Меф Ск бесплатные пробы Базель
Меф Ск бесплатные пробы БазельМеф Ск бесплатные пробы Базель
• • • • • • • • • • • • • • • • •
Меф Ск бесплатные пробы Базель
• • • • • • • • • • • • • • • • •
Гарантии ❗ Качество ❗ Отзывы покупателей ❗
• • • • • • • • • • • • • • • • •
👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇
Наши контакты:
▶️▶️▶️ (НАПИСАТЬ ОПЕРАТОРУ В ТЕЛЕГРАМ)️ ◀️◀️◀️
👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆
• • • • • • • • • • • • • • • • •
🚩 ИСПОЛЬЗУЙТЕ ВПН (VPN), ЕСЛИ ССЫЛКА НЕ ОТКРЫВАЕТСЯ!
🚩 В Телеграм переходить только по ссылке что выше! В поиске тг фейки!
• • • • • • • • • • • • • • • • •
Меф Ск бесплатные пробы Базель
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version. We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions. Человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток hiPSCs могут быть получены лентивирусными на основе перепрограммирования методологий. Тем не менее, следы потенциально онкогенных генов, оставшихся в активно транскрибируются областей генома, ограничить их потенциал для использования в терапевтических применений человека 1. Кроме того, нечеловеческие антигены, полученные из стволовых клеток перепрограммирования или дифференциации в терапевтически соответствующих производных исключает эти hiPSCs от использования в человеческом клиническом контексте 2. В этом видео мы представляем процедуру перепрограммирования и анализа факторов без hiPSCs бесплатно экзогенных трансгенов. Эти hiPSCs затем могут быть проанализированы на экспрессии генов отклонений в конкретной интрона, содержащего лентивирусов. Этот анализ может быть проведен с использованием чувствительной количественной полимеразной цепной реакции ПЦР , который имеет преимущество по сравнению с менее чувствительными методами, ранее использованный для определения различий экспрессии генов 3. Полная конверсия вклинико-класс надлежащей производственной практики GMP условия, позволяет клиническое значение человека. Наш протокол предлагает другой методологии, при условии, что текущие критерии безопасной гавани будет расширяться и включать в себя охарактеризованные hiPSC на основе производных Фактор-бесплатно терапевтических применений-для получения GMP-класса hiPSCs, которые должны устранить любую иммуногенности риск из-за нечеловеческих антигенов человека. Этот протокол широко применима к лентивирусов перепрограммировать клетки любого типа и обеспечивает воспроизводимый метод для преобразования перепрограммировать клетки в условиях GMP-класса. Adult human cells have been shown to be capable of undergoing epigenetic remodeling and reprogramming, as a result of lentiviral-based expression of four key transcription factors 4,5. An important advancement in the reprogramming field was the use of a single excisable lentiviral stem cell cassette STEMCCA , which housed all four reprogramming transcription factors that allowed a precise stoichiometric ratio of protein expression 6. Additionally, when transduced in specific multiplicity of infection ranges, STEMCCA can lead to predominantly single genomic integration events during the reprogramming process 7. The introduction of an exci Log in or Start trial to access full content. Примечание: Этот метод был использован в исследованиях сообщается в страхе и др Мы описываем методологию получения фактора без hiPSCs и сделать их клиническое значение путем преобразования этих клеток в условиях GMP-класса для последующего дифференцировки клеток в будущих терапии человека. Хотя этот протокол является широко применимы к различным типам клеток, мы вы? We would like to thank Patrick C. Lowry, Jerome A. Zack, and Donald B. This work is based on a research collaboration with Fibrocell Science All rights reserved. Faculty Resource Center. High Schools. Sign In. JoVE Journal Biology. Automatic Translation. Biology Вывод и характеристика Transgene-свободный человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток линии и превращение в определенных условиях Клинико-класса Published: November 26th, DOI: Jason P. Byrne 1,2. Summary We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions. Abstract Человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток hiPSCs могут быть получены лентивирусными на основе перепрограммирования методологий. Introduction Adult human cells have been shown to be capable of undergoing epigenetic remodeling and reprogramming, as a result of lentiviral-based expression of four key transcription factors 4,5. Protocol Примечание: Этот метод был использован в исследованиях сообщается в страхе и др Discussion Мы описываем методологию получения фактора без hiPSCs и сделать их клиническое значение путем преобразования этих клеток в условиях GMP-класса для последующего дифференцировки клеток в будущих терапии человека. Acknowledgements We would like to thank Patrick C. Download materials list. References Sommer, C. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. Lu, H. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Karumbayaram, S. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Sommer, C. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Somers, A. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Papapetrou, E. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. Awe, J. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. Geron Corporation Press Release. Jozefczuk, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. Mitani, K. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. Patterson, M. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. Schroder, A. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Hockemeyer, D. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. This article has been published Video Coming Soon Keep me updated:. Contact Us. Recommend to library.
