Кокаин бесплатные пробы Тропея

≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡

≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡

▼▼ ▼▼ ▼▼ ▼▼ ▼▼ ▼▼ ▼▼ ▼▼ ▼▼

Наши контакты (Telegram):☎ ✍ ⇓

>>>✅(НАПИСАТЬ НАМ В ТЕЛЕГРАМ)✅<<<

▲▲ ▲▲ ▲▲ ▲▲ ▲▲ ▲▲ ▲▲ ▲▲ ▲▲

≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡

⛔ ✔✔ ВНИМАНИЕ!

❎ 📍 ИСПОЛЬЗУЙТЕ ВПН, ЕСЛИ ССЫЛКА НЕ ОТКРЫВАЕТСЯ!

❎ 📍 В Телеграм переходить только по ССЫЛКЕ что ВЫШЕ! В поиске НАС НЕТ там только фейки!

≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡

Кокаин бесплатные пробы Тропея

✔✔ 📍 Гарантии и Отзывы!

✔✔ 📍 Работаем честно!

≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡

Кокаин бесплатные пробы Тропея

Купить закладку наркотиков Дананг – Telegraph

Кодирование опытом в головном мозге и консолидации долгосрочной памяти зависит от транскрипции генов. Определение функции специфических генов в опыте кодирования является одним из основных задач молекулярной нейробиологии. Кроме того, функциональная ассоциация определенных генов с конкретными поведения имеет значение для понимания основ нервно-психических расстройств. Индукционная надежных программ транскрипции наблюдалось в мозге мышей следующих различные поведенческие манипуляции. В то время как некоторые генетические элементы используются периодически следующих различных поведенческих манипуляций и в различных ядер головного мозга, транскрипционные программы в целом уникальным для индуцирующих стимулов и структуры, в котором они изучаются 1,2. В этой публикации, протокол описан для надежной и всеобъемлющей транскрипции профилирования из мозга зародышей мышей в ответ на манипуляции поведенческих. Протокол продемонстрирована в контексте анализа динамики экспрессии генов в прилежащем ядре после острого опыт кокаина. После определено в естественных условиях опыта, целевой нервной ткани рассекают; с последующей очисткой РНК, обратная транскрипция и использования микрофлюидных массивов для комплексного КПЦР анализа нескольких генов-мишеней. Протокол является наиболее выгодным для параллельного анализа нескольких образцов например одиночных клеток, динамического анализа следующей фармацевтической, вирусной или поведенческих возмущений. Тем не менее, протокол также мог бы служить для характеризации и контроля качества образцов до целого генома исследованиях микрочипов или RNAseq, а также проверка данных, полученных из цельного исследований генома. Динамичной организацией мозгом позволяет когнитивные и поведенческие гибкость. Опыт кодируются путем изменения структуры и прочности связей между нейронами в мозге 3. Это 'опыт-зависимой пластичности' является результатом индукции специфических форм генной экспрессии, что обеспечивает необходимые белки для модификации синаптической структуре и прочности 4. Идентификация генов регуляторных сетей посредником образование долгосрочной памяти является центральным принципом молекулярной нейробиологии, с ожиданием, что идентификация доминирующих элементов транскрипционных программ обеспечит понимание основных принципов, регулирующих формирование памяти, а также целевые показатели для лечение нейродегенеративных и психоневрологических расстройств. Транскрипции программы развернется в временно-определенных волн, каждая из которых кодирует гены разного характера, которые важны для гifferent этапы реализации исхода данного события сигнализации 1,2. Поэтому важно, чтобы обратиться транскрипционные динамику на детальном временном масштабе времени, с тем чтобы определить полный набор генов, индуцированных, и разобраться в их потенциальной функции в соответствии с динамикой их индукции. Наркомания является надежной формой зависящей от опыта пластичности, вызванного долговременными последствиями злоупотреблением наркотиками на нейронных цепей в мозгу 5,6. Начальное, острое воздействие препаратов может привести к развитию наркомании и переход к хроническим использования. Контекстной информации является ключевым элементом в развитии наркомании. Связанных с наркотиками средовые сигналы назначаются важное значение в сознании наркоманов. Контекстная информация напоминая наркоманом прошлого опыта наркотиков может вызывать рецидив к наркотиков тягу даже после длительных периодов воздержания от наркотиков воздействия 7,8. Поэтому великий клинической проблемой в зависимости - склонность наркоманов к рецидиву даже долгое время после снятия симптомов убыль 9. Поведенческая сенсибилизация к