Marijuana Cassandra
Marijuana CassandraMarijuana Cassandra
__________________________________
Marijuana Cassandra
__________________________________
📍 Добро Пожаловать в Проверенный шоп.
📍 Отзывы и Гарантии! Работаем с 2021 года.
__________________________________
✅ ️Наши контакты (Telegram):✅ ️
✅ ️ ▲ ✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ✅ ️
__________________________________
⛔ ВНИМАНИЕ! ⛔
📍 ИСПОЛЬЗУЙТЕ ВПН (VPN), ЕСЛИ ССЫЛКА НЕ ОТКРЫВАЕТСЯ!
📍 В Телеграм переходить только по ссылке что выше! В поиске тг фейки!
__________________________________
Marijuana Cassandra
Настоящий протокол разрабатывает основанный на изображениях метод быстрого, неразрушающего и безметочного измерения плотности и жизнеспособности региональных клеток в 3D-опухолевых агрегатах. Модели многоклеточных сфероидов опухолей MCTS продемонстрировали растущую полезность для изучения in vitro прогрессирования рака и открытия лекарств. Эти относительно простые аваскулярные конструкции имитируют ключевые аспекты опухолей in vivo , такие как 3D-структура и патофизиологические градиенты. Модели MCTSs могут дать представление о поведении раковых клеток во время развития сфероидов и в ответ на лекарства; однако их необходимый размер резко ограничивает инструменты, используемые для неразрушающей оценки. Структурная визуализация оптической когерентной томографии и программное обеспечение для 3D-анализа Imaris исследуются для быстрого, неразрушающего и безметочного измерения плотности региональных клеток в MCTS. Этот подход используется для оценки MCTS в течение 4-дневного периода созревания и в течение длительного 5-дневного лечения Трастузумабом, клинически значимым анти-HER2 препаратом. Плотность клеток во внешней области, переходной области и внутреннем ядре характеризовалась в зрелых MCTS, выявляя градиент плотности клеток с более высокой плотностью клеток в основных областях по сравнению с внешними слоями. Добавление матрицы перераспределяло плотность клеток и усиливало этот градиент, уменьшая плотность внешней зоны и увеличивая уплотнение клеток в ядрах. Плотность клеток количественно определяли после лечения препаратом 0 ч, 24 ч, 5 дней в прогрессивно более глубоких мкм зонах для оценки потенциальных региональных различий в лекарственном ответе. К конечной временной точке почти вся гибель клеток, по-видимому, была ограничена внешними мкм каждой совокупности, в то время как клетки, более глубокие в совокупности, оказались в значительной степени незатронутыми, что иллюстрирует региональные различия в ответе на лекарство, возможно, из-за ограничений в проникновении лекарств. Текущий протокол предоставляет уникальную технику для неразрушающей количественной оценки плотности региональных клеток в плотных клеточных тканях и измерения ее продольно. Исследователи в значительной степени обратились к настольным системам 3D-культур in vitro для изучения некоторых ключевых особенностей прогрессирования опухоли. Большая часть этих исследований была проведена повторным появлением многоклеточных сфероидов опухолей MCTS и более сложных органоидов 1,2. Хотя эти модели являются аваскулярными, они обеспечивают мощный инструмент для рекапитуляции физиологических и патологических процессов, которые происходят in vivo 3,4,5. В частности, модели среднего размера диаметр мкм могут имитировать ключевые особенности опухоли, такие как 3D-структура, патофизиологические градиенты и метастатическая сигнализация из-за гипоксии в ядре. Уникальное понимание может быть получено из этих моделей, характеризуя поведение клеток в этих слоях, во время разработки и в ответ на препарат. Однако необходимый размер MCTS, необходимый для разработки градиентов, которые делают их такими мощными моделями in vitro , резко ограничивает инструменты, используемые для неразрушающей оценки. Действительно, одной из самых больших проблем с неразрушающим анализом MTCS является количественная оценка деталей клеточного масштаба. Ярко-полевая и фазово-контрастная микроскопия обычно используются для неразрушающей оценки роста и развития 3D-MCTS. Однако эти модальности ограничены 2D-проекциями, не имея возможности визуализировать важнейшую 3D-структуру этих моделей 10,11,12, Информация о цитотоксичности и пролиферации клеток обычно собирается с помощью флуоресцентной визуализации то есть микроскопии светового