Как быстро винт выводится из крови самостоятельно…

______________

✅ ️Наши контакты (Telegram):✅ ️

>>>🔥🔥🔥(ЖМИ СЮДА)🔥🔥🔥<<<

✅ ️ ▲ ✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ✅ ️

______________

Как быстро винт выводится из крови самостоятельно…

Эфедрин – все о наркотическом действии препарата

Как быстро винт выводится из крови самостоятельно…

Сколько выветривается из СНЮС организма?

Как быстро винт выводится из крови самостоятельно…

Мы описываем изоляции новорожденных кардиомиоцитов и подготовки клеток для инкапсуляции в фибрин гидрогеля конструкции для тканевой инженерии. Мы опишем методы анализа тканей инженерии миокарда после периода культивирования, включая активные силы, возникающей при электрической стимуляции и жизнеспособность клеток и immunohistological окрашивания. Культивирование клеток в трехмерной среде гидрогеля является важным методом для разработки конструкции для тканевой инженерии, а также изучение клеточных реакций при различных условиях культуры в пробирке. Трехмерной среде более точно имитирует то, что клетки наблюдать в естественных условиях в связи с применением механических и химических раздражителей во всех измерениях 1. Трехмерные гидрогелей могут быть сделаны из синтетических полимеров, таких как PEG-DA 2 и PLGA 3 или число естественных белков, таких как коллаген 4, гиалуроновая кислота 5 или 6,7 фибрина. Гидрогели создан из фибрина, естественных белков свертывания крови, может полимеризоваться с образованием сетки, которая является частью естественного исцеления раны тела процессы 8. Фибрин является клеточная разложению и потенциально аутологичных 9, что делает его идеальным временным эшафот для тканевой инженерии. Здесь мы опишем подробно изоляция новорожденных кардиомиоцитов из трех дневных крысят и подготовки клеток для инкапсуляции в фибрин гидрогеля конструкции для тканевой инженерии. Новорожденных миоциты общий источник используемой базовой станции для лабораторного исследования в сердечной ткани и формирование инженерной 4. Фибринового геля создается путем смешивания фибриногена с фермента тромбина. Тромбин расщепляет fibrinopeptides РПА и ФПБ из фибриногена, выявление мест связывания, которые взаимодействуют с другими мономерами Эти взаимодействия причиной мономеров самостоятельно собираться в волокна, которые формируют гидрогеля сетки. Потому что сроки этой ферментативной реакции можно регулировать, изменяя отношение к тромбина фибриноген, или соотношение кальция в тромбин, можно литья под давлением конструкции с целым рядом различных геометрий 11, Далее мы можем произвести выравнивание в результате ткани по тому, как мы ограничиваем геля во время культура После культивирования инженерии сердечной ткани конструкций в течение двух недель в статических условиях, клетки сердечной начали переделывать конструкцию и может произвести сокращения силы при электрическом ходить 6. В рамках этого протокола, мы также описаны методы анализа тканей инженерии миокарда после периода культивирования в том числе функциональный анализ активной силы, создаваемой сердечной мышцы построить на электрическую стимуляцию, а также методы определения окончательного жизнеспособности клеток Live-Dead анализ и immunohistological окрашивания для изучения экспрессии и морфологии типичных белков важно для сокращения миозина тяжелой цепи или MHC и сотовой связи коннексин 43 или Cx43 между миоцитов. Решения, созданные в этом разделе: PBS-раствора глюкозы, стоп медиа. Решения, используемые в этом разделе: PBS-раствора глюкозы, Бетадин. Решения, используемые в этом разделе: Бетадин, PBS-раствора глюкозы. Кастинг фибринового геля конструкций - подготовка к созданию фибрина гели сделано заблаговременно. Решения, созданные в этом разделе: фибриноген маточного раствора, тромбин маточного раствора, Pluronics решение, инфаркт построить средства массовой информации. Кастинг фибринового геля конструкций - подготовка к созданию фибрина гели право, прежде чем принимать конструкций фибрина гель. Решения, созданные в этом разделе: F решение, Т решение, сотовые решение. Анализ методов через 2 недели в культуре - тестирование сокращения силу. Решения, используемые в этом разделе: DMEM, инфаркт построить средства массовой информации. Анализ методов через 2 недели в культуре - иммуногистохимии для важных миоцитов белков:. Кардиомиоцитов фибрина построить первоначально охватывает всю ширину формы рис. Нет пузырьки должны существовать в строительство и она должна выглядеть одинаковым по всей длине. Когда конструкция электрически ходил в наших пользовательских устройств силы сокращения рис. Twitch силы примерно 1,3 млн, как ожидается 6. Сотовые жизнеспособность построить зависит от глубины построить, из-за диффузионных ограничений кислорода в конструкцию. На поверхности конструкции, на рисунке 4A, высокая жизнеспособность клеток не наблюдается. С конфокальной микроскопии, рисунок 4B, выравнивается структура построить наблюдается из-за тяжелой цепи миозина, МНС, является важным для сокращения, показаны красным цветом. Коннексин 43, показаны зеленым цветом, необходимо для сотовой связью между миоцитов. Рисунок 1: Обзор процесса инкапсуляции. Рисунок 2: отдельные и комбинированные формы частей для создания фибрина гели. Froм слева направо: две тефлоновые шайбы, две силиконовые уплотнительные кольца, тефлоновые стержня, тефлоновой трубки, заполненной оправки, внешний корпус для оправки, и поршень. Б Построить на плесень сразу после выброса из внешнего корпуса день 0. С Уплотненный построить на плесень красная стрелка , после 13 дней культуры. Рисунок 3: Особый сокращение силы измерительная система для записи силы дергаться. Датчик силы с должности меры сокращения силу, и выводит результат в компьютер. Ванне, содержащей два электрода углерода с проводов подключается к электрическим стимулятором которого шагов построить. Две должности провести построить на месте. B Пример дергаться данные силу сигнала генерируется электрическая стимуляция с частотой 0,5 Гц. Зеленый представляет живые клетки и красные представляет мертвых клеток. Таблица 1. Фибринового геля решения, количество на 1 мл геля. Фибрин является предпочтительным биоматериала, потому что когда клетки захватываются, их метаболически активных и способных уплотнения, реконструкции и воссоздания внеклеточного матрикса, который согласуется с нативной ткани сердца Потому что мы позволяем кардиомиоцитов выстроиться в этой среде, их функциональность более характерно для сердечной мышцы, в результате чего большее сжатие силой по сравнению с изотропным тканей 6. Для потенциальных терапевтических применений, необходимо для инкапсуляции клеток в материал, который способствует как жизнеспособность и функциональность. Протоколы, представленные здесь продемонстрировать эффективные и точные средства для создания сети фибрина для контроля сердечной поведение клеток в трехмерном микроокружения. Несколько потенциальных проблем, возникающих в ходе создания и культуры этих конструкций. Одним из потенциальных вопросом является поддержание жизнеспособности клеток до инкапсуляции, что существенно влияет на функциональность конструкции. Усилия должны быть направлены на пределе гибель клеток после изоляции за счет сокращения времени между изоляцией и инкапсуляции клеток в гель фибрина. Конструкции должны быть предоставлены средства массовой информации каждый день по строгому графику. Кроме того, важно обеспечить однородность во всех решениях используется. Если смесь из фибриногена, тромбина и производит клетки гетерогенной среде, способность клеток реконструировать ECM, механически пары и договор потенциально затруднено. Важно также, чтобы предотвратить образование воздушных пузырьков при инжекции конструкций с целью предотвращения нарушений в преемственности инженерии тканей. Один из способов облегчить этот вопрос привлечь больше геля, чем нужно, чтобы построить в шприц и впрыснуть медленно. Наконец, однажды фибрина матрицу создала и был в питательной среде в течение 24 часов, необходимо отделить построить из сторон кольца формы содействия