кокаину является простая модель кокаина опыта полезной при изучении механизмов наркомании. В этом широко изученной модели для длительной сенсибилизации, вызванной хроническим воздействием наркотиков, вызывающих зависимость, грызуны сначала приучали к засоленных инъекций внутрибрюшинными; IP в новой среде открытой полевой камеры, в которой их двигательную активность контролируется ; Затем, они получают ежедневные инъекции кокаина в камерах открытом пространстве в то время как их деятельность контролируется 10 рисунок 1. Это поведенческая парадигма обычно приводит в прочном сенсибилизации поведения опорно-двигательного раз выше базовой деятельности 11, который ведется в течение нескольких месяцев после прекращения приема кокаина инъекций, демонстрируя образование извращенецasive след памяти опыта наркотиков. Нейронная схема вознаграждения, естественно участие в укреплении поведения, необходимые для успеха того или иного вида например, подачи, секс , эксплуатируется злоупотреблением наркотиками укрепления наркотиками связаны с поведением 12, Молекулярные и клеточные механизмы, с помощью которых опыт злоупотреблением наркотиками усиливается, кажется, похожи на механизмы, лежащие образование декларативных или семантических воспоминаний в других структурах мозга Таким образом, надежность поведенческой модели сенсибилизации делает его привлекательным модельную систему для изучения механизмов зависящей от опыта пластичности. Прилежащем ядре NAC является центральным интегратор награду схемы мозга, и была широко ассоциируется с развитием наркомании 5,6. Формирование наркомании зависит от транскрипции новых белков в прилежащем ядре, и надежная вводство четко структурированных программ транскрипции наблюдается в NAc следующие кокаина опыта Острая транскрипции ответ на воздействия кокаина, вероятно, работать на нескольких уровнях для того, чтобы адаптироваться к сильной индукции стимула и направить производство новых белков, которые несут ответственность за структурные и электрофизиологических изменений, вызванных воздействием препарата 6, В целях содействия изучению молекулярных механизмов зависящей от опыта пластичности в мозге, протокол описывается для всестороннего анализа динамики транскрипции в пробах мозговой ткани следующем поведенческой манипуляции. Протокол иллюстрируется в контексте поведенческой опыта исследуемой в лаборатории Citri - поведенческой чувствительности к кокаину, используя микрофлюидных динамические массивы для транскрипции анализа. Протокол описано, очевидно, не ограничивается изучением тОн прилежащем ядре в контексте поведенческой сенсибилизации, но может быть применен к большому числу поведенческих парадигм и областей головного мозга. В самом деле, этот протокол может быть применен к ткани тела вне мозга, а также различные опыте или манипуляций организма изучены. Протокол грубо разделить на четыре стадии. На первом этапе, животное подвергают поведенческой парадигмы; на втором этапе ткань микродиссекции; на третьем этапе - мРНК очищенная, обратной транскрипции и зондируют, и на конечной стадии данные анализируются. В контексте изучения транскрипционных динамику, точные сроки и определение опыта, вероятно, наиболее важные экспериментальные параметры для управления. По этой причине, наша модель поведения выбора является то, что поведенческой чувствительности к кокаину, системы, которая обеспечивает высокую степень контроля над экспериментатора параметров experienсе. Дополнительные поведенческие парадигмы, которые позволяют точное время и решению различных моделей зависящей от опыта пластичности или формирования памяти доступны. Эти модели включают страх кондиционирование 23, острый экологической обогащения 24,25, по исследованию объекта роман 26 и визуальный опыт следующую темной воспитания Тем не менее, поведенческая сенсибилизация к кокаину является последовательно надежный поведенческая манипуляции, создавая весьма распространенной след памяти, которая длится в течение нескольких месяцев после кокаина опыт Мозг подразделяется последующим ручным микродиссекции прилежащем ядре. Это был наш опыт, что руководство микродиссекции от быстро подготовленных срезах мозга обеспечивает самый надежный и быстрый метод извлечения ткани, необходимой для поведенческой парадигмы, и с опытом, границы ткани становится очевидной и легко распознаваться. Кроме того, тонкие ломтики может быть ДГОред, затем лазер-захвата микродиссекции. Хотя этот метод