листа, конфокальной микроскопии или иммуногистологического окрашивания ex vivo 14,15, Оптическая когерентная томография ОКТ является неразрушающей структурной визуализацией, которая может преодолеть некоторые из проблем, упомянутых выше. Он может похвастаться сотовым разрешением и достаточно широким полем зрения до 10 мм х 10 мм , способным визуализировать целые многоклеточные агрегаты 17,18, Важно отметить, что из-за видимого характера используемого света эта техника полностью неразрушающая и без меток В последнее время появилось много исследований, направленных на использование ОКТ для анализа поведения сфероидов опухоли. В одной из самых захватывающих демонстраций Huang et al. Аналогичным образом, Hari et al. Их измерений было недостаточно для прямых выводов, хотя они наблюдали более низкий RI в местах, которые коррелировали с участком, хотя и не размером, некротических ядер, позже идентифицированных с помощью конфокальной микроскопии. Abd El-Sadek et al. Наша опубликованная работа с использованием OCT основана на этой предыдущей литературе, чтобы установить количественный, неразрушающий подход к измерению морфологии 3D и количества клеток в моделях рака молочной железы MCTS во время разработки 10, Используя программное обеспечение для анализа изображений Imaris 3D для подсчета количества объектов размером с клетку т. Пятен , изображенных в рамках сканирования объема OCT, количество клеток было неразрушающе измерено в MCTS, которые были статистически аналогичны тем, которые были определены с помощью гемоцитометра при совокупной диссоциации. Однако из-за структурной природы ОКТ клеточные мембраны, все еще присутствующие после гибели клеток в результате некроза, могут ошибочно считаться живыми клетками. Кроме того, эта характеристика была расширена для неразрушающего отслеживания жизнеспособности клеток в отдельных агрегатах, подвергшихся лекарственному режиму с многообещающим успехом Важно отметить, что аналогичная жизнеспособность клеток была сообщена из нашего подхода OCT-Imaris с тем, что было бенчмаркировано в этих образцах при диссоциации. В настоящей работе сообщается об улучшенном подходе к непосредственной количественной оценке региональной плотности клеток в плотных агрегатах путем использования способности OCT-Imaris измерять как 3D-агрегированную морфологию, так и количество клеток. Это методологическое достижение обеспечивает более подробную картину пространственного распределения и пролиферации клеток в характерных концентрических слоях моделей MCTS. Вместо того, чтобы просто вычислять общую среднюю совокупную плотность клеток, такие локальные измерения плотности могут выявить градиенты плотности клеток, такие как те, которые связаны с уплотнением. Эта региональная оценка также применяется к агрегатам, получавшим химиотерапевтическое средство, для оценки регионального лекарственного ответа, измеряемого изменениями местной плотности клеток. Эта комбинация OCT и передовых методов анализа изображений обеспечивает количественную оценку жизнеспособности региональных клеток, которая может быть использована для изучения проникновения лекарств на основе того, какие области испытывают снижение плотности клеток. Это первый отчет, в котором неразрушающе количественно оценивается плотность и жизнеспособность региональных клеток в ответ на препарат в плотных клеточных тканях и измеряется его продольно. Такая характеристика трехмерной плотности клеток и пространственного распределения по всем MCTS может помочь оптимизировать доставку лекарств при лечении рака и улучшить понимание прогрессирования модели рака. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Таблицу материалов. Для текущего исследования была использована коммерческая система спектрально-доменной оптической когерентной томографии SDOCT, см. Таблицу материалов для визуализации OCT. Хотя этот подход подходит практически для любой системы OCT, и процедура, применяемая в целом, будет одинаковой между различными системами, некоторые из последующих подробных шагов специфичны для настоящего оборудования. Рисунок 1 : Схематическая иллюстрация. A Концентрический слой оболочки для оценки плотности региональных клеток в сферических агрегатах. C Для исследований проникновения наркотиков используется пространственно-уточненный региональный метод пробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. В предыдущей публикации был установлен метод неразрушающего измерения глобальной плотности клеток в клеточных агрегатах с использованием OCT При этом этот метод расширен для оценки региональной плотности клеток развивающихся клеточных агрегатов. На рисунке 1 показана схема этого расширения, где плотность клеток может быть оценена в концентрических слоях сфероида или более локально, глядя вместо этого на небольшие диаметром мкм сферические пробки, обозначенные желтыми кругами на рисунке 1B , C. Эти результаты представлены на рисунке 2. Этот результат указывает на уплотнение в сфероидном ядре через 4 дня. Рисунок 2 : Различия в региональной плотности, рассчитанные по концентрическому слоевому подходу для сферических агрегатов MDA-MB Среднее общее количество ячеек отображается синей линией. Шкала масштаба для изображения вставки составляет мкм. Однако ограничением этого метода концентрического слоя является то, что он может использоваться только на сферических агрегатах. Таким образом, подход к подсчету клеток был адаптирован для создания метода Regional Plug, который отбирает небольшие зоны в последовательных местах через агрегат, сродни виртуальной биопсии. Эти заглушки обеспечивают измерение локальной плотности клеток на определенных глубинах. Этот метод был проверен на соответствие подходу концентрического слоя путем выполнения анализа на тех же сфероидах MDA-MB рисунок 3. Результаты показали хорошее согласие между региональным подходами к штепсельной вилке и концентрическому слою для этих сферических агрегатов. Затем этот метод был применен для оценки как сферических, так и несферических опухолевых агрегатов на 4-й день зрелости рисунок 4 , наблюдая аналогичную тенденцию к уплотнению ядра для всех тестируемых морфологий, независимо от типа клеток. Эта тенденция была наиболее заметна в образцах, полученных с помощью Matrigel матрица базальной мембраны , добавки, которая, как известно, способствует агрегации, но экзогенные факторы и состав которой плохо характеризуются 31,32, Интересно, что добавление матрицы, по-видимому, не влияет на объем или количество клеток и, таким образом, оказывает незначительное влияние на пролиферацию клеток. Скорее, добавление матрицы, по-видимому, перераспределяет плотность клеток, способствуя значительному уплотнению ядра и снижению плотности клеток во внешних слоях. Эти результаты также показывают, что клетки AU кажутся менее чувствительными к эффектам агрегации, опосредованным матрицей, чем клетки MDA-MB Эти результаты дают ценную информацию о физических механизмах, с помощью которых матрица обеспечивает агрегацию клеток в различных клеточных линиях рака молочной железы. Важно отметить, что подход с региональной заглушкой должен подходить для любых MCTS, отображающих сферическую или несферическую совокупную геометрию. Рисунок 4 : Добавление матрицы способствует большей агрегации и перераспределяет плотность клеток в линиях раковых клеток. Среднее общее количество ячеек отображается синими линиями. Затем этот региональный подход был использован для отслеживания гибели клеток в опухолевых агрегатах, обработанных TZM, неразрушающе. AU MCTS, приготовленные с мембранной матрицей, обрабатывали TZM на 4-й день разработки и культивировали до 9-го дня с ключевыми временными точками визуализации OCT через 0 ч до приема препарата , 24 ч и ч 5 дней. Пространственно определенный метод региональной вилки применялся в каждой точке времени, при этом заглушки устанавливались каждые мкм по всей толщине каждого агрегата, как показано желтыми кругами на рисунке 1C. Размер центральной пробки оставался постоянным, в то время как внешняя пробка колебалась в диаметре, соответствующем изменению размера заполнителя. Незначительные колебания плотности клеток наблюдались с течением времени во внутренних мкм каждой совокупности, что указывает на минимальную гибель клеток рисунок 5. Действительно, большинство клеточных смертей произошло во внешних мкм каждого агрегата, особенно в самых внешних мкм, которые полностью исчезли к часовой временной точке для всех проанализированных агрегатов. Визуализация гибели клеток как индикативного лекарственного ответа в основном во внешних слоях MCTS согласуется с проблемами проникновения препарата TZM, клинически значимого препарата антител с молекулярной