клеточной уплотнения геля фибрина. Хранение построить в середине формы облегчает газа и питательных обмена. Соблюдение стороны кольца плесень может также нарушить желаемого сотовой выравнивания. Важно отметить, что сознательное обезглавливание используется как метод euthanization в данном протоколе, который является приемлемым методом в соответствии с руководящими с обеих Национального института здоровья и Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации. Тем не менее, некоторые организации рекомендуют использовать анестезию следует обезглавливание для новорожденных крыс. Относительно небольшое количество гипоксия может привести к миоцитов ишемии и потенциально миоцитов смерти, которые могли бы существенно повлиять на результаты этого протокола. Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения - Национальный институт сердца, легких и крови институт премии R00HL к БОД. Ye, K. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Bioengineering. Новорожденных кардиомиоцитов изоляции - подготовка накануне Решения, созданные в этом разделе: PBS-раствора глюкозы, стоп медиа. Подготовка стоп медиа, добавив 25 мл ФБС и 5 мл пенициллина стрептомицин той же концентрации, что и выше до средних мл стерильного Дульбеко изменения Орла DMEM и довести объем до мл стерильного DMEM до стерильной фильтрации через 0,2 мкм фильтр. Стерилизовать хирургических инструментов, необходимых для изоляции в автоклаве: кровоостанавливающего, 5 щипцы, большие ножницы, микро-ножницы и скальпель ручкой 4. Они должны быть размещены в ведерке со льдом со льдом в стерильных капот культуры. Место мл стакан с мл Бетадин в капот. Для каждого человека, место абсорбирующего скамейке underpad на рабочую поверхность капота и место стерильную драпировать над тем, чтобы не прикасайтесь к центру работу стерильной драпировки. Дамп хирургических инструментов и 4 х 4 марлевым тампоном на стерильной драпировки, не прикасаясь к инструментам. Возьмите щенка от плотины и поместить в непрозрачный контейнер, место щенка в капоте Наденьте стерильные перчатки Сложите марлю в четверти, зажим с кровоостанавливающего и поместить в Бетадин стакан. Положите лезвие скальпеля на скальпель ручкой и отложите в сторону. Новорожденных кардиомиоцитов изоляции - сердце рассечение Решения, используемые в этом разделе: Бетадин, PBS-раствора глюкозы Возьмите щенка в вашем не доминантной рукой, зажимая кожу между лопатками между большим и указательным пальцами. Использование больших ножниц, обезглавить щенка в одной разреза. Будьте уверены, чтобы вырезать из задней щенка вперед, чтобы позвоночник полностью разорваны. Тампон щенка грудь бетадин пропитанной марли. Безопасные щенка, зажимая лопатки вместе. Выполните частичное торакотомия раскрыть сердце. Повышение внешнего давления, тем самым заставляя сердце прошлом ребрами для scalpular рассечение. Запуск лезвие скальпеля за сердце, чтобы разорвать крупных сосудов и удалить сердце. Место сердце в чашке Петри содержащие PBS-глюкозы, которая находится на льду. Повторите шаги для каждого щенка в помете. Используйте пипетку для передачи ткани кусочки и все решения в 50 мл конические и место на льду. Хорошо перемешайте и стерильный фильтр в отдельную бутылку. Разрешить измельченной ткани осели на дно центрифуге трубки. Добавить 7 мл коллагеназы решение центрифуге трубки. Поставьте таймер на 7 минут. Убедитесь, что место коллагеназы бактек на водяной бане, чтобы держать это тепло. Когда таймер выключается, довести конической обратно в капот. Также принесите теплая коллагеназы и универсальное решение на капот. Аккуратно титровать ткани частей раз сломать их. После титрования, позволяют штук оседают на дно минуты. Аспирируйте от так много супернатант возможно быть очень осторожными, чтобы не поглощать ткани штук. После этого добавить 7 мл коллагеназы решение ткани кусочки и место обратно в инкубатор на шейкере в течение 7 минут. Для каждого оставшегося шаг, осторожно титровать 10 раз, чтобы разрушить ткань произведений. Как только ткань части