Кинетика ферментативных реакций - Биология и естествознание курсовая работа

Главная

Биология и естествознание
Кинетика ферментативных реакций

Природа константы К в уравнении. Преобразование уравнения Михаэлиса-Ментен. Влияние концентрации субстрата на кинетику реакции, образование устойчивого комплекса. Факторы, от которых зависит скорость ферментативной реакции, устройства для их определения.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.


Основу жизнедеятельности любого организма составляют химические процессы. Практически все реакции в живом организме протекают с участием природных биокатализаторов - ферментов.
Берцелиус в 1835 г. впервые предположил, что реакции живого организма осуществляются благодаря новой силе, которую он назвал «каталитической». Эту идею он обосновал главным образом экспериментальным наблюдением: диастаза из картофеля гидролизует крахмал быстрее, чем серная кислота. Уже в 1878 г. Куне назвал вещество, обладающее каталитической силой в живом организме, ферментом.
Кинетика действия ферментов - это раздел ферментологии, изучающий зависимость скорости реакции, катализируемой ферментами, от химической природы и условий взаимодействия субстрата с ферментом, а также от факторов среды. Иначе говоря, кинетика ферментов позволяет понять природу молекулярных механизмов действия факторов, влияющих на скорость ферментативного катализа. Этот раздел образовался на стыке таких наук, как биохимия, физика и математика. Самая ранняя попытка математически описать ферментативные реакции была предпринята Дюкло в 1898 г.
На самом деле этот раздел по изучению ферментов очень важен в наше время, а именно для практической медицины. Он даёт фармакологам инструмент направленного изменения метаболизма клетки, огромное количество фармацевтических препаратов и различные яды - это ингибиторы ферментов.
Целью данной работы является рассмотрение вопроса о зависимости скорости реакции от различных факторов, каким образом можно контролировать скорость реакций и как её можно определить.
Предварительные эксперименты по изучению кинетики ферментативных реакций показали, что скорость реакции , вопреки теоретическим ожиданиям, не зависит от концентрации фермента (Е) и субстрата (S) таким образом, как в случае обычной реакции второго порядка.
Браун и независимо от него Анри впервые выдвинули гипотезу об образовании в ходе реакции фермент-субстратного комплекса. Затем это предположение подтвердили три экспериментальных факта:
а) папаин образовывал нерастворимое соединение с фибрином (Вюртц, 1880);
б) субстрат инвертазы сахароза могла защищать фермент от тепловой денатурации (О'Салливан и Томпсон, 1890);
в) было показано, что ферменты являются стереохимически специфическими катализаторами (Фишер, 1898-1899).
В 1913 г. Михаэлис и Ментен опубликовали свою теорию общего механизма ферментативных реакций:
Они ввели понятие максимальной скорости и показали, что кривая насыщения (т.е. зависимость скорости реакции от концентрации субстрата) является равнобочной гиперболой. Они доказали, что максимально наблюдаемая скорость есть одна из асимптот к кривой, а отрезок, отсекаемый на оси абсцисс (в области ее отрицательных значений) второй асимптотой, т.е. константа в уравнении скорости, равен по абсолютному значению концентрации субстрата, необходимой для достижения половины максимальной скорости. [2]
Михаэлис и Ментен предположили, что скорость реакции определяется распадом комплекса ES, т.е. константой k 2 . Это возможно только при условии, что k 2 - наименьшая из констант скорости. В этом случае равновесие между фермент-субстратным комплексом, свободным ферментом и субстратом устанавливается быстро по сравнению со скоростью реакции (быстро устанавливающееся равновесие).
