Как сдать образец на ЯМР?

Для начала надо определиться — на каком ядре нам нужен спектр?

¹H, ¹³C, ¹⁹F, ³¹P? А, может, какой-то более редкий? Или сразу несколько?

В зависимости от выбора будет варьироваться оптимальная масса пробы (при стандартной работе с веществами молекулярной массы до 500 а.е.м. удобнее говорить именно о массе, а не о количестве вещества). Для самого популярного типа съёмки — на ядрах ¹H — оптимальная масса 10–40 мг; для второго по популярности — на ядрах ¹³C — 30–100 мг; для ядер ¹⁹F, ³¹P — 10–40 мг.

Чем меньше масса пробы, тем слабее будет сигнал от исследуемого вещества относительно шума и растворителя, для борьбы с чем потребуется больше времени для накопления спектра (вплоть до дней вместо минут).

Чем больше масса пробы, тем хуже может быть качество из-за неоднородности раствора вследствие низкой растворимости вещества и/или повышенной вязкости.

Следующий вопрос — для чего нам спектр? Как мы будем его анализировать?

В зависимости от ответа будут подобраны растворитель и внутренний стандарт.

Если всего лишь убедиться, что искомое соединение есть в исследуемой смеси, то достаточно понимать, какие сигналы мы ожидаем увидеть на спектре, а также подобрать такой растворитель, который не помешает их увидеть.

Если надо посчитать выход целевого продукта, то надо подобрать «внутренний стандарт». Внутренний стандарт (Internal standard) — это хорошо известное химическое соединение, которое добавляют к анализируемой пробе, точно зная его массу. Очевидно, что стандарт не должен реагировать с целевым продуктом или растворителем, а также его сигналы не должны перекрываться с другими сигналами на спектре, но должны быть такого же типа, который мы хотим интегрировать.

Теперь, когда мы определились с целями, нужно отдать образец на прибор, но как и что для этого нужно?

Инвентарь:

• ЯМР ампула с крышечкой
• Флажок
• Проба вещества
• Внутренний стандарт
• Растворитель и шприц

И понимание:

• Проверка
• Что не любят операторы?

ЯМР ампула с крышечкой

ЯМР ампула должна быть чистой, без каких-либо внешних и внутренних загрязнений, а также не должна быть как-либо повреждена физически (никаких трещин, сколов), так как в случае деформации внутри прибора повредиться может уже датчик, чья стоимость (50000+ $) не соразмерна цене новой ампулы (5$).

ЯМР ампулу не надо трогать руками за стеклянную часть посередине, следы от пальцев могут сказаться на качестве спектра. Берите образец либо только за верхнюю часть, либо двумя руками за верх и донышко. Необходимо протирать снаружи в случае загрязнения.

ЯМР ампула должна быть плотно закрыта чистой крышечкой. В случае разгерметизации придётся отмывать двухметровую трубу диаметром 5 см внутри прибора от вашего вещества, и во время этой процедуры все другие образцы будут ждать.

Флажок

Как и любой сосуд с веществом ампула должна быть подписана. С одной стороны, на ней нет места, с другой, лишние вещества из маркера не нужны в спектре. Информация об образце помещается на флажок:

• ФИО экспериментатора (Иванов ИИ)
• Уникальный шифр эксперимента (II-1)
• Номер лаборатории (№103)
• Растворитель (CDCl3)
• Снимаемое ядро (¹H ЯМР)
• Дата (27.11)
• Масса вещества (30 мг)
• Внутренний стандарт (MeNO₂)
• Масса внутреннего стандарта (5,0 мг)
• Структура вещества
• Дополнительные сообщения оператору

Флажок крепится на ЯМР ампулу с помощью предварительно вырезанных отверстий после завершения процедуры подготовки образца.

Вещество

Про массу пробы уже было сказано — обязательно указываем, она нужна оператору для корректных настроек прибора.

Если Вы планируете сдавать агрессивное вещество (например, кислоты), то предварительно договоритесь с оператором об этом.

Если необходимо накопить или подавить какой-либо пик, то также отдельно уведомите об этом оператора.

Внутренний стандарт (если нужен)

Необходимо такое вещество, сигналы которого будут в области целевых пиков анализируемого соединения, поэтому нужно сначала в литературе найти такое соединение, затем узнать в каком дейтерированном растворителе оно растворяется. Количество вещества стандарта должно быть соизмеримо с количеством продукта, если предполагать, что его выход 50%, тогда при низком выходе точность будет выше. Кроме того, не надо брать tBu при интегрировании CH (9 к 1 слишком большое соотношение при равном количестве молекул). Массу внутреннего стандарта надо точно измерять и записывать. Примеры популярных внутренних стандартов: нитрометан, динитробензол.

Растворитель и шприц

На ЯМР спектрометр образцы сдаются в жидком виде, бывают и твёрдофазные приборы, но здесь такие обсуждаться не будут. Использовать обычные растворители можно, однако это неудобнее и добавляет значительные сложности при анализе. Для ¹H спектров мы возьмём дейтерированные растворители (популярные варианты CDCl3 и DMSO-d6). Дейтерий на нашем спектре видно не будет (в силу природы атомов дейтерия), но небольшая концентрация протонированной формы всё же останется, поэтому протоны растворителя будут зафиксированы. В литературе надо предварительно проверить, в каком растворителе обычно снимают анализируемое вещество.

В случае наличия нерастворимых частиц в растворе необходимо его отфильтровать (например, через ватку и пипетку Пастера), иначе качество спектра заметно снизиться.  

Объем растворителя должен быть около 550 мкл, при этом важно попасть в нужный уровень жидкости в ампуле — он должен составлять 40–60 мм в зависимости от прибора. Уровень нужно проверять точно с помощью линейки или эталона в виде распечатанного образца у рабочего места. Если налить сильно больше, то магнитное поле, которое воздействует на ядра становится негомогенным, в результате чего ядра в разных слоях возбуждаются с разной эффективностью и пики становятся уширенными. Если налили меньше, то просто долейте жидкость. Набирать растворитель нужно только определенным шприцом для этого растворителя. После отбора растворителя сразу же его закрывайте, так как изотопный обмен происходит с водой из воздуха, а многие растворители легко испаряются. Когда удостоверились в объёме, замотайте образец парафильмом (специальной пленкой), чтобы растворитель не испарялся

Проверка

После переноса вещества (с растворителем и внутренним стандартом) в ЯМР ампулу убедитесь, что:

• в ампуле не плавает осадок
• массы вещества и внутреннего стандарта записаны
• уровень жидкости в ампуле нужной высоты
• ампула закрыта

Что не любят операторы?

Небрежность:

• когда информация на флажке записана неразборчиво
• когда флажок плохо держится на ампуле
• когда допущены ошибки при пробоподготовке

Сложности с шифром эксперимента:

• похожие символы, например I и l (заглавная i и строчная L)
• очень длинный, например, «ASFHS_334$_5fraction»
• использованы спецсимволы кроме «-» (дефис) и «_» (нижнее подчеркивание)