Исследование системы гомеостаза железа и развития окислительного стресса методами математического моделирования - Биология и естествознание дипломная работа

Главная

Биология и естествознание
Исследование системы гомеостаза железа и развития окислительного стресса методами математического моделирования

Исследование системы, контролирующей гомеостаз железа и развитие окислительного стресса у млекопитающих. Экспериментальное изучение параметров, связанных с развитием окислительного стресса и метаболизмом железа, при развитии асцитной гепатомы Зайделя.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

В постгеномную эру основной задачей системной биологии является исследование принципов организации и функционирования сложных молекулярно-генетических сетей, обеспечивающих формирование фенотипических (молекулярных, биохимических, физиологических, морфологических, поведенческих и др.) характеристик организмов. Развитие высокоэффективных методов молекулярной биологии привело к накоплению огромного числа экспериментальных данных по структурно-функциональной организации генных сетей и их молекулярно-генетических компонент. Анализ этих экспериментальных данных принципиально невозможен без использования современных информационных технологий и эффективных математических методов анализа данных и моделирования биологических систем и процессов. Это необходимо для понимания принципов их организации, молекулярных механизмов функционирования, закономерностей эволюции, оценки влияния мутаций на функцию генных сетей. Таким образом, теоретическое исследование динамики генных сетей методами математического моделирования приобретает в настоящее время фундаментальное и первоочередное значение.
Целью данной работы было исследование системы, контролирующей гомеостаз железа и развитие окислительного стресса у млекопитающих. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Создание формального описания и математической модели системы клеточного гомеостаза железа.
2. Создание формального описания и математической модели системы, контролирующей гомеостаз железа организма в целом в норме и при развитии окислительного стресса.
3. Изучение с помощью численных методов динамики системы, контролирующей гомеостаз железа и развитие окислительного стресса.
4. Экспериментальное изучение динамики параметров, связанных с развитием окислительного стресса и метаболизмом железа, при развитии асцитной гепатомы Зайделя.
Математическая модель, созданная в ходе данной работы, будет полезна для исследования системы гомеостаза железа у млекопитающих в норме и при патологии, а также процесса доставки лекарств, в частности, в ходе химиотерапии.
1. 1 Роль железа в развитии окислительного стресса
Уникальная способность железа изменять своё состояние окисления и окислительно-восстановительный потенциал в ответ на смену состава окружающих лигандов делает этот металл необходимым почти всем живым существам. Железо легко вступает в одноэлектронные окислительно-восстановительные реакции, переходя при этом между Fe 2+ и Fe 3+ состояниями. Железосодержащие белки являются ключевыми компонентами многих биологических процессов, таких как энергетический обмен, транспорт кислорода, репликация и репарация ДНК, нейтрализация активных форм кислорода и многих других, катализируемых ферментами оксигеназами, пероксигеназами и.т.п. Однако те же самые химические свойства железа делают его опасным для организма. Даже малое количество “свободного” железа может катализировать образование высокотоксичных радикалов посредством цикла реакций Фентон/Хабер-Вейса. В присутствии перекиси водорода железо катализирует образование гидроксил радикалов (уравнение 1) - реакция Фентона. Далее окисленный металл может быть восстановлен супероксид радикалом (уравнение 2). Суммарная реакция называется реакцией Хабер-Вейса (уравнение 3). Она может происходить и в отсутствии переходных металлов, но присутствие железа значительно увеличивает скорость реакции [1]. Взаимодействие гидроксил радикала с компонентами клетки может приводить к окислению белков, липидов, липопротеинов, нуклеиновых кислот, углеводов.
Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + - OH + * OH (уравнение 1),
Fe 3+ + O 2 *- Fe 2+ + O 2 (уравнение 2),
H 2 O 2 + O 2 *- - OH + * OH + O 2 (уравнение 3).