Начальную скорость реакции можно выразить следующей формулой:
Поскольку константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна
то концентрацию свободного фермента можно выразить как
Общая концентрация фермента в реакционной смеси определяется формулой
[Е] т = [Е] + [ЕS] = K S [ЕS] / [S] + [ЕS]
Реакция достигает максимальной скорости, когда концентрация субстрата достаточно высока, чтобы все молекулы фермента находились в виде комплекса ЕS (бесконечно большой избыток субстрата). Отношение начальной скорости к теоретически возможной максимальной скорости равно отношению [ЕS] к [Е] т :
v / V max = [ES] / [E] т = [ES] / (K S [ES] / [S] + [ES]) = 1 / (K S +[S] +1)
Это классическое уравнение Михаэлиса и Ментен, которое со времени его публикации в 1913 г. стало фундаментальным принципом всех кинетических исследований ферментов в течение десятилетий и с некоторыми ограничениями осталось таким до сих пор. [5]
Позднее было показано, что оригинальное уравнение Михаэлиса - Ментен предполагало наличие нескольких ограничений. Оно справедливо, т.е. правильно описывает кинетику реакции, катализируемой данным ферментом, только при условии выполнения всех следующих ограничительных условий:
1) образуется кинетически устойчивый фермент-субстратный комплекс;
2) константа K S является константой диссоциации фермент-субстратного комплекса: это справедливо, только если ;
3) концентрация субстрата не меняется в ходе реакции, т.е. концентрация свободного субстрата равна его начальной концентрации;
4) продукт реакции быстро отщепляется от фермента, т.е. не образуется кинетически значимого количества ЕS комплекса;
5) вторая стадия реакции необратима; точнее говоря, мы принимаем во внимание только начальную скорость, когда обратной реакцией (из-за фактического отсутствия продукта) еще можно пренебречь;
6) с каждым активным центром фермента связывается только одна молекула субстрата;
7) для всех реагирующих веществ вместо активностей можно использовать их концентрации. [2]
Уравнение Михаэлиса - Ментен служит отправной точкой при любом количественном описании действия ферментов. Следует подчеркнуть, что кинетическое поведение большинства ферментов значительно сложнее, чем это вытекает из идеализированной схемы, лежащей в основе уравнения Михаэлиса - Ментен. При выводе этого уравнения предполагается, что существует только один фермент-субстратный комплекс. Между тем в действительности в большинстве ферментативных реакций образуется, по меньшей мере, два или три таких комплекса, возникающих в определенной последовательности.
Здесь через EZ обозначен комплекс, соответствующий истинному переходному состоянию, а через ЕР - комплекс между ферментом и продуктом реакции. Можно указать также, что в большинстве ферментативных реакций участвует более одного субстрата и образуется соответственно два или большее число продуктов. В реакции с двумя субстратами, S 1 и S 2 , может образоваться три фермент-субстратных комплекса, а именно ES 1 , ES 2 и ES 1 S 2 . Если в результате реакции получается два продукта, P 1 и P 2 , то может существовать, по меньшей мере, еще три дополнительных комплекса EP 1 , EP 2 и EP 1 P 2 . В таких реакциях имеется много промежуточных стадий, каждая из которых характеризуется своей константой скорости. Кинетический анализ ферментативных реакций, в которых принимают участие два реагирующих вещества или более, часто оказывается исключительно сложным и требует использования электронных вычислительных машин. Тем не менее, при анализе кинетики всех ферментативных реакций отправной точкой всегда является рассмотренное выше уравнение Михаэлиса - Ментен. [5]
1.1 Природа конст анты K в уравнении
уравнение ферментативный реакция кинетика
Второй постулат формулирует, что константа K S в уравнении является константой диссоциации фермент-субстратного комплекса.
Бриггс и Холдейн в 1925 г. доказали, что исходное уравнение Михаэлиса - Ментен справедливо только при , т.е. когда равновесие элементарной стадии E+S ES устанавливается очень быстро по сравнению со скоростью следующей стадии. Поэтому такие кинетические механизмы (подчиняющиеся начальному условию Михаэлиса - Ментен и имеющие одну медленную элементарную стадию, относительно которой равновесия во всех других элементарных стадиях устанавливаются быстро) называются удовлетворяющими предположению о «быстром равновесии». Если, однако, k 2 по порядку величины сравнима с k -1 , изменение концентрации фермент-субстратного комплекса во времени можно выразить следующим дифференциальным уравнением:
d [ES] / dt = k 1 [E] [S] - k -1 [ES] - k 2 [ES]
Так как мы рассматриваем начальную скорость реакции, т.е. момент, когда обратная реакция еще не происходит, а предстационарная стадия уже прошла, то вследствие избытка субстрата количество образовавшегося фермент-субстратного комплекса равно количеству распавшегося ( принцип стационарности, или кинетика Бриггса и Холдейна, или принцип Боденштейна в химической кинетике) и справедливо, что
Подставив это в дифференциальное уравнение, получим выражение для концентрации свободного фермента:
[E] T = [E] + [ES] = [(k -1 + k 2 ) / k -1 [S] + 1] [ES] =
= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S] [ES]
[ES] = k 1 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S])
v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2 ) / k 1 + [S]]
и равняется максимальной скорости, полученной по уравнению Михаэлиса - Ментен. Тем не менее, константа в знаменателе уравнения Михаэлиса - Ментен - не K S , т.е. не константа диссоциации фермент-субстратного комплекса, а так называемая константа Михаэлиса:
В случае константа в знаменателе уравнения скорости выражается формулой
и называется, согласно Ван Слайку, кинетической константой . [6 ]
Уравнение стационарного состояния можно также получить из дифференциального уравнения без предположения, что d [ES] / dt = 0. Если подставим значение [E] = [E] T - [ES] в дифференциальное уравнение, после преобразований получим
[ES] = (k 1 [S] [E] T - d [ES] / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2 )
Для того чтобы из этого уравнения получить уравнение стационарного состояния, не обязательно должно быть d [ES] / dt = 0. Достаточно, чтобы выполнялось неравенство d [ES] / dt << k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.