позволяет высоко определяется разграничение интересующей области, это очень медленный процесс что может привести к потере лабильного мРНК , утомительно и требует дорогостоящего специализированное оборудование микроскоп, оснащенный лазерной установки захвата. Протокол определено здесь также может быть адаптирована к одноклеточного транскрипции анализа, ручной аспирации цитоплазме визуально выявленных клеток с использованием патч пипетки Важно отметить, что протокол, описанный обеспечивает среднем населения, в то время как весьма вероятно, что в большинстве случаев, только субпопуляции клеток в ткани на самом деле участвует в борьбе с опытом. Представляет интерес к профилю транскрипцию выборочно, изнутри конкретных клеточных популяций, принявших участие в опыте, но обсуждение этих подходов выходит за текущей области. Для очистки мРНК, с обратной транскрипцией и КПЦР Запросы, тканинарушается, пропуская ее через тонкие иглы, с последующим использованием коммерчески доступных наборов для получения дополнительной информации, табл 8. Выбор сообщается опытом с этих методологий, обеспечивающих надежную экстракцию высокой РНК качества и надежных результатов последующих применений. Хотя протокол описан для высокой пропускной кПЦР используя динамические массивы, образцы могут быть проверены экспрессии генов с помощью конечной точки ПЦР, с низкой пропускной КПЦР, генные микрочипы выражения или глубоко секвенирования. Предпочтение высокой пропускной КПЦР с использованием динамических массивов связано с тем, что мРНК, полученной из ядер головного мозга следующие поведенческие парадигмы часто предельных величин. Динамические массивы обеспечить платформу, которая позволяет эффективно всесторонний анализ транскриптов из большого количества параллельных образцов в одном эксперименте. После первоначального приобретения микрожидкостной системы обычно институциональной о. После этого анализа, дальнейшее Запрос образцов может быть выполнена с использованием более дорогостоящих платформ для поиска новых транскриптов на микрочипов или RNAseq с динамические массивы предоставление всеобъемлющей информации для обеспечения качества. Наконец, для анализа данных, стандартные методы используются. Конкретные указатели, касающиеся вопросов, которые могут возникнуть, будут обсуждены в тексте протокола. Этот протокол является наиболее подходящим для следователей, заинтересованных в тщательного расследования их системы интересов, обучающихся несколько условий и повторов. Протокол также наиболее подходящий для следователей, которые уже отточенные в через микрочипов или RNAseq экспериментов на подмножестве интересующих генов, которые они заинтересованы в запросе неоднократно. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Оборудование для мониторинга кокаина вызванной поведения опорно-двигательного состоит из поведения камер 50 х 45 см проводных с внутренним источником света, вентилятором и камеры или инфракрасных датчиков , и оснащены внутренней коробке плексигласа 30 х 30 см в которые мышей свободно перемещаться в то время как их передвижение отслеживается. Животные должны быть обучены последовательно, в то же время каждый день. Качество результатов, полученных с применением этого протокола в решающей степени зависит от ряда параметров. Правильное экспериментальная планирования приведет к минимальным вмешательством в жизнь подопытных мышей, так что испытания опыт в этом примере, что из воздействия кокаина будет самым доминирующим опыт в своей недавней истории, и, следовательно, приведет к надежной и определенной транскрипции Программа. Рисунок 1 описывает экспериментальную план поведенческой сенсибилизации к кокаину, определяя моменты времени после кокаина опыт, при котором прилежащем ядре рассекается от мышей и проанализированы. Следующий важный момент заключается в определении точных границ для удаления надлежащего ткани для анализа. Рисунок 2 описывает границы прилежащего ядра в корональных и сагиттальных срезов. Предпочтительно, чтобы рассечение должна быть выполнена таким образом, что тонкий край НАК ткани исключается из области Takан для профилирования. Это обеспечивает последовательное профилирование только НАК, снижение изменчивости и потенциал для артефактов, связанных с включением окружающие ткани. При амплификации ограничение количества РНК, как и в рассечения небольших ядер головного мозга, многие циклов амплификации необходимы для правильного обнаружения сигнала. Поэтому