массой кДа Действительно, препарат опирается на пассивную диффузию через эти плотные клеточные модели, что, как ожидается, поставит под сомнение его способность проникать глубже, чем мкм в модели. Рисунок 5 : Жизнеспособность клеток в ответ на препарат, измеренная по всей совокупной толщине. Пробка во внутреннем ядре поддерживалась постоянной при диаметре мкм, в то время как в наружной зоне позволялось колебаться с изменением размера агрегата. A Региональная плотность клеток в ответ на добавление TZM показала, что гибель клеток была в значительной степени ограничена внешними мкм, особенно внешними мкм, которые полностью исчезли после ч лечения. Среднее общее количество ячеек отображается с соответствующими цветными линиями для каждой точки времени. B График тепловой карты, представляющий изменение средней плотности клеток в ответ на препарат в зависимости от совокупной толщины. Значение Многоклеточные сфероиды опухолей MCTS являются мощными 3D-моделями in vitro для изучения прогрессирования опухоли и скрининга лекарств 1,2,3. Продвижение полезности этих относительно простых агрегированных моделей в значительной степени зависит от характеристики их ключевых особенностей, таких как морфология и плотность клеток, которые, как известно, влияют как на прогрессирование опухолевой модели, так и на терапевтический ответ. Однако их необходимый размер создает проблемы при оценке этих характеристик, особенно для неразрушающего анализа. Представленный способ предоставляет новый инструмент для продольной и безметочной количественной оценки плотности и жизнеспособности клеток в дискретных областях плотных 3D-агрегатных моделей. Одна и та же совокупность может быть повторно изображена с помощью оптической когерентной томографии OCT в течение нескольких дней разработки. Эти объемные сканирования могут быть проанализированы, чтобы охарактеризовать, как плотность клеток развивается регионально во время созревания MCTS. Эти же принципы применимы к анализу лекарственных агрегатов, которые могут быть изображены продольно в течение данного режима приема препарата, чтобы определить, где плотность клеток уменьшается, то есть где лекарственное средство может активно убивать клетки. Действительно, этот инструмент может значительно сократить количество образцов, необходимых для данного исследования, поскольку одни и те же образцы могут быть проанализированы последовательно. Ожидается, что это также приведет к добавленной стоимости в каждый момент времени, поскольку события могут отслеживаться в рамках одной совокупности, поскольку она реагирует на данный стимул, а не полагаться на коррелированные данные из соответствующих возрасту терминальных выборок. Помимо данного применения MCTS, продемонстрированного в настоящем описании, этот метод OCT-Imaris может изучать другие клеточные агрегаты, эмбриоидные тела, более сложные органоиды или образцы тканей толщиной до нескольких миллиметров. Этот протокол улучшит понимание уплотнения клеток во время агрегированной разработки и лекарственного ответа в рамках плотных агрегированных моделей. Применимы модели, выполненные с использованием других клеточных линий; однако некоторая оптимизация протокола может потребоваться из-за изменения среднего размера ячейки и совокупной морфологии. Этот диаметр использовался в качестве диаметра XY в функции «пятен» Имариса, так что объекты такого приблизительного размера были подсчитаны. Изменение этого значения изменяет количество объектов, расположенных в выборке 10 , и более точные результаты ожидаются, когда этот ввод близко соответствует размеру ячейки. Таким образом, подходящий диаметр XY должен быть основан на среднем размере ячейки для используемого типа ячеек. Критические шаги и устранение неполадок Одним из важнейших шагов при создании образа центра развертывания Office является выбор разрешения сканирования. Размер пикселя, заданный пользователем, должен быть достаточно мал, чтобы для определения среднего размера используемого типа ячеек требовалось несколько пикселей. Это повышает точность анализа «пятен» в Imaris, улучшая разрешение ЯКТ ячеек и уменьшая вероятность того, что стохастический пиксельный шум негативно повлияет на подсчет клеток. Выделение образца в системе отсчета Imaris сильно влияет на выходные значения плотности ячеек. Когда пользователь выполняет