Лондон бесплатные пробы Соль, альфа pvp

__________________________________

__________________________________

📍 Добро Пожаловать в Проверенный шоп.

📍 Отзывы и Гарантии! Работаем с 2021 года.

__________________________________

✅ ️Наши контакты (Telegram):✅ ️

>>>🔥🔥🔥(ЖМИ СЮДА)🔥🔥🔥<<<

✅ ️ ▲ ✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ✅ ️

__________________________________

⛔ ВНИМАНИЕ! ⛔

📍 ИСПОЛЬЗУЙТЕ ВПН (VPN), ЕСЛИ ССЫЛКА НЕ ОТКРЫВАЕТСЯ!

📍 В Телеграм переходить только по ссылке что выше! В поиске тг фейки!

__________________________________

Лондон бесплатные пробы Соль, альфа pvp

Тканевые сложности многоклеточных систем смужает выявление причинно-следственной связи между внеклеточными сигналами и индивидуальным клеточным поведением. Здесь мы представляем метод изучения прямой связи между контактно-зависимыми сигналами и осями деления с помощью c. В многоклеточных системах отдельные клетки окружены различными физическими и химическими сигналами, поступающими из соседних клеток и окружающей среды. Эта сложность тканей смужает выявление причинно-следственной связи между наличностью и клеточной динамикой. Синтетически восстановленная многоклеточная система преодолевает эту проблему, позволяя исследователям тестировать на определенный сигнал, устраняя при этом других. Здесь мы представляем метод восстановления клеточных контактных моделей с изолированными Caenorhabditis elegans blastomere и клеевыми бусинами из полистирола. Процедуры включают удаление яичной скорлупы, изоляцию бластомеров, нарушая сцепление клеток, приготовление клейких бусинов, и восстановление контакта клеток или клеточного бисера. Наконец, мы представляем применение этого метода для исследования ориентации клеточного деления осей, что способствует регуляции пространственного клеточного шаблона и спецификации судьбы клеток в развивающихся эмбрионах. Этот надежный, воспроизводимый и универсальный метод in vitro позволяет изучать прямые связи между структурами контакта пространственных клеток и клеточными реакциями. Во время многоклеточного развития клеточное поведение например, ось деления отдельных клеток определяется различными химическими и физическими сигналами. Чтобы понять, как отдельные клетки интерпретирует эту информацию, и как они регулируют многоклеточной сборки как возникающие свойства является одной из конечных целей морфогенеза исследований. Модель организма C. Хотя существуют различные генетические инструменты, методы тканевой инженерии ограничены. Наиболее успешным методом тканевой инженерии в исследовании C. Хотя этот метод изоляции бластомеров позволяет восстановить контакт клеток в упрощенном порядке, он не позволяет устранить нежелательные сигналы; контакт клеток по-прежнему представляет собой как механические например, сливки , так и химические сигналы, тем самым ограничивая нашу способность полностью анализировать причинно-следственную связь между кием и клеточным поведением. Метод, представленный в этой работе, использует карбоксилат модифицированные полистиролные бусы, которые могут ковалентно связываться с любыми амино-реактивными молекулами, включая белки в виде лигандов. В частности, мы использовали амин-реактивную форму родамин Red-X в качестве лигана, чтобы сделать бисер как визуально отслеживаемый и клей к клетке. Карбоксильные группы поверхности бисера и первичные группы амина молекулы лиганд соединены водорастворимым карбодиамидом 1-этил диметиламинопропил карбодиамидом EDAC 8 , 9. Полученные клеевые бусы позволяют эффекты механического сигнала на клеточной динамике Мы использовали этот метод для определения механических сигналов, необходимых для ориентации деления клеток Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Мы использовали mCherry помечены гистон в качестве маркера прогрессии клеточного цикла. Поскольку и Родамин Red-X, и mCherry будут освещены лазером нм, оптимальная интенсивность сигнала Родамин Красный X сопоставима с гистоном, чтобы позволить одновременное