Южный атолл Мале Мальдивы купить Трамадол закладки
“Ser mujer en un mundo de hombres…?”
Меф Ск бесплатные пробы Базель
Орша купить Скорость ск закладки
Меф Ск бесплатные пробы Базель
Марки LSD купить наркотик Вышний Волочёк
To prove you're not a robot, please enter the text in the image below
Меф Ск бесплатные пробы Базель
Купить Кокаин Ахангама Шри-Ланка закладкой
N1 CITY CURRENT 2
В этом анализе используются эмбриональные стволовые клетки мыши, дифференцированные в эмбриоидные тела, культивируемые в геле 3D-коллагена, для анализа биологических процессов, которые контролируют прорастающий ангиогенез in vitro. Методика может быть применена для тестирования лекарств, моделирования заболеваний, а также для изучения конкретных генов в контексте делеций, которые являются эмбрионально летальными. Последние достижения в области индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ИПСК и технологий редактирования генов позволяют разрабатывать новые модели заболеваний на основе клеток человека для программ открытия фенотипических лекарств PDD. Хотя эти новые устройства могут более точно предсказывать безопасность и эффективность исследуемых препаратов на людях, их разработка в клинике по-прежнему в значительной степени зависит от данных о млекопитающих, в частности, от использования моделей болезней мышей. Таким образом, параллельно с моделями заболеваний органоидов человека или «орган-на-чипе» разработка соответствующих моделей мышей in vitro является неудовлетворенной потребностью для оценки прямых сравнений эффективности и безопасности лекарств между видами и в условиях in vivo и in vitro. Здесь описан анализ прорастания сосудов, в котором используются эмбриональные стволовые клетки мыши, дифференцированные в эмбриоидные тела БЭ. Васкуляризированные БЭ, культивируемые на 3D-коллагеновом геле, развивают новые кровеносные сосуды, которые расширяются, процесс, называемый прорастающим ангиогенезом. Эта модель резюмирует ключевые особенности прорастающего ангиогенеза in vivo - образования кровеносных сосудов из ранее существовавшей сосудистой сети, включая отбор клеток кончика эндотелия, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, управление клетками, формирование трубок и рекрутирование клеток фремиссии. Он поддается скринингу на лекарства и гены, модулирующие ангиогенез, и показывает сходство с недавно описанными трехмерными 3D сосудистыми анализами, основанными на технологиях iPSC человека. За последние три десятилетия открытие лекарств на основе мишеней TDD широко использовалось фармацевтической промышленностью при открытии лекарств. TDD включает в себя определенную молекулярную мишень, играющую важную роль в заболевании, и опирается на разработку относительно простых систем клеточных культур и считывания для скрининга лекарств 1. Наиболее типичные модели заболеваний, используемые в программах TDD, включают традиционные методы культивирования клеток, такие как раковые клетки или иммортализированные клеточные линии, выращенные в искусственных средах и нефизиологических субстратах. Несмотря на то, что многие из этих моделей предоставили жизнеспособные инструменты для выявления успешных кандидатов на лекарства, использование таких систем может быть сомнительным из-за их низкой актуальности для болезней 2. Для большинства заболеваний основные механизмы действительно сложны, и часто обнаруживается, что различные типы клеток, независимые сигнальные пути и несколько наборов генов способствуют определенному фенотипу заболевания. Это также верно для наследственных заболеваний, где основной причиной является мутация в одном гене. С недавним появлением технологий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека iPSC и инструментов редактирования генов теперь можно создавать 3D-органоиды и модели заболеваний органов на чипе, которые могли бы лучше повторять сложность человека in vivo 3,4. Развитие таких технологий связано с возрождением интереса к программам открытия фенотипических лекарств PDD 1. PDD можно сравнить с эмпирическим скринингом, поскольку