этот шаг, он сопровождается уровнем субъективности и предвзятости, которые должны последовательно применяться ко всем анализам образцов. При выделении образца в объемное сканирование для начала анализа Имариса необходимо позаботиться о том, чтобы точно проследить агрегированные контуры и избежать включения артефактов т. Отражений от подложек или высоты среды. Правильное размещение систем отсчета во время анализа региональных штепсельных вилок является еще одним важным шагом. Ожидается, что размещение систем отсчета в центре каждого слоя даст наиболее точную оценку плотности клеток в этой области. Такое размещение в системе отсчета имеет еще большее значение для детального анализа региональной пробки, используемого в настоящем документе для исследования лекарственного средства, поскольку для более точного анализа реакции на наркотики должны быть установлены равномерно расположенные зоны. Ограничения и будущие исследования Основным ограничением предлагаемого метода является пользовательская послайная трассировка, выполняемая в Imaris для изоляции агрегата в томе центра развертывания Office. Это критически важный шаг для получения точных результатов, который является несколько субъективным и, следовательно, как ожидается, придаст определенный уровень межпользовательской изменчивости. Чтобы решить эту проблему, мы в настоящее время стремимся включить алгоритм обнаружения краев, выполняемый в Matlab или аналогичном перед загрузкой сканирования в Imaris. Этот алгоритм должен объективно идентифицировать края образца в прогрессивных срезах B-сканирования, после чего предлагаемые анализы могут быть выполнены на этой предварительно изолированной области образца. Устранение этого ограничения устранит вариативность на основе пользователей и, как ожидается, приведет к более широкому применению этого инструмента на основе центра развертывания Office. Способность OCT точно отображать живые клетки в агрегатах во время лечения препаратом зависит от режима гибели клеток, на котором действует препарат. Предполагается, что это связано с оставшимися клеточными мембранами во время некроза, которые, как ожидается, будут появляться в виде живых клеток во время структурной визуализации. Следовательно, ожидается, что результаты живых клеток, представленные в настоящем описании, будут более точными, чем препараты, вызывающие некроз. Это различие следует иметь в виду при применении этого подхода для тестирования жизнеспособности в лекарственных агрегатах. Ожидается, что будущие исследования в области неразрушающей оценки опухолевых агрегатов улучшат понимание того, как они развиваются и реагируют как на внешние стимулы, так и на медикаментозное лечение. Roberge, C. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing Отделяйте клеточные монослои от колб для культивирования стандартным методом трипсинизации. Для ячеек AU аспирировать клеточные среды из колбы с помощью пипетки или, при наличии, с помощью вакуумного насоса, подключенного через трубку к наконечнику автоклавной стеклянной пипетки и заменить 2 мл трипсина-ЭДТА. Оставьте колбу на 3 мин при комнатной температуре, а затем переместите в инкубатор еще на 4 минуты. После этого добавьте 6 мл питательной среды в колбу, чтобы нейтрализовать трипсин. Для клеток MDA-MB аспирируют клеточные среды из колбы таким же образом, как это выполнено на этапе 1. После 7 мин инкубации добавьте в колбу 8,5 мл питательной среды, чтобы нейтрализовать трипсин. Добавляют 10 мкл клеточной суспензии к гемоцитометру для определения количества клеток в суспензии Дозируйте 50 мкл клеточной суспензии в каждую лунку круглодонной, неадгезионной, луночной пластины. Для суспензий, приготовленных без Матригеля матрица базальной мембраны, см. Таблицу материалов , добавляют 50 мкл простой среды роста в каждую лунку. Подготовьте контейнер со питательной средой и поставьте в холодильник на 10 минут до охлаждения. Центрифугируйте пластины при х г в течение 10 мин при комнатной температуре сразу после посева, чтобы обеспечить сбор ячейки гранулы на дне каждой скважины. Авторы отметили, что слишком много времени между этими этапами позволяет клеткам оседать по дну и сторонам каждой скважины, подавляя их способность собирать и агрегировать на дне скважины. Инкубируйте пластины в течение 4 дней, после чего клеточные агрегаты считаются