Так как “свободное” железо опасно, но в тоже время жизненно необходимо для организма, существует система, контролирующая его уровень. В нормальном состоянии доля железа, доступного для продукции свободных радикалов, составляет 3-5% от общего количества железа клетки. Эта часть также называется хелатируемым железом (chelatable iron) или лабильным пулом железа(labile iron pool). Лабильный пул железа содержит обе ионные формы железа (Fe 2+ и Fe 3+ ), связанные с низкой аффинностью с лигандами разной природы: цитратом, фосфатом, углеводами и карбоксилатами, нуклеотидами, нуклеозидами, полипептидами и фосфолипидами [2,3].
Систему гомеостаза железа в организме можно разделить на два основных уровня организации: клеточный гомеостаз, включающий в себя процессы, происходящие на уровне клетки, и системный, охватывающий процессы, происходящие в организме в целом. Оба уровня характеризуются определенным набором белков, веществ и констант реакций, описывающих кинетику их взаимодействий.
Клеточный гомеостаз железа опосредуется процессами транспорта железа в клетку, его запасания, внутриклеточного перераспределения и экспорта из клетки в интерстиций и циркуляторное русло. На Р ис . 1 представлена схема поддержания клеточного гомеостаза железа.
Рисунок 1 . Схема поддержания клеточного гомеостаза железа. Комплекс трансферрина с Fe 3+ связывается с TfR1 и TfR2 на поверхности клеточной мембраны. Эти комплексы подвергаются эндоцитозу. Кислая среда эндосом приводит к диссоциации Fe 3+ от трансферрина. Fe 3+ восстанавливается редуктазой Steap3 перед тем как транспортироваться из эндосом посредством DMT1(divalent metal transporter 1). Рецепторы и их комплексы с трансферрином возвращаются на клеточную мембрану, где могут вступать в новый цикл эндоцитоза. DMT1 также находится на апикальной мембране энтероцитов, где транспортирует в клетку Fe 2+ , восстановленный редуктазой DCYTB. Железо, поступившее в клетку входит во внутриклеточный лабильный пул железа. Белки IRP реагируют на изменение количества железа в этом пуле и регулируют трансляцию мРНК, содержащих IRE в 5'-UTR (H- и L-ферритин, eALAS, m-aconitase, ferroportin), и стабильность мРНК, содержащих IRE в 3'-UTR (TfR1 и DMT1) (взято из [16]).
Клетки млекопитающих способны получать железо из плазмы крови, где, в нормальном состоянии, большая часть железа находится в комплексе с трансферрином. Большинство клеток способно получать железо из этого комплекса посредством рецептор-индуцируемого эндоцитоза (рецепторы TfR1 и TfR2). Однако, для некоторых типов клеток, таких как гепатоциты, клетки меланомы, характерен дополнительный, трансферрин-независимый путь потребления железа. Гепатоциты способны получать железо из комплекса с ферритином, гем-гемопексином, гемоглобин-гаптоглобином также посредством рецептор-индуцируемого эндоцитоза [4, 5]. Альтернативная система потребления железа, имеющая место в эпителиальных клетках, представлена белком липокалином и его рецептором [6].
Транспорт железа в клетку посредством трансферринового рецептора 1 (TfR1) изучен лучше, чем процессы, связанные с TfR2. Трансферрин - гликопротеид, содержащийся в большом количестве в плазме крови и с высокой аффиностью связывающий две молекулы Fe 3+ . При внеклеточном pH~7.4 холотрансферрин (трансферрин, связанный с двумя молекулами железа) способен быстро связываться с TfR1. Более высокое сродство холотрансферрина к TfR1 приводит к вытеснению апотрансферрина (не связанного с железом трансферрина) из комплекса с рецептором [7]. TfR1 рецептор-индуцируемый эндоцитоз происходит в окаймленных ямках - специальных структурных образованиях на плазматической мембране. Следует заметить, что TfR1 конститутивно концентрируется в окаймленных ямках и подвергается эндоцитозу даже в отсутствие лиганда [8]. Вследствие инвагинации окаймленной ямки внутрь клетки формируется окаймленный пузырек, который быстро теряет клатриновую оболочку и превращается в эндоцитозный пузырек. Он, в свою очередь, сливается с ранними эндосомами, где поддерживается низкий pH за счет работы протонных насосов [9]. Кислая среда вызывает конформационные изменения как в молекуле TfR1, так и в трансферрине, что приводит к диссоциации трехвалентного железа от комплекса. При этом трансферрин остается связанным c рецептором. Далее редуктаза Steap3 восстанавливает Fe 3+ до Fe 2+ [10], которое транспортируется из эндосомы в цитоплазму с помощью белка DMT-1. TfR1 в комплексе с апотрансферрином возвращается на плазматическую мембрану, где может вступать в новый цикл эндоцитоза.