они не опираются на знание идентичности конкретной лекарственной мишени или гипотезу о ее роли в заболевании. В настоящее время все шире признается, что подход PDD вносит значительный вклад в открытие первых в своем классе лекарств 5. Поскольку развитие технологий органоидов человека и «органов-на-чипе» все еще находится в зачаточном состоянии, ожидается, что модели iPSC дополненные инновационными инструментами визуализации и машинного обучения 6,7 предоставят в ближайшем будущем несколько новых сложных моделей клеточных заболеваний для скрининга лекарств и связанных с ними программ PDD для преодоления низкой производительности подхода TDD 8 , 9. В то время как модели органоидов человека и «орган-на-чипе» могут дать важную информацию о сложности заболевания и идентификации новых лекарств, внедрение лекарств в новую клиническую практику также в значительной степени зависит от данных животных моделей для оценки их эффективности и безопасности. Среди них генетически модифицированные мыши, безусловно, являются наиболее предпочтительными моделями млекопитающих. У них есть много преимуществ, поскольку они имеют относительно короткое время генерации для млекопитающих, имеют много схожих фенотипов с болезнями человека и могут быть легко генетически манипулированы. Поэтому они широко используются в программах по открытию лекарств Тем не менее, преодоление разрыва между мышами и людьми остается важной задачей Разработка моделей мышей in vitro, эквивалентных человеческим органоидам и моделям «орган-на-чипе», может, по крайней мере, частично восполнить этот пробел, поскольку это позволит проводить прямые сравнения эффективности и безопасности лекарств между данными о мышах in vivo и людях in vitro. Здесь описан анализ прорастания сосудов в эмбриоидных телах мышей БЭ. Кровеносные сосуды состоят из эндотелиальных клеток внутренняя оболочка стенок сосудов , клеток стенки клетки гладких мышц сосудов и перициты Этот протокол основан на дифференцировке мышиных эмбриональных стволовых клеток мЭСК в васкуляризированные БЭ с использованием висячих капель, которые повторяют de novo эндотелиальные клетки и дифференцировку клеток фрески 13, ЭСК мышей могут быть легко установлены в культуре из изолированных бластоцист мыши на 3,5-й день, имеющих различный генетический фон Они также предоставляют возможности для клонального анализа, отслеживания происхождения и могут быть легко генетически обработаны для создания моделей заболеваний 13, Поскольку кровеносные сосуды питают все органы, неудивительно, что многие заболевания, если не все, связаны с изменениями в микроциркуляторном русле. При патологических состояниях эндотелиальные клетки могут принимать активированное состояние или могут стать дисфункциональными, что приводит к гибели клеток или миграции из кровеносных сосудов. Это может привести к чрезмерному ангиогенезу или разрежению сосудов, может вызвать аномальный кровоток и дефектный барьер кровеносных сосудов, что приводит к экстравазации иммунных клеток и воспалению 12,17,18, Таким образом, исследования по разработке лекарств, модулирующих кровеносные сосуды, высоки, и уже было выявлено множество молекулярных игроков и концепций для терапевтического нацеливания. В этом контексте описанный протокол особенно подходит для построения моделей заболеваний и для тестирования лекарств, поскольку он повторяет ключевые особенности ангиогенеза прорастания in vivo , включая отбор эндотелиальных клеток кончика и стебля, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, руководство эндотелиальными клетками, формирование трубок и рекрутирование клеток фремиссии. Он также демонстрирует сходство с недавно описанными 3D-сосудистыми анализами, основанными на технологиях iPSC человека Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Конфокальная визуализация, морфометрический и количественный анализ эндотелиальных ростков БЭ. Обзор протокола анализа прорастания кровеносных сосудов показан на рисунке 1. Все клеточные линии демонстрировали надежную эндотелиальную дифференцировку, и никаких