изображение клеток и бисера. Например, сигнал флуоресценции от биса обработанные с 0. Blastomere изоляции была выполнена в соответствии с процедурами, показанные в Рисунке 4. Следующие моменты должны быть рассмотрены для успешных экспериментов. Поэтому опустите увеличение микроскопа и сосредоточьтесь на поверхности капли, чтобы облегчить перенос эмбрионов. Следовательно, продолжительность пребывания эмбрионов в гипохлоритном растворе должна быть проверена на каждую новую партию гипохлоритного раствора. Следовательно, силы, приложенные на рот пипетки должны быть слегка снижены, чтобы предотвратить эмбрионы от разрыва. По сравнению с клетками в нетронутых эмбрионах рисунок 4 A ; справа , клетки эмбрионов без яичной скорлупы выглядят круглее рисунок 4 C; справа. Кроме того, после изоляции бластомеров форма бластомеров становится сферической рисунок 4 D; справа. Чтобы проверить влияние физического контактозависимого сигнала на ориентацию деления клеток, мы прикрепили родамин Red-X с покрытием бусы ab blastomeres изолированы от 2-клеточной стадии и выполняется живой визуализации Рисунок 6 , Рисунок 7. Бисер без лечения родамин Красный X не придерживался бластомеров, предполагая, что родамин Red-X служит как флуоресцентный маркер и клеевой молекулы. Для анализа ориентации деления клеток, мы реконструировали покадровое изображение с помощью функции '3D-проект' ImageJ 12 рисунок 6 A ; наклон вокруг Y-оси. Чтобы определить плоскость, содержащую митотический шпиндель шпиндель плоскости , мы сначала определили плоскость, где две центросомы были вертикально выровнены Рисунок 6 B ; ' : плоскость с углом 90 'этой плоскости шпиндель плоскости Рисунок 6 B ; '. Далее, мы измерили угол шпинделя ориентация шпинделя по отношению к контактному интерфейсу клеточного бисера контактная ориентация после цитокинеза рисунок 6 C. Когда обе дочерние клетки были прикреплены к бисовосе, линия, которая проходит оба контактных участка, была использована в качестве контактной ориентации. Однако, трудно измерить внутриклеточный поток миозина, как клетка движется во время ориентированного деления. Для выполнения этого, сначала мы выбрали образцы с шпинделем выровнены к плоскости изображения xy плоскости Рисунок 7. Во-вторых, стеки были спроецированы с использованием максимального метода проекции рисунок 7. В-третьих, движения клеток были исправлены с помощью субпиксельного алгоритма регистрации Stack reg plug-in 13 of ImageJ с опцией rigid body рисунок 7 B. При регистрации изображений положение ячейки было стабильным рисунок 7 В. Согласно информации о координатах, скорости миозина вдоль оси деления и оси перпендикулярно ей были рассчитаны в пределах 50 с после начала цитокинеза. Рисунок 1: Определение концентрации родамин красно-X. A-D Эмбрионы, выражающие ГФП-миозин зеленый и мчерри-гистон пурпурный были помещены в непосредственной близости от бисера, связанного с различными концентрациями родамина Red-X magenta. Интенсивность сигнала mCherry и Родамин Red-X прокладываются вдоль белых пунктирных линий нижние графики. Шкала баров показать 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Сборка сетчатых пипеток. В конце узкой и широкой трубки Tygon, капиллярный держатель 4 и рот кусок 5 были прикреплены, соответственно. Нарисованный вручную стеклянный капилляр 6 может быть вставлен в держатель капилляра. Шкала бар 50 мм. Рисунок 3: Изоляция Бластомера. A Рука потянув из стекла капилляров. B Нарисованный вручную стеклянный капилляр для переноса эмбриона. C Нарисованный вручную стеклянный капилляр для удаления яичной скорлупы. D Схемы, показывающие соответствующий размер капиллярного отверстия для удаления яичной скорлупы. Стрелки указывают на эмбрионы. Шкала баров показать мкм. Рисунок 4: Рабочий процесс изоляции Blastomere. A Рассеивание взрослых C. Фотографии показывают 2-клеточные и 4-клеточные эмбрионы стадии до удаления яичной скорлупы. B Гипохлорит лечения и стирки. C Схемы изображают соответствующее время для удаления