Потребление клетками железа из комплекса с трансферрином может также осуществляться посредством рецептора второго типа - TfR2. В то время как известно, что TfR1-зависимый транспорт железа является основным путем доставки его в клетку, роль TfR2 до сих пор изучена слабо. Несмотря на большую гомологию этих рецепторов, TfR2 значительно отличается по своим свойствам и функциям от TfR1. В то время как TfR1 экспрессируется почти во всех тканях организма, экспрессия TfR2 тканеспецифична и происходит в основном в печени и в меньшей степени в селезенке, легких, мышцах и предстательной железе. В отличие от TfR1, рецептор второго типа локализуется на поверхности мембраны не в ямках, окаймленных клатрином, а в кавеолах, образуемых белком кавеолином. Что, по-видимому, и приводит к различиям во внутриклеточной локализации этих рецепторов [8]. TfR2 характеризуется меньшим сродством и меньшей специфичностью по отношению к различным формам трансферрина [11]. Также было показано, что этот путь транспорта не насышается трансферрином, по крайней мере, вплоть до концентрации трансферрина в 2 µM [12]. Недавно было обнаружено, что холотрансферрин стабилизирует TfR2, предотвращая его попадание в лизосомы, где он деградирует. Это привело к формированию гипотезы о том, что рецептор второго типа может играть роль сенсора железа в плазме крови [13, 14, 15]. Более подробно этот процесс будет рассмотрен в разделе 2.2. " Системный гомеостаз железа ".
Хотя трансферрин-зависимое потребление железа превалирует в нормальном состоянии, при патологиях, сопровождающихся увеличением концентрации железа, не связанного с трансферрином, возможен другой, трансферрин-независимый путь. Как уже упоминалось выше, железо, не связанное с трансферрином, в плазме крови связано с низкой аффиностью с лигандами различной природы [2,3]. Некоторые клетки, к примеру, гепатоциты, способны получать железо из этих комплексов. Вне зависимости от формы железа, не связанного с трансферрином, на первом этапе происходит связывание с поверхностью клетки, где железо диссоциирует из комплекса с лигандом. Далее может происходить восстановление железа посредством неизвестной на данный момент гипотетической редуктазы. Считается, что доставка восстановленного железа в клетку осуществляется посредством транспортера, природа которого на данный момент не известна, но наиболее вероятными кандидатами являются белки DMT1, ZIP14 и кальциевые каналы [5].
Основным местом запасания железа в организме являются клетки печени - гепатоциты. Макрофаги печени, селезенки и костного мозга также депонируют некоторую, но гораздо меньшую часть железа, полученного из фагоцитируемых ими эритроцитов. Большая часть железа печени находится в комплексе с белком ферритином или гемосидерином (примерно 80%), 5% ассоциировано с трансферрином, 2% - с гемом, а оставшаяся часть находится в лабильном пуле железа.