важным моментом в любой количественной ПЦР эксперимента, дополнительно усиливается при работе с небольшими количествами исходного материала, является характеристика праймеров, используемых для амплификации. После проверки праймера и создание надлежащего экспериментальной парадигмы включить четкую оценку транскрипции от целевых TISSие, всесторонний анализ может быть выполнена на платформе Fluidigm Biomark, что позволяет до параллельных реакций КПЦР в формате 96,96, рисунок 5. Это высокой пропускной платформа позволяет параллельный анализ нескольких экспериментальных повторений, с использованием идентичных условий эксперимента на одном кристалле. Данные для четырехместных экспериментальных повторений, обращаясь к индукции транскрипции с-Fos и FosB после острого опыт кокаина, демонстрируются на рисунке 6. А Экспериментальный протокол - мышей приучали к обработке и инъекции в течение 3 дней, в то время мониторинга двигательную активность путем отслеживания видео в звукопоглощающий поведение камеры. Транскрипционные динамика обращены в разные моменты времени экспериментальных следующих кокаина опыта 1, 2, 4, 8, 24 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2. Местонахождение прилежащем ядре мозга мыши. B ветви. Фотографии взято из Аллен мозга Атлас Справочный атлас Изображения:. Рисунок 3. Планирование КПЦР праймеров. Руководящие принципы для планирования КПЦР праймеров, с определениями для Специфичность, стабильность и совместимость. Рисунок 4 Оценка грунтовки эффективности. Стандартную кривую получали с использованием семи последовательных 3-кратных разведений общей РНК, извлеченной из мыши NAc и зондировали на экспрессию Fos и FosB. В Эффективность пары праймеров для Fos и FosB оценивали путем построения пороговое значение цикла Ct на каждом разведении против логарифма кратного разведения образца. Эффективность праймеров рассчитаны из наклона калибровочной кривой, как это определено в тексте. Кривые амплификации и точки на кривой разведения являются по цвету. Праймеры загружаются в впускных отверстий, расположенных в правой стороне, и образцы загружают в впускных отверстий, расположенных в левой стороне чипа. Эта цифра была изменена с разрешения Fluidigm ПЦР в реальном времени анализа руководстве пользователя. Кокаин-индуцированной экспрессии с-Fos и FosB отображаются в виде функции времени. Средние значения четырехместные экспериментальных повторений, выполненных в соответствии с протоколом, определенным в настоящем документе, отображаются вместе с барами об ошибках, изображающих стандартную ошибку среднего. Таблица 4 Тепловой режим цикла для предварительной амплификации. Успешное характеристика экспрессии генов из мозговой ткани следующие поведенческие парадигмы зависит от: 1 осторожного обращения мышей во время поведенческой парадигмы; 2 Быстрая и точная рассечение ткани интересов; 3 РНК-сейф меры для обеспечения целостности РНК; и 4 Тщательное планирование праймеров и экспериментальной макета, а также точность и внимание к деталям в ходе подготовки к анализу КПЦР. Цель с процедурой, описанной в характеризовать динамику транскрипционных событий, индуцированных поведенческого опыта; Поэтому, особое внимание необходимо для того, чтобы гарантировать, что поведенческая парадигма испытывали с помощью мыши, действительно представляет собой опыт, предназначенный исследователем. Каждый из этих переживаний может, в изоляции, способствовать индукцию транскрипции программ в различных областях мозга мыши. Поэтому необходимо позаботиться, чтобы убедиться, что транскрипционный программа измеряет нужный парадигму, а не эпифеноменами связаны с парадигмой. В случае опыта кокаина, это легко достигнуто путем тщательных экспериментов и вниманием к деталям, а также простого контрольного эксперимента, в котором все параметры поддерживаются постоянными, а транспортного средства физиологического раствора вводят в мыши, а не кокаин. По нашему опыту, физиологический раствор для инъекций вызывает транскрипционный программу очень ограниченных масштабах по сравнению сЭкспозиция кокаин, демонстрируя, что парадигма подавляющем позволяет расследование явлений, представляющих интерес. Предельное внимание следует ограничить спектр переживаний мыши в то время как он все еще активен, требуя спокойную и бережного обращения из мышей. В отличие от этого, следуя анестезии, быстрая и точная работа имеет важное значение в связи с потенциалом для быстрых изменений в