Дифференцированное уравнение стационарного состояния выглядит следующим образом:
d [ES] / dt = [k 1 (k -1 + k 2 ) [E] T / (k 1 [S] + k -1 + k 2 ) 2 ] (d [S] / dt)
Это выражение, очевидно, не равно 0.
Природа компонентов реакции не определяет целиком смысла константы K в уравнении. Величина K m не имеет строго фиксированного значения. Она может меняться в зависимости от структуры субстрата, от рН и от температуры. При изменении условий реакции значение K также может измениться. Так, например, в случае пероксидазы при высокой концентрации донора протонов эта константа является кинетической константой K k . При уменьшении концентрации донора протонов константа превращается в константу Михаэлиса K m , а при очень низких уровнях донора протонов получаем константу диссоциации K S . [2]
1.2 Преобразование уравнения Михаэлиса - Ментен
Исходное уравнение Михаэлиса - Ментен является уравнением гиперболы, где одна из констант (V max ) - асимптота к кривой. Другая константа (K m ), отрицательное значение которой определяется второй асимптотой, равна концентрации субстрата, необходимой для достижения V max / 2. В этом легко убедиться, так как если
V max / 2 = V max [S] / (K m + [S])
V max / V max = 1 = 2 [S] / (K m + [S])
K m + [S] = 2 [S], т.е. [S] = K m при v = V max /2.
Уравнение Михаэлиса - Ментен можно алгебраически преобразовать в другие формы, более удобные для графического представления экспериментальных данных. Одно из наиболее распространенных преобразований сводится просто к тому, что приравнивают друг другу величины, обратные левой и правой части уравнения
В результате преобразования получаем выражение
которое носит название уравнения Лайнуивера-Бэрка . Согласно этому уравнению, график, построенный в координатах 1/[S] и 1/v, представляет собой прямую, тангенс угла наклона которой равен K m /V max , а отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен 1/V max . Такой график, построенный по методу двойных обратных величин, имеет то преимущество, что он даёт возможность более точно определить V max ; на кривой, построенной в координатах [S] и v, V max является асимптотической величиной и определяется значительно менее точно. Отрезок, отсекаемый на оси абсцисс, на графике Лайнуивера-Бэрка равен -1/K m . Из этого графика можно также извлечь ценную информацию, касающуюся ингибирование фермента. [3]
Другое преобразование уравнения Михаэлиса-Ментен состоит в том, что обе части уравнения Лайнуивера-Бэрка умножают на V max *v и после некоторых дополнительных преобразований получают
Соответствующий график в координатах v и v/[S] представляет с е 4, рис.   1 ] . Такой график ( график Эди-Хофсти ) не только даёт возможность очень просто определить величины V max и K m , но и позволяет выявить возможные отклонения от линейности, не обнаруживаемые на графике Лайнуивера-Бэрка.
Уравнение также можно линеаризовать в другой форме
[S] / v = K m / V max + [S] / V max
В этом случае следует строить зависимость [S] / v от [S]. Наклон полученной прямой равен 1 / V max ; отрезки, отсекаемые на осях ординат и абсцисс, равны (K m / V max ) и (- K m ) соответственно. По имени автора этот график называют графиком Хейнса . [1]
Статистический анализ показал, что методы Эди - Хофсти и Хейнса дают более точные результаты, чем метод Лайнуивера - Берка. Причиной этого является то, что в графиках Эди - Хофсти и Хейнса и зависимые, и независимые переменные входят в величины, откладываемые на обеих осях координат.