Железо, поступившее в клетку, попадает во внутриклеточный лабильный пул железа, откуда может образовывать комплекс с ферритином, гемом, другими железосодержащими белками или экспортироваться из клетки. железо стресс окислительный гомеостаз
Ферритин - гидрофильная молекула, состоящая из 24 субъединиц, формирующих полую сферу. Внутри этой сферы может разместиться до 4500 атомов железа. Субъединицы ферритина могут быть двух типов: тяжелые и легкие. Соотношение тяжелых и легких субъединиц варьируется в зависимости от типа клеток и физиологического статуса. Тяжелая субъединица ферритина обладает ферроредуктазной активностью. Синтез ферритина индуцируется при высоком уровне внутриклеточного железа и подавляется при нехватке железа. Эта регуляция опосредуется IRE-IRP системой, которая будет описана ниже. Также, синтез ферритина регулируется на уровне транскрипции цитокинами, такими как интерферон-г, интерлейкин 1 и интерлейкин 6. Деградация ферритина и, следовательно, высвобождение железа, помогает мобилизовать железо для нужд клетки. О деградации ферритина известно немного, но в этот процесс вовлечены как протеосомный, так и лизосомный аппарат клетки.
Гемосидерин - нерастворимая в воде молекула, присутствующая в лизосомах, и, по-видимому, являющаяся промежуточным продуктом деградации ферритина. Железо, хранящееся в комплексе с гемосидерином, гораздо менее доступно и менее эффективно в продукции свободных радикалов, чем в комплексе с ферритином.
Некоторые клетки млекопитающих, такие как энтероциты двенадцатиперстной кишки, макрофаги, гепатоциты и клетки центральной нервной системы обладают системой контроля экспорта железа. На данный момент в литературе известен только один экспортер железа - белок ферропортин. Этот транспортер переносит железо через клеточную мембрану в восстановленной форме. В плазме крови железо окисляется различными феррооксидазами прежде чем свяжется с трансферрином. Чаще всего в роли оксидазы выступает церулоплазмин, в случае энтероцитов - гефестин, а в случае астроцитов - гликозилфосфатидилинозитольная форма церулоплазмина, непосредственно взаимодействующая с ферропортином.
Регуляция клеточного гомеостаза железа
Система белков, участвующих в клеточном гомеостазе железа, регулируется на нескольких уровнях: транскрипции генов, стабильности мРНК, трансляции мРНК и посттрансляционной модификации белков.
Посттранскрипционный уровень регуляции наиболее хорошо изучен. Многие мРНК, кодирующие белки, вовлеченные в поддержание гомеостаза железа, содержат в нетранслируемой части последовательности IRE (iron-responsive element).
IRE - консервативные последовательности, образующие шпильки, с которыми взаимодействуют специальные регуляторные белки IRPs (iron regulatory proteins). IRE последовательности располагаются в 5'-нетранслируемых регионах (5'-UTR) мРНК таких белков как тяжелая и лёгкая субъединицы ферритина, ферропортин (FPN), ALAS-E (5-aminolevulinic acid synthase) и митохондриальная аконитаза. Образование IRE/IRP комплекса на 5'-UTR приводит к ингибированию ранних этапов трансляции. IRE также встречаются в 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) мРНК таких белков как рецептор трансферрина первого типа (TfR1) и DMT1. Образование IRE/IRP комплекса на 3'-UTR приводит стабилизации мРНК [16, 17].
Всего на данный момент описаны два вида IRP белков: IRP1 и IRP2, которые являются ключевыми сенсорами цитоплазматического железа. При недостатке железа в клетке IRP связываются с IRE, ингибируя трансляцию с участием мРНК, содержащих IRE в 5'-UTR, и стабилизируя мРНК, содержащие IRE в 3'-UTR. Регуляция активности связывания IRP c IRE различна для IRP1 и IRP2. При недостатке железа в клетке IRP1 связывается с IRE с высокой аффиностью, а при повышении уровня железа в IRP1 собирается кластер 4Fe-4S, что приводит к утрате высокой аффинности и приобретению аконитазной активности. Повышение уровня активных форм кислорода приводит к разборке 4Fe-4S кластера, а, следовательно, к включению IRE-связывающей активности IRP1. Фосфорилирование IRP1 регулирует его активность, что является железо-независимым путем контроля [18, 16].