различий в их способности дифференцироваться в эндотелиальные клетки не наблюдалось. Уровни экспрессии мРНК всех проанализированных маркеров Flk1, Flt1 , Flt4 , Eng , Tie2 и Cdh5 были сопоставимы между клеточными линиями и экспериментами, что подтверждает надежность протокола дифференцировки рис. Затем была продемонстрирована способность модели EB прорастания сосудов проводить скрининг препаратов, модулирующих ангиогенез рис. Эти соединения широко используются у мышей для соответствующего блокирования ангиогенеза путем ингибирования активности VEGFR2 или для стимулирования дифференцировки эндотелиальных кончиковых клеток и образования плотного сосудистого сплетения путем нацеливания на передачу сигналов Notch рис. Высокая доза DAPT также приводила к слиянию сосудов и образованию крупных и плоских участков эндотелиальных клеток без организации рис. Результаты подтвердили способность модели тестировать препараты, которые либо способствуют, либо ингибируют ангиогенез. Ген Acvrl1 кодирует ALK1 активиновую рецептороподобную киназу 1 , рецептор, специфически экспрессируемый в эндотелиальных клетках, который в случае мутации отвечает за развитие редкого сосудистого заболевания с ангиодисплазией, называемого наследственной геморрагической телеангиэктазией HHT. Они подтвердили in vitro неправильный фенотип, наблюдаемый у мышей с HHT рис. При формировании химерных ЭБ, содержащих дифференцированные флуоресцентно меченные mESC и mESC определенного генотипа, включается альтернативный протокол для изучения процесса выбора кончика эндотелия рис. Конфокальное изображение помеченных PECAM-1 ростков сосудов определило генотипическое происхождение ведущих клеток эндотелия рис. Смеси линии mESC желтый флуоресцентный белок дикого типа в соотношении с одной немеченой линией mESC дикого типа последовательно приводили к равному вкладу каждой популяции в ведущие эндотелиальные концевые клетки рис. Этот протокол также подходит для количественной оценки покрытия настенных клеток ростка сосуда. Изображение с большим увеличением показало, как один отдельный росток сосуда был окружен клетками фрески рис. Двоичное преобразование было выполнено после разделения цветовых каналов рис. Рисунок 1 : Хронология протокольных процедур. Пожалуйста , нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3 : 3D-анализ прорастающего ангиогенеза для тестирования лекарств. В Количественная оценка числа ростков на ЭБ. С Количественная оценка длины ростка. D На верхней левой панели большое увеличение эндотелиального ростка, показывающее сложность сети и точку ветвления, считая два разных слоя из одного и того же ЭБ, на нижней левой панели схематическое изображение, представляющее метод измерения ориентации эндотелиального ростка. Рисунок 4 : Дефектное прорастание сосудов при наследственной геморрагической телеангиэктазии БЭ. C Количественная оценка относительного генотипирования верхушечных клеток из репрезентативных БЭ дикого типа. E Большое увеличение эндотелиального ростка белая прямоугольная пунктирная рамка от D , показывающее взаимодействие фрески и эндотелиальных клеток. Ф-Г Изображения цветного эндотелиального ростка и связанные с ними бинарные трансформированные изображения. Соотношение ростков эндотелиальных клеток, покрытых клетками фрески. Этот протокол описывает объективный, надежный и воспроизводимый 3D-анализ прорастания сосудов на основе EB, который поддается скринингу лекарств и генов, модулирующих ангиогенез. Этот метод имеет преимущества по сравнению со многими широко используемыми двумерными 2D анализами с использованием культур эндотелиальных клеток, таких как эндотелиальные клетки пупочной вены человека HUVEC , для мониторинга миграции анализ боковых царапин или анализ камеры Бойдена 22,23 или пролиферации подсчет количества клеток, обнаружение синтеза ДНК , обнаружение маркеров пролиферации или метаболические анализы 24 В этом уникальном смысле он позволяет изучать дифференцировку как эндотелиальных, так и стеновых клеток и их организацию в сосудистую сеть, имитирующую ключевые