1.3 Влияние концентрации субстрата на кинетику реакции
Во многих случаях условие постоянства концентрации субстрата не выполняется. С одной стороны, избыток субстрата не используется в реакции in vitro с некоторыми ферментами из-за часто происходящего ингибирования ферментативной активности субстрата. В этом случае можно применять только оптимальную его концентрацию, и это не всегда обеспечивает избыток субстрата, необходимый для выполнения кинетических уравнений обсуждаемых выше механизмов. Более того, в клетке in vivo избыток субстрата, необходимый для осуществления этого условия, обычно не достигается.
В ферментативных реакциях, где субстрат не находится в избытке и, следовательно, его концентрация меняется в ходе реакции, константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна
K S = ([S] 0 - [ES] - [P]) [E] T - [ES])/[ES]
([S] 0 - концентрация субстрата при t = 0). В этом случае начальная скорость реакции (в стационарном состоянии) определяется формулой
где [S t ] - концентрация субстрата в момент времени.
Тем не менее, можно написать приблизительное решение для двух случаев, когда [S] о = [S t ]:
1) если это неравенство выполняется из-за больших значений t, т.е. когда более 5% от начальной концентрации субстрата израсходовалось за время реакции;
2) если концентрацией фермента нельзя пренебречь по сравнению с концентрацией субстрата и, таким образом, нужно принимать во внимание концентрацию фермент-субстратного комплекса.
Если t велико, а концентрация [ES] пренебрежимо мала по сравнению с [S] 0 , то уравнение константы диссоциации фермент-субстратного комплекса переходит в следующее:
K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - [ES]) / [ES]
Для значения концентрации [S t ], которая меняется в ходе реакции, удовлетворительным приближением служит значение ([S] 0 + [S t ])/2. Так как [S t ] = [S] 0 - [Р], среднюю скорость; можно выразить как
Подставив это выражение и приблизительное значение [S t ] в
При сравнении значений, рассчитанных на основе этого приближения, со значениями, полученными из точного, проинтегрированного уравнения Михаэлиса - Ментен, оказывается, что ошибка в определении K m составляет 1 и 4% при расходовании 30 и 50% субстрата соответственно. Следовательно, ошибка при данном приближении незначительна по сравнению с ошибкой измерения.
Когда расход субстрата не превышает 5% начальной концентрации, но концентрация фермента так велика, что [ES] по сравнению с [S] 0 нельзя не учитывать, константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна:
K s = ([S] 0 - [ES]) ([E] T - [ES]) / [ES]
Из двух возможных решений может быть выбрано только отрицательное, так как только оно удовлетворяет начальным условиям: [ES] = 0 при [S] 0 = 0 или [Е] T = 0. По аналогии с уравнением отношения v/V max мы получили уравнение начальной скорости. Квадратное уравнение, полученное из уравнения константы диссоциации фермент-субстратного комплекса, найденную чуть выше, с помощью формул v = k 2 [ES] и V max = k 2 [E] T , можно привести к следующему виду:
[S] 0 V max / v = K s V max / (V max - v) + [E] T
Если известно V max можно рассчитать K s .