Несмотря на высокую гомологию IRP белков, IRP2 не проявляет аконитазной активности и не способен связывать 4Fe-4S кластер. Активность IRP2 регулируется на посттрансляционном уровне. В отличие от IRP1, IRP2 содержит определенную N-концевую последовательность, являющуюся сенсором железа. Три из пяти цистеинов этой последовательности координируют ион железа, а один из них способен окисляться, формируя дигидроцистеин, что приводит к убиквитинированию и последующей деградации с участием протеосом. N-концевая последовательность может связываться с гемом, индуцируя кислород-зависимое окисление и последующую деградацию IRP2 [19]. Активность IRP2 также регулируется фосфорилированием, что приводит к повышению аффинности связывания с IRE [18, 16].
Важной составляющей регуляции системы, поддерживающей гомеостаз железа, является контроль на уровне транскрипции. Экспрессия генов таких белков, как тяжелая субъединица ферритина, рецептор трансферрина первого типа (TfR1), гепсидин и ферропортин, регулируется цитокинами интерфероном-г, интерлейкином 1 и 6, а также фактором некроза опухоли б (TNFб). Гипоксия также является важным фактором, который способен вносить коррективы в реализацию информации генов TfR1, CP (церулоплазмин), FPN (ферропортин), DCYTB (дуоденальный цитохром В), HAMP (гепсидин), по-видимому, посредством активации индуцируемого гипоксией транскрипционного фактора HIF-1 (hypoxia-inducible factor 1) [17, 5].
Помимо этого, описано несколько посттрансляционных механизмов регуляции белков этой системы. Ферропортин посттрансляционно регулируется гепсидином, который способен индуцировать его вхождение в цитоплазму и деградацию [20]. Рецептор трансферрина второго типа регулируется степенью насыщения трансферрина железом: холотрансферрин ингибирует деградацию TfR2 и, таким образом, повышает стабильность белковой молекулы [21, 22]. Высокий уровень железа резко снижает представленность белка-транспортера железа DMT1 в апикальной мембране энтероцитов и индуцирует его вхождение в цитозольные везикулы [5]. Фосфорилирование рецептора трансферрина первого типа протеин киназой С уменьшает его количество на клеточной мембране [5].
В среднем человек содержит 4 грамма железа. В нормальном состоянии 1-2 мг железа каждый день потребляется из пищи дуоденальными энтероцитами. Железо, абсорбированное энтероцитами, по мере необходимости поступает в плазму крови, где связывается с переносчиком - трансферрином. Если такой необходимости нет, то железо остается в энтероцитах и позже выводится из организма черех ЖКТ в составе клеток, отторгнутых по мере износа. Примерно 3 мг железа циркулирует в комплексе с трансферрином. Это железо потребляется многими клетками, в основном посредством TfR1-зависимого рецептор-индуцируемого эндоцитоза. Большая часть этого железа предназначена для развивающихся эритроцитов костного мозга, где оно потребляется со скоростью примерно 22 мг в день и используется для синтеза гемоглобина. Большая часть железа организма (65-70%) находится в циркулирующих эритроцитах. Старые или поврежденные красные кровяные клетки удаляются из циркуляции макрофагами ретикуло-эндотелиальной системы, где железо высвобождается из гемоглобина и экспортируется обратно в плазму или запасается в комплексе с ферритином. Клетки ретикуло-эндотелиальной системы высвобождают в плазму примерно 22 мг железа в день, что компенсирует потребление клетками костного мозга. Другие клетки потребляют железо из плазмы в небольшом количестве для синтеза железосодержащих белков, таких как гем-содержащие цитохромы и содержащие железо-серный кластер белки. Примерно 10-15% железа организма содержится в этих белках. Оставшиеся 20% содержатся в “запасниках”, преимущественно в макрофагах и гепатоцитах. Потеря железа организмом происходит за счет слущивания клеток кожи и слизистой, а также при кровопотере [23].
