот пробел. Хотя 0, 6, 10 и 30 ч являются разумными точками начала, исследователи должны оптимизировать и установить соответствующие временные точки для каждого приложения и для каждого типа ячейки. Более точной альтернативой, если она имеется, было бы использование замедленной микроскопии. Процент области царапин, заселенной мигрирующими ячейками, затем рассчитывается по отношению к исходной области нуля. Анализ области царапин Открытое программное обеспечение ImageJ Выберите кнопку freehand и пометьте область без ячейки Нажмите на анализ и выберите меру. Появится окно с результатами, содержащее значение области. Перенесите это значение в таблицу анализа. Повторите шаги 3. Рассчитайте процент области нуля, заселенной мигрирующими ячейками после 6, 10 и 30 ч для каждой царапины, используя следующее уравнение: a - свободная область ячейки первоначальной царапины, b и свободная область ячейки после 6 ч Рассчитайте среднее и стандартную ошибку среднего S. Отображение данных в виде графика столбца или участка рассеяния. За день до начала эксперимента, автоклавировать все хирургические инструменты, винты, гайки и титановые рамы, которые будут использоваться для подготовки скин-фолк камеры. Анестезия дикого типа или 3-дефицитной мыши г массы тела путем интраперитонеальной т. Проверьте глубину анестезии на отсутствие реакции на щепотку ног. Чтобы избежать сухости или повреждения глаз, нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза и при необходимости повторите применение. Тщательно побрить на курьесную цуп, используя электрическую бритву с последующим применением крема для депиляции в бритую область, чтобы удалить оставшиеся волосы. Позаботьтесь, чтобы не травмировать кожу мыши. Оставьте крем для депиляции около 10 минут, чтобы полностью удалить все волосы. Подготовьте титановую камеру, взяв одну часть симметричной титановой камеры и зафиксируя соединительные винты с гайками с одной стороны. Эти орехи будут служить в качестве прокладки держать мкм между двумя симметричными частями камеры, чтобы избежать сжатия кровеносных сосудов в коже. Снимите крем с задней части мыши и очистите область без волос теплой градусов по Цельсию водопроводной водой. Убедитесь, что место для проведения операции чистое, теплое 37 градусов по Цельсию и увлажнено. Дезинфекция без волос области мыши с дезинфицирующей кожи. Возьмите складку задней кожи мыши перед источником света и положение средней линии двойного слоя кожи, где титановая камера будет имплантирована. После этого, исправить скин с полипропиленовым швом черепно и caudally и затяните другую сторону шва на металлической стойке, чтобы поднять мышь сложенной кожи. Отрегулируйте высоту стойки, чтобы мышь удобно сидела. Имплантировать титановую камеру в складку задней кожи мыши таким образом, чтобы сэндвич сложенный слой спинной кожи между двумя симметричными половинками титановой рамы. Прикрепите первую половину титановой рамы полипропиленовыми швами на ее верхнем краю к задней части спинной кожи. Перед переходом к следующему шагу, проверьте рефлексы мыши, чтобы убедиться, что глубина анестезии сохраняется. У основания скин-складки пройдите два соединительных винта, прикрепленных к первой половине титановой камеры, чтобы проникнуть в скин-фолд со спины к передней стороне. Сделайте небольшие разрезы на коже с помощью тонких ножниц , чтобы помочь плавному проникновению соединительных винтов. Отсоедините мышь от стойки и поместите ее на боковое положение. Положите вторую дополнительную половину титановой камеры поверх 3 соединительных винтов см. Рисунок 2 а и нанесите небольшое давление пальцами, чтобы пройти эти винты через вторую половину титановой рамы. Затем, исправить обе симметричные части с орехами из нержавеющей стали. Обратите пристальное внимание на герметичность винтов на этом этапе, так как он может отделить, если он слишком свободен. В отличие от этого, если он слишком туго, он будет сжимать кожу, уменьшить приток крови и может привести к ухудшению тканей и некроза. Орехи следует затянуть до тех пор, пока не будет ощущаться небольшое сопротивление. Вырежьте оставшуюся часть винтов с помощью плоскогубцев. Отметьте область раны стандартизированным бивней биопсии 2 мм в диаметре , в центре кожи в окне наблюдения см. Рисунок 2 a камеры скобами для того, чтобы обеспечить воспроизводимые размеры ран. Используя тонкие щипцы и ножницы, создайте круговую рану в отмеченной области, удалив полную кожу с эпидермисом и дермой. Окончательная площадь раны составит около 3,,5 мм 2, см. Рисунок 2 b. Обложка раны со стеклянным крышкой и исправить это стекло coverslip с оснастки кольцо с помощью плоскогубца оснастки кольцо на титановой камере. Сразу после окончания хирургической процедуры поместите мышь на этап визуализации стереомикроскопа, оснащенного камерой, и снимайте снимки день 0 под освещением. Используйте увеличение 40X и сохраните изображения для будущего автономного анализа. Подготовка камеры для стежков и производительность раны кожи занимает около 30 минут. Держите мышь в теплом месте во время восстановления после анестезии, по крайней мере 2 ч. Три дня после ранения место мыши в мышь-ограничитель и исправить удерживающий на верхней части стадии изображения. Поместите сцену под стереомикроскоп, оснащенный камерой. Возьмите изображения под освещением с кратным увеличением, запишите все фотографии и сохраните их для будущих автономных анализов Повторите шаги 4. Используйте изображения ран, для автономного анализа в ImageJ Результаты представительи показаны на рисунке 2 c,d. Play Video. Cite this Article Belkacemi, A. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close.
Описаны особенности влияния на судорожную активность таких веществ, как MDMA (экстази), трамадол, каннабис (марихуана), морфин, героин, оксикодон.
Диквелла Шри-Ланка купить закладку Альфа-ПВП
Мефедрон Виго
Мефедрон Виго
Купить Альфа-ПВП Оса закладкой
Статья автора «AlkoNarkoNet» в Дзене ✍: Среди людей, употребляющих МДМА, наиболее популярен его вариант в виде маленьких разноцветных.
Купить закладку гашиш HASH Реймс
Мефедрон Виго
Алекса́ндр Теодор Шульги́н (англ. Alexander Theodore Shulgin), также известный как Саша Шульгин (Sasha Shulgin; 17 июня , Беркли, Калифорния — 2 июня
Мефедрон Виго
Мефедрон Виго
Мильштаттерзее купить Марки LSD
Мефедрон Виго