зрелыми. Таблицу материалов в питательных средах AU Культура агрегируется в течение 5 дополнительных дней после добавления TZM и оценивается в ключевые моменты времени. Используйте систему OCT для структурной визуализации. Установите скорость A-сканирования на 5,5 кГц для сбора изображений с высоким разрешением. Установите показатель преломления равным 1,33 для образцов в жидкой среде. Установите размер вокселя равным 1,10 x 1,10 x 2,58 мкм 3. В окне Параметры изображения в правой части экрана задайте поле зрения FOV , введя значения X, Y и Z в мм таким образом, чтобы образец находился в этой интересующей области. Убедитесь, что образец помещается в эту область, чередуя входные данные «Угол» от 0 до 90 градусов и выполняя визуальное подтверждение. Выберите Режим 3D-сбора , а затем нажмите кнопку «Запись », чтобы собрать 3D-сканирование тома образца. Откройте файл центра развертывания Office в пакете средств разработки программного обеспечения. Нажмите «Экспорт», установите тип файла. Откройте программное обеспечение для обработки изображений FIJI, см. Таблица материалов и импортируйте последовательность изображений из папки, в которой хранятся экспортированные JPEG-файлы. Используйте программное обеспечение для сшивания последовательности изображений, а затем сохраните этот файл как изображение TIFF. Создайте реконструкцию тома, выполнив следующие действия. Затем нажмите OK. Нажмите кнопку Добавить новые поверхности над деревом объектов. В меню под деревом нажмите Пропустить автоматическое создание и отредактируйте вручную. В окне Настройка дисплея вручную сдвиньте красные и черные стрелки, чтобы повысить контраст между образцом и фоном и улучшить визуализацию образца. Отрегулируйте положение «Среза» на срез на одном краю образца, т. С помощью клавиши escape переключите мышь из режима навигации в режим Выбора, а затем нажмите кнопку Нарисовать. Вручную проследите контур области, отображающей сигнал. Переместите положение фрагмента, введя следующую позицию в поле ввода. Вручную отследите область, отображающую сигнал. Повторяйте этап 4. Затем нажмите «Создать поверхность» в меню слева, чтобы сшить эти фрагменты вместе и завершить реконструкцию тома. Нажмите «Редактировать», а затем выберите «Выбор маски ». При этом в окне Настройка дисплея будет создан новый канал, содержащий только изолированный образец. Получите общую плотность клеток образца, выполнив следующие действия. Над деревом объектов выберите Добавить новые пятна. В меню Параметры алгоритма снимите флажки со всех полей. Нажмите на синюю стрелку , чтобы перейти на экран Исходного канала. В появившемся раскрывающемся меню выберите замаскированный канал, созданный на шаге 5. Введите средний диаметр ячейки для образца в поле диаметра XY. Убедитесь, что установлен флажок Фоновое вычитание. Этот выбор основан на размере ячейки описано в разделе Обсуждение. Нажмите на синюю стрелку , чтобы перейти на экран Классификация пятен. На графике в нижней части меню щелкните и перетащите левый край желтого порога к левому краю графика, чтобы все объекты были включены в желтый затененный порог. Затем нажмите на зеленую стрелку , чтобы завершить создание пятна. Получите количество идентифицированных объектов т. Чтобы определить среднюю плотность клеток агрегата, разделите количество ячеек агрегата измеренное на этапе 4. Оценка региональной плотности в концентрических слоях сферических агрегатов Рисунок 1А. После морфологического анализа и анализа плотности клеток оценивают региональную плотность. Щелкните поверхность, созданную на шаге 4. Выберите «Добавить новую систему отсчета» в меню над деревом объектов. Установите флажки Видимый и Исправить рядом с XY в меню. Щелкните и перетащите центр значка системы отсчета так, чтобы он находился на одной линии с центральным пятном. Еще раз щелкните и перетащите центр значка системы отсчета так, чтобы он находился на одной линии с центральным пятном. Наконец, повторите это для плоскости YZ, чередуя эти три фиксированные плоскости до тех пор, пока система отсчета идеально не выровняется с центральным пятном. Дважды щелкните систему отсчета в дереве объектов и переименуйте ее в Центральную или Аналогичную. Нажмите на пятна, созданные на шаге 4. Нажимайте на Позицию X Система отсчета , пока она не отобразится от самого высокого до самого низкого