Транспорт железа между описанными выше компартментами - строго контролируемый процесс, который может регулироваться в соответствии с потребностями организма. Отдельные клетки поддерживают должный внутриклеточный уровень железа, изменяя активность соответствующих белков на различных уровнях (см. 2.1.5. "Регуляция клеточного гомеостаза железа" ). Помимо такой “внутренней” регуляции, клеточный транспорт железа может контролироваться извне системными регуляторами, что наиболее характерно для клеток ретикуло-эндотелиальной системы, клеток печени и энтероцитов тонкой кишки. Открытие новых регуляторов метаболизма железа, таких как белок гемохроматоза (HFE), гепсидин, гемоювелин (HJV) и TfR2 выявило сложность системы поддержания гомеостаза железа, но, в тоже время, помогло улучшить общее понимание работы этой системы. Как эти регуляторы взаимодействуют с системой транспорта железа в местах его абсорбции, использования и запасания, чтобы поддерживать баланс железа в организме будет описано ниже.
Ключевым моментом в понимании регуляции системного гомеостаза железа было открытие регуляторного белка гепсидина. Этот небольшой пептид синтезируется гепатоцитами и секретируется в плазму крови, где ингибирует экспорт железа из различных типов клеток в кровь. Продукция гепсидина понижается в ответ на стимулы, усиливающие экспорт железа из клеток (недостаток железа, высокий уровень эритропоэза) и повышается в состоянии, когда необходимо снизить экспорт железа в системное русло (избыток железа в крови, воспаление). Гепсидин способен непосредственно взаимодействовать с ферропортином на поверхности клеточной мембраны и индуцировать его вхождение в цитоплазму и последующую деградацию, понижая, таким образом, скорость экспорта железа из клетки [24]. На данный момент известно четыре регуляторных пути, контролирующих продукцию гепсидина: (1) регуляция в ответ на изменение общего уровня железа, (2) регуляция в ответ на изменение интенсивности эритропоэза, (3) регуляция в ответ на воспаление и (4) “обязательный” сигнальный путь (mandatory signaling pathway).
Как принято считать на данный момент, индикатором общего уровня железа в организме является степень насыщения трансферрина железом в плазме крови. Путь передачи этого сигнала на гепсидин ясен не до конца, хотя недавние работы по изучению взаимодействий трансферрина и HFE c TfR1 и TfR2 привели к гипотетической модели, в которой циркулирующее железо, связанное с трансферрином, влияет на формирование комплекса HFE с TfR2 на поверхности гепатоцитов. Этот комплекс способен увеличивать продукцию гепсидина, посредством пока неизвестного внутриклеточного сигнального пути [25, 26]. Рецептор трансферрина второго типа стабилизируется холотрансферрином, что приводит к увеличению количества TfR2 на клеточной мембране при повышении уровня этой формы белка [21, 22]. HFE и трансферрин связываются с рецептором трансферрина первого типа на частично перекрывающихся сайтах и конкурируют за связывание. Увеличение уровня холотрансферрина приводит к вытеснению HFE из комплекса с трансферрином, и, как следствие, к перемещению HFE из эндосом, содержащих TfR1, на плазматическую мембрану. Высвобождение TfR1 из комплекса с HFE приводит к усилению транспорта железа в клетку. HFE, вытесненный из комплекса с TfR1, связывается с рецептором трансферрина второго типа, формируя комплекс, предположительно передающий сигнал на гепсидин [27, 25, 26] (cм. Р ис . 2 ).
Рисунок 2 . Механизм регуляции гепсидина при повышении насыщения трансферрина железом в плазме крови. В норме TfR1 и HFE присутствуют в виде комплекса на клеточной мембране (A'). Холотрансферрин и HFE конкурируют за связывание с TfR1. В результате повышения насыщения трансферрина HFE диссоциирует из комплекса c TFR1 (Б'). Теперь HFE связывается с TfR2, образуя комплекс, передающий сигнал на гепсидин (В') (взято из [25]).