Следует учесть два предельных случая. В первом случае [S]<> K m . Здесь константа K m ничтожно мала по сравнению с [S], и, таким образом, получаем v = V max . [2]
1. 4 Образование кинетически устойчивого комплекса фермент - продукт
Если в ходе реакции происходит образование кинетически устойчивого комплекса фермент - продукт, механизм реакции выглядит следующим образом:
Применив предположение о стационарном состоянии, можно написать дифференциальные уравнения:
d [ES] /dt = k 1 [E] [S] + k -2 [EP] - (k -1 + k 2 ) [ES] = 0
d [EP] /dt = k 2 [ES] - (k -2 + k 3 ) [EP] = 0
[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3 ) / k 1 k 2 [S]] [EP]
= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3 ) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3 ) / k 2 + 1] [EP] =
= {[k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3 + k 1 [S] (k -2 + k 3 ) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S]} [EP]
[EP] = k 1 k 2 [S] [E] T / [k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3 + k 1 [S] (k -2 + k 3 + k 2 )]
v = k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / [k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3 + k 1 [S] (k -2 + k 3 + k 2 )] =
= [k 2 k 3 / (k -2 + k 3 + k 2 )] [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3 ) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2 ) + [S]]
V max = [k 2 k 3 / (k -2 + k 3 + k 2 )] [E] T
K m = (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3 ) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2 )
В этом случае уже очень сложно вычислить конкретные значения индивидуальных констант скорости, так как прямо измерить можно только их отношение. Ситуация еще более затрудняется при усложнении механизма ферментативной реакции, когда в реакции участвуют больше двух комплексов, потому что количество констант скорости в уравнении, естественно, гораздо больше, и их соотношения также сложнее. [2]
Однако ситуация упрощается, если после обратимой реакции образования первого комплекса последующие элементарные стадии необратимы. Важными представителями ферментов, подчиняющихся этому механизму, являются протеолитические ферменты и эстеразы. Механизм их реакции можно записать следующим образом:
где ES` - ацилферментное промежуточное соединение, которое разлагается под действием воды. Мы можем написать
d [P 2 ] /dt = d [P 1 ] / dt = v = k 1 k 2 k 3 [S] [E] 0 / [k 3 (k -1 + k 2 ) + [S] (k 2 + k 3 )]
V max = k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3 ) = k кат [E] 0
K m = k 3 (k -1 + k 2 ) / (k 2 + k 3 ) k 1
k кат / K m = k 2 k 1 / (k -1 + k 2 ) = k 2 / K m '
Константа Михаэлиса стадии ацилирования - K m ' K s . Чем больше отношение k кат /K m , тем выше специфичность субстрата. [5]
Определение констант значительно упрощается, если эксперимент проводят в присутствии нуклеофильного агента (N), способного конкурировать с водой. Тогда
k 3 = k 3 ' [H 2 O] и P i (i = 1, 2, 3) - продукты.
v i = k кат , i [E 0 ] [S] / (K m + [S])
k кат , 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])
k кат , 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N])
k кат , 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N])
K m = K s (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])
1/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] [E 0 ] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [E 0 ]
Так как известно, что K s /k 2 = K m / k кат , и если нуклеофил отсутствует, то
1/v = K s / k 2 [S] [E 0 ] + (k 2 + k 3 ) / k 2 k 3 [E 0 ]
и для определения констант можно использовать точку пересечения прямых в координатах 1/v N (и 1/v) - 1/[S]. Две прямые линии в двойных обратных координатах пересекаются во втором квадранте. В отсутствии нуклеофила точка пересечения прямой с вертикальной осью определяется как 1/V max и 1/k кат [E 0 ], а с горизонтальной осью - как -1/K m . Координаты точки пересечения двух прямых: -1/K s и 1/k 3 [E 0 ]. Расстояние между 1/V max и 1/k 3 [E 0 ] равно 1/k 2 [E 0 ].
1. 5 Анализ полной кинетической кривой реакции
Уравнение Михаэлиса - Ментен в исходном виде относится только к необратимым реакциям, т.е. к реакциям, где рассматривается только начальная скорость, а обратная реакция не проявляется из-за недостаточного количества продукта и не влияет на скорость реакции. В случае необратимой реакции полную кинетическую кривую можно легко анализировать (для произвольного интервала времени t ), интегрируя исходное уравнение Михаэлиса - Ментен. В этом случае, следовательно, сохраняется предположение, что в ходе реакции образуется только один промежуточный фермент-субстратный комплекс. Так как для интервала времени t не ставится никаких ограничений, концентрация субстрата в момент анализа не может быть равной первоначально введенной его концентрации. Таким образом, также необходимо принимать во внимание изменение [S] в ходе реакции. Пусть S 0 - начальная концентрация субстрата, (S 0 - y ) - концентрация в момент времени t . Тогда, на основе исходного уравнения Михаэлиса - Ментен (если y - количество превращенного субстрата), мы можем написать
dy / dt = V max (S 0 - y) / (K m +S 0 - y)
Взяв обратные величины и разделив переменные, интегрируем по y в пределах от 0 до y (V max обозначена как V ):
(2,303 / t) lg [S 0 / (S 0 - y)] = V / K m - (1 / K m ) (y / t)
Таким образом, построив график зависимости левой части уравнения от y/t (координаты Фостера-Ниманна) , получим прямую линию с наклоном (-1/K m ) , отсекающую на оси ординат отрезок (V/K m ) , а на оси абсцисс - отрезок V. Интегральное уравнение можно также линеаризовать по-другому:
t / 2,3031 lg [S 0 / (S 0 - y)] = y / 2,303 V lg [S 0 / (S 0 - y)] + K m / V
или t/y = 2,3031 K m lg [S 0 / (S 0 - y)] / V y +1/V [5]
Если мы изучаем обратимую реакцию, необходимо обращать внимание на то, с каким временным интервалом мы имеем дело. В момент смешения фермента с субстратом начинается так называемая предстационарная фаза продолжительностью несколько микро- или миллисекунд, в течение которой образуются фермент-субстратные комплексы, соответствующие стационарному состоянию. При изучении обратимых реакций на достаточно протяженных отрезках времени эта фаза не играет значительной роли, так как в этой фазе реакция не протекает с полной скоростью ни в одном из направлений.