значения. Запишите наибольшее значение - это указывает на самый дальний край образца, то есть радиус выборки. Для образцов, которые не проявляют X-Y симметрии асимметричная, эллипсоидная, неправильная геометрия и т. Перейдите в раздел Статистика. В правом нижнем углу меню нажмите «Экспортировать всю статистику в файл» и сохраните данные в электронную таблицу. Выполняйте ручные вычисления для идентификации концентрических слоев вдоль оси X. Рекомендуется поддерживать зоны толщиной мкм, поскольку ожидается, что поведение диффузии изменится на этом расстоянии 7,28,29, В соответствии с этим рассуждением также рекомендуется использовать больше концентрических зон для больших образцов и наоборот для меньших образцов. Установите область внешнего слоя мкм, вычитая мкм из внешнего радиуса, найденного на шаге 4. Таким образом, внешняя область будет охватывать пятна с X-позициями между радиусом X и X внешним, внутренним краем рисунок 1A , оранжевая область. Установите переходную область, вычитая мкм из X внешнего, внутреннего края. Переходная область будет охватывать пятна с X-позициями между X внешним, внутренним краем и X переходным, внутренним краем рисунок 1A , розовая область. Установите центральную область ядра, охватывающую оставшиеся пятна между центром выборки и X переходным, внутренним краем рисунок 1A , синяя область. Откройте сохраненный файл электронной таблицы, созданный на шаге 4. Перейдите на вкладку Расстояние от исходной опорной системы. Результирующее значение представляет собой номер ячейки в этой области. Разделите это значение на объем области, чтобы получить плотность ячейки. Оцените плотность региональных клеток в несферических образцах с помощью «региональных пробок» рисунок 1B. Повторите шаги 4. Выполните ручные расчеты для определения размещения систем отсчета в пределах переходной и внешней областей таким образом, чтобы плотность клеток могла быть оценена в образце в этих местах. Чтобы вычислить внешнее местоположение, вычтите 50 мкм из значения радиуса выборки из шага 4. Над деревом объектов нажмите « Добавить новые пятна» и нажмите «Пропустить автоматическое создание», «Редактировать вручную ». В меню слева введите значения позиции XYZ, рассчитанные выше. Повторите шаг 4. Переименуйте эту систему отсчета во внешнем дереве объектов или аналогичном. Чтобы вычислить переходное среднее местоположение, найдите среднее значение значения центральной позиции X и значения внешней позиции X. Используйте это значение в качестве позиции X для переходной системы отсчета. Как указано выше, используйте одни и те же значения Y и Z, записанные на шаге 4. Нажмите на места, созданные на шаге 4. Откройте электронную таблицу. Расстояние каждого объекта до систем отсчета показано в столбце A, а группировка систем отсчета для каждого объекта показана в столбце G. Отфильтруйте значения в этом столбце для работы с расстояниями в каждой системе отсчета. Результирующее значение соответствует количеству ячеек в этой региональной заглушке. Разделите это значение на объем мкм пробки, чтобы получить плотность ячейки. Выполните метод пространственно-уточненной региональной вилки рисунок 1С. Включение большего количества систем отсчета улучшает разрешение плотностей ячеек, которые могут быть рассчитаны по всей толщине модели. Выполните ручные вычисления для определения дополнительных мест, представляющих интерес. Для этого добавьте мкм к центральному значению X, а затем используйте значения Y и Z центральной точки для определения первого местоположения вдоль центральной оси. Добавьте систему отсчета в это положение, как показано на шаге 4. Разделите эти значения на объем каждой соответствующей пробки, чтобы получить локальную плотность ячеек. Повторите все шаги в этом разделе для данных OCT, собранных в каждой точке испытания препарата. Сравнение количества клеток в каждом месте через курс времени лечения должно выявить, где плотность клеток уменьшается т. Области, испытывающие гибель клеток и, следовательно, насколько глубоко проникает препарат т. В каких слоях наблюдается падение плотности клеток по сравнению с теми, которые поддерживают или демонстрируют увеличение уровней плотности клеток. Play Video. Cite this Article Roberge, C. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close. Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy.