представлении РНК на шкале времени минут и внутренней лабильности РНК, которые могли бы быть быстро разлагается, как только клетки разрушают, потенциально нарушая транскрипции профиля, вызванное опытом. Поэтому важно, чтобы извлечь мозг из черепа быстро охлажденной среде в пределах мин и быстро рассекают НАК в ледяных условиях. Как только мозг был охлажден, потенциал для транскрипционных изменений или деградации РНК значительно сокращаются, но только тогда, когда соответствующие разделы размещены в TRIzol реагента и замораживают, яс целостность ткани и представление транскрипции профиль обеспечена. В этом контексте, стоит отметить, что транскрипционные динамика выражения непосредственной-начале гена происходит на быстром масштабе времени, часто достигая максимума до 1 ч после стимуляции. В контексте описанной экспериментальной парадигмы, опрос транскрипции динамики ограничивается масштабе часов, чтобы уменьшить вариабельность между образцами. Для раз короче, чем 1 час, небольшие изменения в сроках может привести к большой вариации в величине транскрипционных изменений, наблюдаемых. Таким образом, момент времени 1 час был выбран для анализа, так как на этот раз Дело в том, экспериментально легче выполнить с точностью, и менее подвержен изменению на уровне разницей в несколько минут эксперимента. Традиционно, ткани micropunch был использован многими лабораториями для вскрытия проб тканей. Тамряд причин, предпочитают ручной микродиссекции ткани. Пуансон, как правило, изготовлены из нержавеющей стали и не является прозрачной. Поэтому позиционирование удар точным и последовательным расположением может быть сложнее. Кроме того, удар не позволяет любое исправление быть сделаны, если была ошибка в первоначальном позиционировании. Наконец, добыча ткани изнутри удар может иногда оказаться хитрым, и есть потенциал для потери ткани, или перенос между образцами. Микродиссекция ткани с помощью тонкой скальпель позволяет экспери- ментаторам более точное управление и обеспечивает безопасность в отношении чистоты образцов. Во время экстракции РНК и вплоть до синтеза кДНК, рабочая среда должна быть от источников РНКазных загрязнений бесплатно, и работа должна быть выполнена с использованием РНКазы бесплатные инструменты, одноразовые и реагентов. На этом этапе, самый маленький загрязнения могут легко поврежден кровные образцов РНК. Ведение образцы яCE холодным имеет решающее значение для сведения к минимуму нейронной активности, которые могут модифицировать транскрипции считывания, а также свести к минимуму ферментативную активность, что может повлиять на целостность образца. Дополнительные фармакологические ингибиторы иногда добавляют для снижения нейронной возбудимости, но часто они не являются существенными. После обратной транскрипции в кДНК, акцент превращается в обеспечении достоверности результатов, полученных от полной профилирования транскриптов. Первый шаг заключается в обеспечении надлежащих праймеры КПЦР используются, для которых она настоятельно рекомендуется проверить праймера эффективность и специфичность на кривых разбавления определенного источника РНК. Оптимальные ПЦР-праймеры предоставить конкретную и эффективную амплификацию мишени. В связи с высокой пропускной способностью природы микрофлюидных чипов КПЦР, эти эксперименты требуют тщательного планирования, чтобы обеспечить включение значительного числа положительных и отрицательных контролей. Желательно включить последовательные элементы управления в каждом чипе перспективе, что позволяет прямое сравнение результатов контрольных и экспериментальных условиях. Во время установки эксперимента, важно, чтобы не заражать скважин. Поскольку небольшое количество праймеров в неправильном скважины может привести усиление нежелательных цели, дополнительная забота должна быть взята, пипетки праймеров. Для большинства образцов ткани из мозга трудно быть уверенным, что во время вскрытия только ткань интерес экстрагировали, без загрязнения неактуальных областях мозга, которые могли бы посрамить анализ результатов. Для этого, важным управления зондирования генов выражение, как ожидается, будет исключен изткань интерес. Хотя подробное обсуждение анализа данных выходит за рамки данной публикации, следует отметить, что тщательное гарантирует экспериментирование тщательного анализа. Важно убедиться, что ряд соответствующих справочных генов включены в каждом раунде кПЦР. Эти гены будут служить для нормализации для