этапы прорастающего ангиогенеза. Эти этапы включают отбор клеток кончика эндотелия, пролиферацию клеток стебля, пространственную ориентацию и миграцию ростка сосуда, а также рекрутирование клеток фрески в зарождающийся кровеносный сосуд Он также предлагает преимущества для многих 3D-моделей ангиогенеза. Фибриновый шарик 26,27 или анализ коллагенового геля 28,29,30 , имитирующий тубулогенез, обычно используют HUVEC или эндотелиальные клетки, образующие колониеобразующие эндотелии ECFC-EC , поскольку они имеют высокую скорость пролиферации, но не подходят для первичных эндотелиальных клеток мыши , которые трудно поддерживать в культуре. Эксплантат 31 сетчатки ex vivo или анализ 32 васкуляризированных микроорганов могут хорошо повторять все этапы образования кровеносных сосудов, но они имеют сложные экспериментальные процедуры и не подходят для высокопроизводительного лекарственного или генетического скрининга. Это также верно для анализа аортального кольца ex vivo 33,34 и для многих анализов in vivo , таких как опухоль, имплантированная мышам, или исследования потери функции у мышей , которые часто имеют высокую стоимость и трудности в получении большого количества данных Этот протокол также хорошо дополняет аналогичные анализы ангиогенеза in vitro с использованием человеческих ИПСК, что позволяет сравнивать данные мыши и человека. Хотя важно отметить, что эндотелиальные клетки, полученные из ИПСК человека, демонстрируют меньшую способность к прорастанию, чем клетки мыши 36, Разработанный здесь метод также имеет некоторые ограничения. Он не может оценить влияние потока жидкости на созревание кровеносных сосудов, проницаемость сосудов и не производит зарождающийся кровеносный сосуд в определенной тканевой среде по сравнению с последними микрофабрикатами, которые находятся в стадии разработки. Действительно, технологии «орган-на-чипе», сочетающие микрофлюидику с тканевой инженерией, могут обеспечить культивируемым эндотелиальным клеткам микроокружение, аналогичное микроокружению in vivo 38, Микрофлюидные системы содержат правильный состав внеклеточного матрикса и предназначены для получения механических сигналов, таких как напряжение сдвига. Некоторые из них предназначены для включения настенных клеток и других поддерживающих клеток данной ткани или могут генерировать химические градиенты. Они содержат сети заполненных жидкостью каналов микронного масштаба, которые похожи по размеру и структуре на кровеносные капилляры. Технологии «орган-на-чипе» также позволяют количественно определять конкретные сосудистые функции, включая проницаемость и трансэндотелиальное электрическое сопротивление. Несмотря на то, что технологии «орган-на-чипе» являются многообещающими, они выходят далеко за рамки исследовательского опыта большинства биологических лабораторий, по-прежнему нуждаются в надлежащей стандартизации и требуют специализированных методов изготовления. Коммерциализация производства технологии «орган-на-чипе» только начинается, и в настоящее время эти системы считаются непомерно дорогими для фармацевтических компаний 40, Есть несколько важных шагов, которые следует принять во внимание. Используйте высококачественные клетки, которые надежно экспрессируют общепринятые маркеры Nanog, Oct4, Sox2 и SSEA-1 плюрипотентного состояния. Важно тщательно следить за их ростом, формой клеток mES, а также за размером и морфологией колоний mES. Поскольку кариотипическая стабильность является стохастической в культивируемых клетках, необходима ее переоценка после обширного пассажа. Рекомендуется использовать продукты, уже протестированные для культивирования mESC, и тестировать кормушки MEF, сыворотку плода телята и все химические соединения для нескольких пассажей, чтобы определить, сохраняют ли мЭСК свои клеточные свойства или дифференцируются или приобретают эпибластический фенотип. Среду следует ежедневно обновлять, и нельзя допускать, чтобы колонии mESC становились слишком большими и плотными. Наконец, mESCs необходимо культивировать, по крайней мере, для двух пассажей без 2i