Z Nation (VOST)
Marijuana Cassandra
Marijuana Cassandra
ТТК блокирует сервисы Google — General — Форум
Частные врачи в Брандоне
Marijuana Cassandra
Купить Кокс Рейкьявик Кокс Рейкьявик
Частные врачи в Брандоне
Marijuana Cassandra
Marijuana Cassandra
Закладки скорость a-PVP в Юхнове
Z Nation (VOST)
Сканк англ. Skunk , « Скунк » — сорта конопли чаще всего гибридные , обладающие выраженным специфическим запахом и обладающими быстрым и сильным наркотическим эффектом. Эффект «сканка» отличается повышенной, по сравнению с другими сортами конопли, галлюциногенной составляющей. Термин возник на Ямайке в растафарианской среде и был популяризован в текстах песен стиля рэгги. Начиная с х гг. Все сорта «сканк» имеют долгий период цветения — от 9 до 11 недель, обладают крупными липкими соцветиями и малым количеством листьев. Цветение через 8 - 9 недель после прорастания , хорошо растут в теплицах , легко размножаются черенкованием. По психотропному действию — сатива с лёгким оттенком индики ; в некоторых каталогах такой тип воздействия называют «skunky». Сорта линии «Skunk» неоднократно побеждали в конкурсе « Cannabis Cup » в различных номинациях \\\\\\\\\[1\\\\\\\\\] \\\\\\\\\[ источник не указан дней \\\\\\\\\]. Материал из Википедии — свободной энциклопедии. Текущая версия страницы пока не проверялась опытными участниками и может значительно отличаться от версии , проверенной 19 октября года; проверки требуют 16 правок. Анслингер Б. Вахтель Б. Вутон Д. Гайдук Гринспун Л. Донахью Х. Дронкерс Б. Ла Гардия Ф. Ладлоу Т. Лири Д. Маркс Боб Марли Т. Маккенна Р. Мешулам Ж. Моро де Тур У. Рейнольдс Э. Розенталь Х. Сервантес Б. Тейлор С. Хагер Дж. Хаффман Д. Херер М. Клуб гашишистов « Искусственный рай »: « Поэма гашиша » и « Вино и гашиш » Ш. Бодлера « Клуб любителей гашиша » Т. Гарленда « Растаманские народные сказки » « Страна сарацинов ». Во все тяжкие Saving Grace Шу-Чу. Категория : Сорта конопли. Скрытые категории: Википедия:Статьи с оригиналом названия без шаблона lang-XX Википедия:Статьи без источников тип: не указан Википедия:Нет источников с апреля Википедия:Статьи с утверждениями без источников более 14 дней. Пространства имён Статья Обсуждение. Скачать как PDF Версия для печати. Cannabis Cup многократно.
Marijuana Cassandra
Червиния Купить закладку Кокаин
Частные врачи в Брандоне
Marijuana Cassandra