урегулирования, рисовать супернатант выходные и собрать ее в отдельную 50 мл конические. Добавить 7 мл коллагеназы к ткани кусочки и переварить снова в течение 7 минут. Для супернатант трубки, добавьте 10 мл универсальное решение с различными серологическими пипетки после каждого добавления супернатанта из пищеварения. Повторяйте, пока все коллагеназы была использована 7 шагов в общей сложности. Спиновые клетки вниз на г в течение 5 минут и ресуспендируют в 20 мл DMEM для подсчета использования гемоцитометра, и место клетки на льду. Место 50 мкл клеток в растворе Голубой Трипан 75 мкл Трипановый синий, мкл PBS , хорошо перемешать до размещения 10 мкл в гемоцитометра для подсчета. Живая клетка ясно, когда мертвые клетки синим. Ожидать около 3 млн. Кастинг фибринового геля конструкций - подготовка к созданию фибрина гели сделано заблаговременно Решения, созданные в этом разделе: фибриноген маточного раствора, тромбин маточного раствора, Pluronics решение, инфаркт построить средства массовой информации. Решение стерильно фильтруют через ряд последовательных фильтров: 40 мкм ячейки сита, 0,45 мкм бутылку верхней фильтры со стеклом фильтры предварительной очистки, 0,2 мкм бутылку верхней фильтры со стеклом предварительные фильтры. Довести объем раствора до 1 л с дополнительной деионизированной водой. Стерильный фильтр с фильтром 0,2 мкм. Решение Pluronics можно использовать до трех раз, прежде чем заменять, если стерильно фильтруют после каждого использования. Соберите оправки, поставив вместе один тефлоновый стержень, один тефлоновый рукав, два тефлоновых шайбы с насечкой удалены для инъекций целях, и две резиновые уплотнительные кольца рис. Автоклав перед использованием. Возьмите 6cc корпуса шприца для внешней части плесени и 3CC корпуса шприца для использования в качестве плунжеров, и подготовить их, отрезав Луер-Лок концы и автоклавирование рис. Оставьте части замачивание в растворе Pluronics в течение часов в капюшоне, чтобы обеспечить полное покрытие. Решение Pluronics пальто оправки и предотвращает фибринового геля от присоединения к оправки. Место построено оправки в 6 корпусах вв шприц, с помощью шприца 3CC как поршень для обеспечения герметичности между уплотнительными кольцами и тефлоновые шайбы. Кастинг фибринового геля конструкций с помощью литья под давлением Решения, созданные в этом разделе: F решение, Т решение, сотовые решение. Таблицу 1. У 21G 1 дюйм игла готовы также. Решение фибрина создается в отношение F решение: T решение: ячейка решение. Чтобы сделать одну мл геля, добавьте мкл F раствора в 50 мл чистой центрифужной пробирке, а затем мкл клеточной решение, и, наконец, добавить мкл Т решение. Внесите смешивать раствор вместе будьте осторожны, чтобы не вводить пузыри. После решения смешанной, реакция началась, и инъекция конструкций должно быть сделано немедленно. Возьмите заранее подготовленный шприц с иглой 18G и составить фибрина решение. Будьте осторожны, не инвертировать шприц, чтобы предотвратить пузыри от попадания иглы. Замените 18G иглу 21G иглу. Нажмите шприц осторожно, чтобы вытеснить пузырьки воздуха. Вставьте шприц в форме между пробкой и корпусом следующий паз в тефлоновым уплотнительным кольцом и вводят раствор в форму. Tilt формы с канавкой на вершине, чтобы обеспечить полное заполнение. Удалите шприц и продолжать устранения остающихся пресс-форм. Достаточно решение гель может быть создан, чтобы заполнить несколько форм, в то же время. Однако, поскольку решение гели быстро, как правило, хорошая идея, чтобы ограничить число конструкции вводили в данный момент времени до 6. Разрешить гели для инкубации в формах в течение 20 минут, чтобы дать время гелеобразования для полимеризации. Заполните каждую банку культуры Nalgene прямой стороны банка с 21 мл инфаркта построить среды на конструкцию. Используйте стерильный шприц 3 куб. Затем поместите построить в образец банку. Каждый 16 унций банку может вместить до 6 конструкций, а каждый 4 унции банку может вместить 2. Винт крышки на банках и передавать их в