Для реакции, идущей слева направо, фермент-субстратные комплексы, принимающие участие в реакции, достигают скоростьлимитирующей концентрации только в конце предстационарной фазы. Квазистационарное состояние , в котором концентрации скоростьопределяющих фермент-субстратных комплексов приближаются к максимальным значениям концентраций в стационарном состоянии, длится несколько десятых долей секунды или секунды. Во время этой фазы скорость образования продукта (или расходования субстрата) практически линейная во времени. Теоретически здесь образования продукта еще не произошло, а практически его концентрация настолько мала, что скорость обратной реакции не влияет на скорость прямой. Эта линейная фаза называется начальной скоростью реакции, до сих пор мы только ее и принимали во внимание. [3]
Реакция справа налево в следующей фазе также ускоряется из-за постепенного увеличения концентрации продукта (переходное состояние; наблюдаемая до сих пор линейность во времени исчезает). Эта фаза продолжается до тех пор, пока скорость реакции слева направо не становится равной скорости реакции справа налево. Это - состояние динамического равновесия, так как реакция непрерывно продолжается в обоих направлениях с одинаковой скоростью.
2 . Факторы, от которых зависит скорость ферментативной реакции
2.1 Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры
С повышением температуры среды скорость ферментативной реакции увеличивается, достигая максимума при какой-то оптимальной температуре, а затем падает до нуля. Для химических реакций существует правило, что при повышении температуры на 10°С скорость реакции увеличивается в два-три раза. Для ферментативных реакций этот температурный коэффициент ниже: на каждые 10°С скорость реакции увеличивается в 2 раза и даже меньше. Наступающее вслед за этим снижение скорости реакции до нуля свидетельствует о денатурации ферментного блока. Оптимальные значения температуры для большинства ферментов находятся в пределах 20 - 40 0 С. Термолабильность ферментов связана с их белковым строением. Некоторые ферменты денатурируют уже при температуре около 40 0 С, но основная часть их инактивируется при температурах выше 40 - 50 0 С. Отдельные ферменты инактивирует холод, т.е. при температурах, близких к 0°С, наступает денатурация.
Повышение температуры тела (лихорадочное состояние) ускоряет биохимические реакции, катализируемые ферментами. Нетрудно подсчитать, что увеличение температуры тела на каждый градус повышает скорость реакции примерно на 20%. При высоких температурах около 39-40°С расточительное использование эндогенных субстратов в клетках больного организма обязательно требуется восполнять их поступление с пищей. Кроме того, при температуре порядка 40°С часть весьма термолабильных ферментов может денатурироваться, что нарушает естественный ход биохимических процессов. [1]
Низкая температура вызывает обратимую инактивацию ферментов вследствие незначительного изменения его пространственной структуры, но достаточного для нарушения соответствующей конфигурации активного центра и молекул субстрата.
2.2 Зависимость скорости реакции от рН среды
Для большинства ферментов имеется определенное значение рН, при котором их активность максимальна; выше и ниже этого значения рН активность этих ферментов уменьшается. Однако не во всех случаях кривые, описывающие зависимость активности фермента от рН, имеют колоколообразную форму; иногда эта зависимость может выражаться также прямой. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН главным образом свидетельствует о состоянии функциональных групп активного центра фермента. Изменение рН среды влияет на ионизацию кислых и основных групп аминокислотных остатков активного центра, которые участвуют или в связывании субстрата (в контактном участке), или в его превращении (в каталитическом участке). Поэтому специфическое влияние рН может быть вызвано или изменением сродства субстрата к ферменту, или изменением каталитической активности фермента, или обеими причинами вместе.