яичной скорлупы. Фотография показывает 4-клеточный эмбрион стадии после удаления яичной скорлупы. D Blastomere разделения. На фотографии показан разделенный 2-клеточный эмбрион. Размеры стрелок в C и D указывают на относительные силы, необходимые во время пайпеттинга. Шкала баров показать 50 мкм. Рисунок 5: Сборка камеры изображения. A Прикрепляя крышку к держателю coverslip. B Изображения держателя крышки. Держатель Coverslip до и после сборки указан слева и справа, соответственно. C Круг, нарисованный с помощью гидрофобной ручки. D Добавление среды роста Шелтона и образца в пределах круга. E Монтаж coverslip, чтобы избежать испарения. Шкала баров показать 50 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 6: Анализ ориентации деления клеток. A Диаграмма анализа ориентации деления клеток. B Определение шпинделя плоскости. На снимках слева показан пример образца. В этом примере плоскость шпинделя составляет 90 евро среднее изображение; схема правого дна. C Измерение ориентации шпинделя относительно контакта с клеточной шариком. Используя изображения шпиндельной плоскости, ориентация шпинделя после цитокинеза определялась на основе угла между линиями, соединяющими две центросомы оранжевые пунктирные линии в правой схеме и клеточном контактом синие пунктирные линии. Когда обе дочерние клетки были прикреплены к бисеру, контактная ориентация на клеточный шарик была линией, которая проходит оба контактных участка. Зеленый миозин и центросома, пурпурный - гистон и бисер. Шкала баров 10 мкм. Время минут и секунд. Рисунок 7: Анализ потока миозина. A Диаграмма анализа потока миозина. B Коррекция ориентации деления клеток. Для количественной оценки динамики потока внутриклеточного миозина, вращение разделительной ячейки было исправлено с помощью плагина ImageJ Stack reg опция rigid body. Верхние и нижние изображения — до и после обработки стек-рега. Право большинство изображений показывают временный цветовой код временных рядов. C Отслеживание фоци миозина. Используя изображения, обработанные Stack reg, отдельные движения фоци с фоцисов миосина отслеживались плагином отслеживания руководства ImageJ. Ось деления и перпендикулярная ей ось были определены как x и y, соответственно правые схемы. Скорости потока миозина в оси x и y Vx и Vy измерялись в соответствии с информацией о координатах. Восстановление упрощенных моделей контакта клеток позволит исследователям проверить роли конкретных моделей контакта клеток в различных аспектах морфогенеза. Мы использовали этот метод, чтобы показать, что ось деления клеток контролируется физическим контактом с клеевыми шариками Как спецификация оси деления имеет решающее значение для многоклеточного развития, способствуя морфогенез 14 , стволовой клетки деление 15 , 16 , и ткани гомеостаза 15 , 16 , этот метод должен быть в состоянии осветить новый механизм формирования тканей животных. В дополнение к ориентации деления клеток, этот метод имеет потенциал, чтобы быть платформой для проверки взаимосвязи между механическими сигналами и судьбой клеток. Предыдущие исследования показали, что механический кий контролирует спецификацию судьбы клеток. Мезенхимальные стволовые клетки человека дифференцируются в нейрон, адипоциты, скелетные мышечные клетки и остеобласты при культивировании в субстрате с разной жесткостью В ответ на жесткость субстрата, транскрипционные регуляторы Да-ассоциированный белок YAP и ТАЗ транскрипционный со-активатор с PD- связывающий мотив будет трансперелоспособен в ядро, чтобы регулировать спецификацию судьбы клеток Метод, представленный в настоящем документе, также должен быть полезен для проверки роли механических сигналов на спецификации судьбы клеток, путем тщательного культивирования клеток в долгосрочном контакте с клеевыми шариками. Этот метод имеет ограничения в повторении некоторых механических сигналов наблюдается in vivo. Хотя удаление яичной скорлупы не влияет на нормальное развитие, удаление как яичной скорлупы, так и барьера