инкубатор. Внутри инкубатора, ослабить ограничения на банки для обеспечения газообмена. После 24 часов, принимать стерильной зубной выбрать и нажать построить подальше от белого тефлоновые уплотнительные кольца на концах кольца формы для обеспечения равномерного выравнивания построить см. Анализ методов через 2 недели в культуре - тестирование сокращения силу Решения, используемые в этом разделе: DMEM, инфаркт построить средства массовой информации. Зажим крокодил на ближайшие приводят от стимулятора, чтобы провода на электроды в ванну. Включите плате сбора данных, генератор импульсов, и датчик силы. Датчик силы должен быть переключен в настройке 5г и обнуляется. Открытое пользовательской программы LabView, которая отображает и сохраняет данные из датчик силы. Создать новый, пустой текстовый файл в папку данных для каждого образца. Удалить построить по образцу банка, мягко скользящего построить кольцо из тефлона поддержки с помощью пинцета и месте построить более стационарных пунктов металла в системе силы ванны среды измерения. Не сжимайте построить с помощью пинцета! Скорее всего, использовать пинцет, чтобы подтолкнуть и поднять построить прочь оправки поддержки. Место другом конце построить свыше датчик руку и затянуть до преобразователя читает 0. Осторожно снимите построить по системе силы ванны среды измерения и поместить его обратно в культуральной среде. Вырезать построить и развернуть его так, что вы можете измерить длину и ширину построить Вырезать построить на разделы, которые будут использоваться для дополнительных измерений, включая анализ жизнеспособности, гистология, или западной измерений пятно. Добавьте 20 мкл 2 мМ EthD-1 маточного раствора до 10 мл стерильной PBS и вихревые для обеспечения тщательного перемешивания. Опять же, вихрь для обеспечения тщательного перемешивания. Добавьте достаточно объема выше решение, чтобы покрыть конструкцию. Инкубируйте покрытием для предотвращения фотообесцвечивания красителей в течение 30 минут при комнатной температуре. Удалить красителей и заменить теплым PBS. Наблюдать и записывать изображения с флюоресцентного микроскопа. Промыть образцов с 3-кратным 5 минут моет в PBS. Образец теперь может быть встроен, секционные и окрашенных в соответствии с протоколом выбора. Оставшаяся часть этого протокола охватывает весь построить окрашивания для работы с изображениями с конфокальной микроскопии. Обратите внимание, что инкубационный раза длиннее, чем у секционного ткани, как там должно быть больше времени на антитела к диффундировать в конструкцию. Кроме того, все остальные действия проводятся при комнатной температуре. Промыть образцов с 3-кратным 10 минут моет в PBS. Добавить коннексин 43 разведение и тяжелой цепи миозина разведение первичных антител в ФБР, чтобы образцы в течение 3 часов. Для того, чтобы маркировать как белки последовательно вы должны убедиться, что первичные антитела из разных хостов например, кроликов и мышей. Добавить соответствующие флуоресцентно меченых вторичных антител в PBS в течение 3 часов. Анализ образцов экспрессию МНС и Cx43 по визуализации клеток с конфокальной микроскопии см. Рисунок 1: Обзор процесса инкапсуляции Рисунок 2: отдельные и комбинированные формы частей для создания фибрина гели. Play Video. Cite this Article Ye, K. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. Please enter your institutional email to check if you have access to this content. Please create an account to get access. Forgot Password? To receive a free trial, please fill out the form below. Not your institution? A JoVE representative will be in touch with you shortly. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Thank You. Please enjoy a free hour trial. In order to begin, please login or create an account. Please click here to activate your free hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close.

Cones, Bosko, Hashish Cuba

Ставрополь

Как быстро винт выводится из крови самостоятельно…

Купить Анашу Рузаевка

Хадыженск купить MDMA Pills - RED

Купить кокс Бодрум