Большинство субстратов имеют кислотные или основные группы, поэтому рН влияет на степень ионизации субстрата. Фермент предпочтительно связывается или с ионизированной, или с неионизированной формой субстрата. Очевидно, при оптимальном рН и функциональные группы активного центра находятся в наиболее реакционноспособном состоянии, и субстрат находится в форме, предпочтительной для связывания этими группами фермента. [6]
При построении кривых, описывающих зависимость активности фермента от рН, измерения при всех значениях рН обычно проводят в условиях насыщения фермента субстратом, поскольку величина K m для многих ферментов изменяется с изменением рН.
Кривая, характеризующая зависимость активности фермента от рН, может иметь особенно простую форму в тех случаях, когда фермент действует на электростатически нейтральные субстраты или субстраты, у которых заряженные группы не играют существенной роли в каталитическом акте. Примером таких ферментов служит папаин, а также инвертаза, катализирующая гидролиз нейтральных молекул сахарозы и сохраняющая постоянную активность в интервале рН 3,0-7,5.
Значение рН, соответствующее максимальной активности фермента, не обязательно совпадает со значением рН, характерным для нормального внутриклеточного окружения этого фермента; последнее может быть как выше, так и ниже оптимума рН. Это позволяет предположить, что влияние рН на активность фермента может быть одним из факторов, ответственных за регулирование ферментативной активности внутри клетки. Поскольку в клетке содержатся сотни ферментов, и каждый из них по-разному реагирует на изменение рН, значение рН внутри клетки является, возможно, одним из важных элементов в сложной системе регуляции клеточного метаболизма. [5]
2.3 Определение количества фермента по его активности
Содержание фермента в данном растворе или в тканевом экстракте можно определить, измеряя его каталитический эффект. Для этого необходимо знать:
1) общую стехиометрию катализируемой реакции;
2) возможную потребность в кофакторах - в ионах металлов или коферментах;
3) зависимость активности фермента от концентраций субстрата и кофактора, т.е. величины K m как для субстрата, так и для кофактора;
4) значение рН, соответствующее максимальной активности фермента;
5) область температур, при которых фермент устойчив и сохраняет высокую активность.
Кроме того, необходимо иметь в своем распоряжении какую-нибудь достаточно простую аналитическую методику, позволяющую определять скорость исчезновения субстрата или скорость появления продуктов реакции.
Всегда, когда это возможно, анализ на содержание фермента проводится в стандартных условиях, при которых поддерживается оптимальное значение рН и концентрация субстрата, превышающая концентрацию насыщения; в этом случае начальная скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и пропорциональна только концентрации фермента. Для ферментов, нуждающихся в кофакторах - ионах металлов или коферментах, концентрация этих кофакторов также должна превышать концентрацию насыщения, с тем, чтобы фактором, лимитирующим скорость реакции, была концентрация фермента. Обычно измерение ско
Кинетика ферментативных реакций курсовая работа. Биология и естествознание.
Лермонтов Собрание Сочинений В 4 Томах
Курсовая работа по теме Мифологема шизофренического и мистического переживания
Реферат: Подводные киносъемки
Эндокринная Система Реферат
Реферат: Боли в области шеи. Скачать бесплатно и без регистрации
Курсовая работа по теме Анализ финансового состояния ЗАО "Череповецкий фанерно-мебельный комбинат"
Контрольная Работа 4 Класс Состав Слова
Контрольная работа: Художественный образ как эстетическая категория
Реферат по теме Древний Китай: особенности и этапы развития
Курсовая работа по теме Метафоричність роману В. Голдінга 'Паперові люди'
Мужчина И Женщина Сочинение
Контрольная работа по теме Развитие мозга. Психические свойства человека
Сочинение О Первом Учителе 1 Класс
Курсовая работа: Редактирование информации в документах Word. Скачать бесплатно и без регистрации
Сочинение Про Части Речи 5 Класс
Реферат по теме Футуристические прогнозы развития человеческой цивилизации
Сочинение по теме Характеристики героинь Островского
Структура Эссе По Обществознанию
Курсовая работа по теме Причины и условия возникновения массовой культуры и поп музыки
Суязова Ирина Анатольевна Итоговое Сочинение 2022
Теория управления. Принципы системного анализа - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда анализ книги
Требования промышленной безопасности при эксплуатации электрических станций и сетей - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда курсовая работа
Цель и задачи охраны труда в государстве - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда контрольная работа