проницаемости приводит к ненормальному формированию шаблона При отсутствии яичной скорлупы и барьера проницаемости, форма клетки становится более сферической, что свидетельствует о том, что давление между клетками и клеточной яичной скорлупой играет важную роль в деформации клеток и узора. Действительно, ячейки ячейки сжимая силы было предложено регулировать ориентацию деления клеток Без физического ограничения и преобразительного давления среди тканей, мы ожидаем, что этот метод также не может резюмировать in vivo области контакта клеток. Как область контакта клеток, как известно, влияют Notch сигнализации 21 , это ограничение должно быть дополнительно рассмотрено, когда определенные механические или химические сигнал не работает с помощью этого метода in vitro. Мы до сих пор тестировали ориентацию деления клеток изолированных AB, P1, EMS, P2, ABa, ABp клеток клетки до 6 стадий ячейки в наших руках 10 , но метод может быть применен к более позднему развитию, насколько отдельные клетки могут быть изолированы. Недавнее одноклеточное секвенирование исследование использовало проназе пищеварения тела червя изолировать личиночных клеток Таким образом, потенциально можно использовать проназе лечения изолировать более поздние стадии эмбриональных клеток и личинок клеток. В этом исследовании, мы показали пример взаимодействия между механическим сигналом и ориентацией деления клеток, но связь клеток также опосредовано химическими сигналами, такими как Wnt 23 , Notch 24 , сливки, соединенные рецепторами 25 и так далее. Важно отметить, что представленный здесь метод приготовления бисера может соединить шарики с любыми белками, тем самым позволив восстановить химические сигналы. Предыдущие исследования также использовали Sepharose бис 26 и белок-магнитный бусин 27 покрытием с белком Wnt, чтобы продемонстрировать Wnt-зависимых процессов развития. Тем не менее, эти бусы не коммерчески доступны в различных размерах по сравнению с карбоксилат модифицированных полистирола бусы. Таким образом, будущие исследования могут использовать представленный метод в качестве платформы для проверки роли как химических, так и физических сигналов в более настраиваемых манерах. В совокупности этот метод подходит для исследователей, которые изучают клеточного поведения и реакции, которые являются результатом пространственных контактных моделей клеток и хотят устранить другие клеточные сигналы. Hsu, C. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing Взвесьте 10 мг карбоксилата модифицированных полистирола в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки. Для мытья бисера добавьте 1 мл 2- N-морфолино этансульфоновой кислоты MES буфера в трубку. Поскольку буфер МЧС не содержит фосфатов и ацетата, которые могут снизить реактивность карбодиимида, он подходит для использования в реакции сцепления белков. Вихрь трубки, чтобы смешать бисер. Спин трубки для 60 с на х г через скамейке центрифуги. Откажитесь от супернатанта, тщательно выкладывая буфер. Снова вымойте бисер 1 мл буфера МЧС, выдвив на шаг 1. Поверните и инкубировать трубку в течение 15 минут при комнатной температуре. Спин вниз бисера для 60 с на х г. Для мытья бисера добавьте 1 мл фосфатного буферного солья PBS в трубку. Спин вниз трубки для 60 с на х г. Снова вымойте бисер 1 мл PBS, выдвивая следующие шаги 1. Окончательная концентрация родамина используется будет зависеть от штамма, образуемого. Приготовьте 1 мл 1-, , и кратной раз разбавления серии родамин Красный X из 0,65 мм родамин Red-X фондового раствора. Пипетка 20 л бусин в каждую серийную продавить трубку. Поверните и инкубировать трубку в течение 5 минут при комнатной температуре. Вымойте бисер дважды 1 мл PBS, повторяя шаги 1. Проверьте интенсивность флуоресценции бисера под микроскопом, используемым для живой визуализации. Соответствующая концентрация родамин красно-X succinimidyl эфир зависит от условий изображения Рисунок 1. Родамин Red-X служит маркером флуоресценции, а также клейкой