того, чтобы гарантировать, что аналогичные количества РНК анализировали в настоящее время. Тем не менее, это очень легко Adapteг для изучения любого другого опыта мыши, пока надлежащего контроля реализуются, а также сроки опыта корректно определено. Очевидно, что этот протокол также может быть реализован для изучения динамики транскрипции в тканях за пределами нервной системы, а также. Следует подчеркнуть, что всестороннее транскрипции профилирования используют Микрожидкостных основе КПЦР является экономически эффективным методом профилирования транскрипционные события, но зависит от предварительного знания генов-мишеней, представляющих интерес. Они обычно получают через объективных методов профилирования, таких как микрочипы и глубокого секвенирования. Таким образом, в рабочем процессе большого проекта, комплексное КПЦР профилирование может обеспечить большую часть данных, но преимущественно должны следовать предварительного объективную характеристику системы. Стоит также о том, что процесс, описанный в данном документе для получения образцов ткани также может быть реализован в сторону исследованиячисле множество других клеточных событий - протеомики и модификаций белков, метаболомики, lipidomics и эпигенетических. Turm, H. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Behavior. Перед началом эксперимента, взвесить мышей и регистрировать данные. Кокаин позже вводили в соответствии с массой тела мышей. Перенесите все клетки, содержащие мышей в поведенческих комната 30 мин до начала первого судебного разбирательства. Приучить всемышей в эксперименте, чтобы экспериментатор обработки, инъекции и мониторинга в настройках поведения. Это достигается за счет 3 последовательных ежедневных внутрибрюшинных инъекций мкл физиологического раствора, как описано ниже. Администрирование внутрибрюшинно инъекцию мкл физиологического раствора. Сразу же после инъекции, поместить курсор в поведении камеры, чтобы контролировать двигательную активность в течение 15 мин. Повторите это действие в течение 3 дней подряд, в тот же час каждый день. На четвертый день, разделить мышей на две группы. Администрирование физиологический раствор с контрольной группой. Сразу же после инъекции, поместите курсор в течение 20 мин в поведении камеры для мониторинга двигательной активности Typicсоюзник, первые 15 мин контролируются. После инъекции кокаина, пожертвовать мышей в различные моменты времени 0, 1, 2, 4, 8 и 24 ч после инъекции. Важно отметить, что убедиться, что ссылки мышей 0 момент времени не будет получать инъекции в этот день. С учетом его важности, необходимо включить повторов контрольной группы. ИФ должны быть непосредственно вентилируемые из комнаты. Таким образом, процедура должна быть выполнена в химическом вытяжном шкафу. Мониторинг глубины анестезии путем тестирования заднюю ножку рефлекс. Зажмите лапу, чтобы вызвать реакцию Изъятие животного. Животное, которое показывает рефлекс не при хирургической уровня анестезии и не в состояние усыпить. Добыча мозга: Усыпить мыши путем обезглавливания. Вставьте ножницы в точке, где спинной мозг поступает в мозг затылочного отверстия и сделать два боковых порезов. С той же точки, чтобы длинный сагиттальной разрез вдоль стреловидного шва. По достижении обонятельной луковицы, клип влево и вправо. С пинцетом удалите череп тщательно, захватывая каждую половину черепа твердо и потянув в сторону, стараясь не нажимать на или повредить мозг. Снимите мозг в то время разрыва черепные нервы с помощью перевернутой микро ложку шпателем. Поместите мозг в растворе ACSF ледяной в течение мин, чтобы охладить и затвердевают. Удалить мозг от ACSF, фитиль избыток жидкости с бумажным полотенцем, создать корональной разрез между мозжечка и остальной части головного мозга и клей мозг, с ростральной части вверх, на этапе vibratome. Раздел на мкм до прилежащем ядре НАК четко определены в соответствии с Paxinos и Франклина мозга мыши Атлас примерно 1,8 мм впереди брегмы; обратить внимание на форму мозолистого тела, расположения и формы передней спайки и желудочки, а также в целом морфология секции мозга. В этот момент создания двух секций мкм, из которых НАК будет разрезать. Под стереоскоп, использовать тонкую лезвие рассекать область НАК из ломтиков. Определение НАК по атласу мозга мыши Paxinos и Франклин, и может быть легко рассекают в соответствующих разделах на четыре быстрых проходов лопатки на ткани. Первые несколько патронов трудно, и