перед дифференцировкой, чтобы обеспечить наилучший выход эндотелиальных клеток. Дифференцировка эндотелия включает два важных этапа: формирование БЭ методом висячей капли и их культивирование в условиях флоатинга в присутствии среды для сосудистой дифференцировки 13, Движение подвесных тарелок должно быть сведено к минимуму, чтобы добиться равномерной агрегации клеток. При культивировании в условиях плавания ЭБ необходимо тщательно распределять и избегать движения, которое способствует слипанию БЭ. Наконец, БЭ культивируются в геле коллагена I с образованием ростков сосудов. Ангиогенная среда должна быть свежеприготовленной и после смешивания с коллагеном I должна поддерживаться на льду, чтобы избежать спонтанного гелеобразования. В случае тестирования лекарств лекарства добавляются в холодную смесь в нужной концентрации на этом этапе. Регулировка рН с помощью NaOH перед ресуспендированием ЭБ имеет решающее значение, в противном случае кислотность коллагена вызовет токсичность клеток. Наконец, ЭБ должны быть распределены на равном расстоянии друг от друга, чтобы обеспечить воспроизводимые результаты. В заключение, этот метод представляет собой 3D-анализ прорастания сосудов на основе mESC, который обладает необходимой надежностью и масштабируемостью для использования для генетического скрининга, как недавно описано Elling U. Galaris, G. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Biology. Таблицу материалов. Центрифугируйте клетки при x g в течение 5 мин при комнатной температуре RT. Ежедневно обновляйте средство. Добавьте мкл теплого кратного буфера TVP и инкубируйте при RT в течение 30 с, чтобы инициировать ферментативную диссоциацию. Пропустите клетки, перенеся их на новую луночную пластину для культивирования клеток с MEF коэффициент расщепления: Аккуратно перемешайте, чтобы распределить клетки и инкубировать в инкубаторе CO 2. Чтобы получить чистую популяцию мЭСК, трипсинизируют пластину для культивирования клеток кратным буфером TVP в течение 30 с при ЛТ, ресуспендируют клетки в среде дифференцировки мезодермы объемом 1 мл, а затем переносят их в 6-луночную пластину, покрытую желатином, в течение 30 мин, позволяя МЭФ прикрепляться, пока мЭСК остаются в суспензии. Центрифугируют клетки при x g в течение 5 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в среде дифференцировки мезодермы до достижения 4,55 x 10 4 клеток на мл. Наполните дно посуды из полистирола с низкой насадкой 94 мм 15 мл стерильной воды. Перенесите клеточную суспензию в стерильный пластиковый резервуар и загрузите в четыре положения многоканальной пипетки 22 мкл клеточной суспензии на канал 1 x 10,3 клетки на 22 мкл капли. Поднимите и переверните крышку посуды диаметром 94 мм и поставьте ее на чистую поверхность шкафа внутренней стороной вверх. Нанесите 40 капель клеточной суспензии на внутреннюю поверхность каждой крышки. Осторожно переверните крышку без помех и положите ее обратно на блюдо так, чтобы капли были обращены к воде. Инкубируйте посуду в инкубаторе CO 2. Считайте, что это день дифференциации 0. Выдерживайте пластины в течение 4 дней до образования ЭБ. Конкурсный анализ положения ячейки наконечника Культивируют одну флуоресцентную и одну нефлуоресцентную линию mESC, как описано ранее Приготовьте мозаичные ЭБ, смешав равные количества двух линий mESC соотношение , и инкубируйте подвесные чашки в инкубаторе CO 2, как описано на шаге 2. Плавающая культура БЭ для дифференцировки сосудов Перед сбором ЭБ из висячих капель подготовьте следующее. Дайте агару застыть в течение 1 часа при RT. Соберите висячие капли в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки P и удалите надосадочную жидкость через несколько минут после осаждения EB. Ресуспендировать БЭ в 3 мл 2-кратной среды для сосудистой дифференцировки, перенести суспензию ЭБ в одну суспензию, покрытую агаром, равномерно распределить БЭ, чтобы избежать агрегации. Анализ проточной цитометрии Соберите 9-дневные ЭБ в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки P и промойте их один раз теплым PBS. Диссоциируйте ЭБ, аккуратно пипетируя вверх и вниз пипеткой P Центрифугируйте клетки при x g в течение 5 мин при RT. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра Нойбауэра. Ресуспендируют клетки, чтобы достичь конечной концентрации 5 x 10,6 клеток на мл. Отфильтруйте ячейки с помощью пробирки из полистирола с круглым дном и защелкивающейся крышкой сетчатого фильтра. Чтобы избежать гелеобразования коллагена, поддерживайте среду для проращивания на льду до использования. Чтобы оценить эффект проангиогенных молекул, добавьте выбранное лекарство или носитель в среду для прорастания в выбранной концентрации. Соберите 9-дневные ЭБ из одной чашки агара диаметром 60 мм в коническую пробирку объемом 15 мл эквивалентно одному условию и удалите надосадочную жидкость через несколько минут после осаждения. Ресуспендируют ЭБ в 2 мл среды для холодного проращивания. Перенесите суспензию в культуральную чашку диаметром 35 мм, покрытую первым слоем проращивающей среды. Распределите ЭБ по всей тарелке и убедитесь, что они находятся на равном расстоянии друг от друга. Инкубируйте чашку в инкубаторе CO 2. Формирование первого ростка происходит в течение часов. На й день коллагеновый гель, содержащий ЭБ, осторожно переносится на предметное стекло 75 х 26 мм с помощью шпателя. Удалите лишнюю жидкость с помощью пипетки P и обезвоживайте гель, положив поверх геля марлевый лист нейлонового льна и впитывающие фильтрующие карты гелевую промокательную бумагу. Надавите, поместив груз г на 2 мин. Исправьте ЭБ раствором цинка см. Снимите фиксатор. Удалите раствор для пермеабилизации. Промойте предметные стекла пять раз с помощью PBS в течение 5 минут. Промойте предметные стекла три раза с помощью PBS в течение 5 минут и один раз с H 2 0 перед их установкой. Конфокальная визуализация, морфометрический и количественный анализ эндотелиальных ростков БЭ Получение изображений иммуноокрашенных ЭБ с высоким разрешением путем слияния в фокальной плоскости z-стекирование с помощью конфокального микроскопа. Используйте объектив с кратным увеличением для получения изображения целых ЭБ. Проанализируйте изображения, полученные с помощью ImageJ, для оценки морфологии и количественной оценки характеристик положительных эндотелиальных ростков PECAM-1 в соответствии с установленными методами количественной оценки 13,14, Рассчитайте среднее количество эндотелиальных ростков на ЭБ, вручную подсчитав общее количество ростков на отдельные ЭБ. Измерьте длину отдельных ростков с помощью инструмента рисования ImageJ. Определите основание эндотелиального ростка, начиная с области ядра БЭ, и вручную проведите линию до конца кончика ростка. Рассчитайте среднее количество ячеек верхушки на росток, вручную подсчитав количество клеток кончиков на отдельный росток, а затем рассчитайте среднее значение на ЭБ. Рассчитайте ориентацию филоподии, вручную определив ось родительского ростка, и измерьте острый угол между ними с помощью программного инструмента угла ImageJ. Получение изображений иммуноокрашенных БЭ с высоким разрешением с помощью конфокального микроскопа. Используйте объектив с кратным увеличением для получения изображений с высоким разрешением отдельных эндотелиальных ростков. Разделите объединенные изображения на отдельные красный и зеленый каналы. Преобразуйте изображения в двоичную форму. Сгенерируйте объединенное изображение с помощью функции калькулятора изображений и оператора AND. Измерьте общую площадь ячейки изображения. Чтобы рассчитать охват, разделите площадь колокализованного изображения на площадь двоичного изображения PECAM Рассчитайте средние значения на EB. Play Video. Cite this Article Galaris, G. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close. Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Mechanisms of Development. Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S.
Меф Ск бесплатные пробы Базель
Меф Ск бесплатные пробы Базель
Щёлкино купить закладку Лирику 300
N1 CITY CURRENT 2
Меф Ск бесплатные пробы Базель
MDMA XTC экстази бесплатные пробы Лавиани Атолл