Как выделяли ДНК из фаланги «денисовца»

Как выделяли ДНК из фаланги «денисовца»

АНТРОПОГЕНЕЗ.РУ

Отправная точка палеогенетического исследования — мтДНК. Напомним, что каждая митохондрия нашей клетки имеет собственный геном. Этот геном весьма невелик по сравнению с ядерным (у человека — всего 16 565 пар нуклеотидов) и представлен множеством копий на клетку.

Фаланга мизинца из Денисовой пещеры.
По этому крошечному фрагменту и описали денисовцев

Кроме того, поскольку митохондрии находятся в цитоплазме, человек получает свой митохондриальный геном из яйцеклетки — то есть от матери, без всякой примеси отцовских генов. Это удобно для построения родословных — как «чисто человеческих», так и межвидовых, благо у нас есть митохондриальные геномы неандертальцев, кроманьонцев и современных людей, а также обезьян. Кстати, дитя из Денисовой пещеры называют «X-woman» только потому, что исследовали его митохондриальную ДНК: «икс» — как нечто неизвестное, woman — в знак того, что полученные данные показывают наследование по женской линии. Определить пол ископаемого ребенка по мтДНК и форме косточки невозможно: необходим или более полный скелет, или ядерная ДНК.

Для исследования выделили ДНК из 30 мг костного порошка. Изолированные фрагменты мтДНК секвенировали с обоих концов по технологии «Illumina». В дальнейший анализ включали только те фрагменты, которые удалось дочитать с двух концов до середины, с перекрыванием не менее чем на 11 пар нуклеотидов. Это заставило отказаться от всех фрагментов длиннее 134 п.н., зато уменьшило число ошибок на 3’-конце, где «Illumina» читает весьма неточно. Всего было получено 1 178 300 последовательностей, из которых в итоге лишь 30 443 использовали для восстановления мтДНК. Дело это тонкое: компьютерная программа должна «знать», какие повреждения характерны для древней ДНК. Если где-то имеет место расхождение в одну «букву», надо понимать, что считать правильным.

Важнейшая проблема палеогенетики и палеогеномики — как не перепутать древнюю ДНК с более поздними загрязнениями. (Подробнее об этом см. «Химию и жизнь», 2009, № 5.) Полученную последовательность сравнивали не только с мтДНК неандертальцев и современных людей, но и с мтДНК животных, чтобы убедиться, что она человеческая. А чтобы доказать, что отсеквенирован был именно митохондриальный геном палеолитического ребенка, а не кого-то из соавторов работы, ДНК из костного материала выделили повторно и прочитали 9908 случайно выбранных фрагментов. Все они легли на полученную последовательность, а значит, результаты воспроизводились. Кроме того, проверили 276 позиций, в которых ДНК из Денисовой пещеры отличилась более чем от 99% современных людей, чтобы убедиться, что везде эти отличия одинаковы, то есть ДНК получена от одного индивида. (И действительно, они оказались одинаковыми в 99,7% случаев.)

Удалось извлечь пользу даже из повреждений древней ДНК. При правильном подходе это своего рода «благородная патина», которая помогает отличить ДНК ископаемого существа от современных загрязнений. Например, еще на образцах неандертальцев было показано, что в обрывках подлинно древней ДНК у 5’-концов примерно треть цитозинов замещены тиминами, тогда как на 3-концах наблюдается комплементарное замещение гуанина аденином. Все это подтверждало: исследователи восстановили именно мтДНК ископаемого ребенка.

Наконец, мтДНК из Денисовой пещеры сравнили с 54 образцами мтДНК современных людей, с мтДНК кроманьонца из позднего плейстоцена, найденного в Костёнках (Россия, Воронежская область), с шестью полными неандертальскими мтДНК, одной, полученной от бонобо, и одной от шимпанзе. О том, что было дальше, немецкий журнал «Шпигель» пишет в драматических тонах. «Иоганнес Краузе снова и снова перепроверял свои данные. Он никак не мог поверить в такой результат. Ученый хотел убедиться в своей правоте, прежде чем звонить боссу — знаменитому специалисту по эволюционной генетике Сванте Пээбо. Действительно ли ДНК получена от неизвестного прежде вида человека?» Пээбо, по его собственным словам, тоже был потрясен, когда ознакомился с результатами.

Неандертальская мтДНК отличается от мтДНК современного человека в среднем по 202 позициям, ДНК «денисовского человека» — по 385 позициям, а шимпанзе — по 1462. (Как известно, мтДНК отдельных представителей Homo sapiens тоже различаются, но отличий в разы меньше, даже между далекими друг от друга этническими группами.) Таким образом, новая находка оказалась почти вдвое дальше от человека, чем неандерталец!

Клещенко Е.В. Третий брат. Журнал «Химия и жизнь» 2010 г., №5, с. 3-4.