молекулы. Электростатическое взаимодействие между положительно заряженным родамином Red-X и отрицательно заряженной плазменной мембраной является податливой причиной спайки. Сборка устья пипетки Вырезать широкий 6,35 мм внутреннего диаметра и узкие 3, мм внутреннего диаметра Тайгон труб около 25 см и 40 см в длину, соответственно Рисунок 2. Разберите коммерчески доступную трубку аспиратора и прикрепите ее капиллярный держатель и мундштук к концу узких и широких труб Тайгона, соответственно рисунок 2. Держите каждый конец микрокапилляра емкость; 10 л правой и левой рукой. Потяните микрокапилляр к обоим концам, чтобы применить напряжение и принести центр капилляра над горелкой, чтобы сделать два ручной вытягивания капилляров Рисунок 3 A. Обрезать кончики ручных капилляров щипцами под рассекающим сядр и прикрепите вытянутый капилляр в ротовой аппарат рисунок 2. Подготовьте два типа пипетков. Размеры наконечника для пипетки должны быть примерно в 2 раза и 1x короткая длина оси C. Пипетка 45 л раствора яичной соли на скважину многовелл-слайда рисунок 4 A; дно. Поместите взрослых C. Чтобы получить ранние эмбрионы C. Пипетка 45 Л гипохлоритного раствора на скважину рядом с хорошо содержащим раствор яичной соли рисунок 4 В. Пипетка 45 л среды роста Шелтона на последующие три скважины рядом с хорошо содержащим гипохлоритный раствор рисунок 4 B. Передача 1-клеточной стадии и ранних 2-клеточных эмбрионов стадии в гипохлоритный раствор с помощью ротовой трубы с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона рисунок 4 В. Подождите с. Вымойте эмбрионы путем передачи эмбрионов из гипохлоритного раствора в среду роста Шелтона с помощью ротовой трубы с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона рисунок 4 В. Вымойте эмбрионы снова путем передачи эмбрионов в новый колодец шелтона роста среды рот пипеттинг с рисованной капиллярдля для переноса эмбриона Рисунок 4 B. Перенесите вымытые эмбрионы в новый колодец среды роста Шелтона с помощью ротовой трубы с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона. Используя нарисованный вручную капилляр для удаления яичной скорлупы, тщательно повторите пипетку рисунок 4 C; средние схемы. Если яичная скорлупа будет успешно удалена, эмбриональные клетки станут более сферическими рисунок 4 C; справа. Отделить 2-клеточный этап эмбриональных бластомеров мягко и непрерывно pipetting с рисованной капиллярдля для удаления яичной скорлупы Рисунок 4 D. Для наблюдения с помощью перевернутого микроскопа подготовьте камеру изображения, как на рисунке 5. Поместите крышку на держатель для обкрытии рисунок 5 A. Лента края крышки, чтобы стабилизировать его. Сторона с лентой является 'назад' стороны рисунок 5 A,B. Добавить среды роста Шелтона в круге обращается гидрофобный маркер Рисунок 5 D. Перенесите изолированные бластомеры в камеру изображения. Распределите небольшой объем химически функционированных бусин с использованием нарисованного от руки капилляра для переноса эмбриона. Контролируйте положение полистирола, дуя в нарисованный от руки капилляр до тех пор, пока шарик не прикрепится к изолированному бластомере. Установите крышку, чтобы избежать испарения среды рисунок 5 E. Выполните живую визуализацию. Избегая пакетных вариаций хитиназа, мы считаем, что этот метод является более воспроизводимым и рентабельным. Автоклав для растворения. Отрегулируйте рН до 6. Довести общий объем до мл с dH 2 O. Хранить в течение 1 месяца при 4 градусах По Цельсию. Добавьте 2 мл диметилсульфида DMSO для растворения. Aliquot и хранить при градусах по Цельсию. Средний рост Шелтона SGM Aliquot Л SGM в микротрубках 1,5 мл. FBS не нужно быть тепло убитым. Play Video. Cite this Article Hsu, C. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close. For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. Dissecting microscope: Zeiss Stemi with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. System was controlled by Slidebook 6.

Лондон бесплатные пробы Соль, альфа pvp