требуют нажатия ткани по отношению к стенке трубы, чтобы разорвать его на мелкие кусочки, которые могут войти в кончик иглы. Для обеспечения гомогенизации, пипетки лизата в QIAshredder мини колонке спина и центрифуге при мкг в течение 1 мин. Внесите лизат в новой трубки микроцентрифужных и извлечь РНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Измерьте концентрацию РНК, анализировать целостность и качество, используя Bioanalyzer или эквивалентную оборудование. Избегайте нуклеотидные повторы так как они способствуют ошибочного праймирования. Знайте, что размер продукта в идеале должен быть между 80 и б. Убедитесь, что по крайней мере один из праймеров охватывает экзон-экзон соединение или ампликона содержит большое интрон интрон-охватывая , чтобы избежать амплификации геномной ДНК загрязнений. С помощью надежного программного обеспечения на основе Primer3 примеры таблица 2 , чтобы улучшить дизайн праймера. Включите контроль не-шаблона, который контролирует загрязнения в пределах решений, используемых для реакции. Определить специфику усиления. Удельный усиления демонстрируется одного видного пика, общей для всех кривых плавления амплифицированных продуктов, в то время как мимо цели усиления будет выглядеть как явная предвзятость фром один большой пик. Таким образом, этап предварительной амплификации имеет важное значение. На этом этапе, кДНК проходит циклов предварительной амплификации смесью всех праймеров, которые будут использоваться для запроса образца в будущем до пар праймеров. Бассейн вместе 1 мкл аликвоты все 50 мкМ праймера устанавливает которые должны быть включены в реакции STA, до анализов. Готовят премикс и образцы для STA, как описано в таблице 3. Алиготе 3,75 мкл STA премикс для каждого образца. Добавить 1,25 мклкДНК друг. Vortex смешивать реакции и центрифуги в течение 10 сек. Поместите реакции STA в термоциклере и цикла, как указано в таблице 4. Экзонуклеаза я ExoI лечение: Развести экзо I, как указано в таблице 5. Развести конечные продукты до соответствующей концентрации для тестирования. Грунтовка и настройка образца для количественной ПЦР: Подготовка образцов, как показано в таблице 6. Готовят смесь в соответствии с чипом, выбранной для эксперимента, и добавить при необходимости образцы. Подготовка пробы, как описано в таблице 7. Невыполнение этого требования может привести к снижению качества данных. Примечание: конечная концентрация каждого праймера 5 мкм на входе и нМ в конечном реакции. Грунтовка и загрузка динамического массива IFC интегрированный жидкостный контур чип. Чип МФК имеет входы для проб и анализов, а также указанные входы аккумуляторы для контроля линии жидкости минеральное масло , используемой для создания давления Микрожидкостных камеры FIGU Re 4А. Введите контрольной линии жидкости в каждом аккумуляторе на чипе. Удаляют синий защитную пленку с нижней части чипа. Когда сценарий закончил, удалить загрунтованную чип от контроллера МФК. Внесите 5 мкл каждого смеси для анализа и 5 мкл каждого образца смеси в их входные отверстия. Вернуться чип контроллера МФК. Когда сценарий нагрузки Mix закончил, снять нагрузкучип-е изд от контроллера МФК. Загрузите чип на термоциклер, создать новый чипу работать в соответствии с директивами производителя , в том числе анализа кривой плавления. Использование программного обеспечения термоциклер, убедитесь, что реакционные камеры признаются должным образом, и оставляют реакционную выполняться до завершения. Анализ 8. Монитор специфичность амплификации путем просмотра кривых плавления ампликонов, пики, которые должны оптимально быть плотно выровнены Визуализация: Для визуализации больших объемов данных, полученных с высокой пропускной кПЦР, использование программного обеспечения генерируется HeatMaps, в котором выражение цветом в зависимости от интенсивности. Кроме того, отображение транскрипции динамику отдельных генов как выстроились разброс участков. Публикация: В публикациирезультаты экспрессии генов, то рекомендуется следовать Руководству MIQE для публикации количественных ПЦР в реальном времени экспериментов, подробно минимальную информацию, что должно быть сообщено в течение эксперимента КПЦР для обеспечения ее актуальности, точности, правильной интерпретации и воспроизводимость. Play Video. Cite this Article Turm, H. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close.

Мефедрон наркотик Мумбаи Индия

Кокаин бесплатные пробы Тропея

Баа Атолл купить Меф, Ск