В случае гипоксии или анемии низкое давление кислорода индуцирует стабилизацию фактора гипоксии HIF-1б, что приводит к продукции эритропоэтина почкой. Эритропоэтин усиливает интенсивность эритропоэза и, таким образом, потребность железа костным мозгом. Это приводит к мобилизации железа из запасников и усилению абсорбции энтероцитами посредством понижения уровня гепсидина, несмотря на уровень железа в плазме. Это наводит на мысль, что регуляция в ответ на изменение интенсивности эритропоэза осуществляется посредством фактора, передающего сигнала из костного мозга в гепатоциты на гепсидин. Возможными кандитатами на эту роль могут быть растворимая форма рецептора трансферрина первого типа и GDF-15 (Growth Differentiation Factor 15) [26].
Третий путь регуляции гепсидина контролируется воспалением. Этот путь индуцируется преимущественно интерлейкином 6, вследствие чего активируется Jak/Stat путь передачи сигнала в ядро и осуществляется регуляция экспрессии гена гепсидина. Взаимодействие между воспалением и регуляции посредством HJV/BMP через Stat3 и Smad белки в результате воздействия фактора роста TGF-в иллюстрирует координированную работу сигнальных каскадов, участвующих в регуляции экспрессии гепсидина [26, 28].
Недавние исследования показали, что регуляция гепсидина при изменении общего уровня железа и интенсивности эритропоэза зависит от активности дополнительного пути, который контролируется белком HJV(гемоювелином). Предположительно, гемоювелин поддерживает передачу сигнала посредством BMP/Smad пути сигнальной трансдукции. Мутации HJV приводят к нарушению обоих путей сигнализации [26].
При исследование промоторной области гена гепсидина были найдены сайты связывания различных транскрипционных факторов, таких как С/EBPб, HNF4б, USF, p53, роль которых в регуляции экспрессии гепсидина не до конца понятна [26].
Люминол, HEPES, TRIS•HCl (“Агат-Мед”, Россия); гепарин (“Спофа”, Чехия); иммуноферментные наборы для определения трансферрина (“APTEC”, Германия); декстран, трипановый синий (“Sigma”, США); верографин (“Leiras”, Germany).
В качестве объекта исследования была выбрана модель развития асцитной гепатомы Зайделя. В экспериментах in vivo использовали крыс-самцов линии Вистар весом 200-220 г. Клетки гепатомы Зайделя трансплантировали в брюшную полость животного путем введения 1 мл ресуспендированых в солевом буфере клеток в концентрации 1•10 7 кл/мл. Продолжительность жизни животного с трансплантированной опухолью составляла 12-14 суток. При исследовании соотношения параметров про- и антиоксидантных систем плазмы крови и асцита ежесуточно производили декапитацию животных с целью забора образцов асцита и крови.
Полиморфноядерные лейкоциты (ПМЯЛ) из циркулирующей крови крыс выделяли в градиенте плотности фикол/верографин [29]. Для этого согласно протоколу кровь, обработанная гепарином (из расчета 200 мкл раствора гепарина с NaCl, 5000 ед. на 10 мл крови) и смешанная с физиологическим раствором в отношении 2:1, была наслоена на смесь 6% раствора декстрана Т-500 и 33,9% раствора верографина в отношении 1:2. Спустя 30 мин, после оседания агрегированных эритроцитов, отбирали плазму (верхний слой) богатую лейкоцитами и разделяли её далее на двойном градиенте фикол-верографин: первый градиент (верхний слой) - верографин (10 частей 33,9%-го раствора) - фикол Т-400 (24 части, 9%-го раствора), плотность 1,070 г/мл; второй градиент (нижний слой) - верографин (10 частей 50%-го раствора) - фикол Т-400 (20 частей, 9%-го раствора), плотность 1,119 г/мл. Заполненные пробирки центрифугировали при 800 g в течение 15 мин. После центрифугирования наблюдались три хорошо выраженные клеточные фракции, разделенные друг от друга слоями градиента. Отбор ПМЯЛ осуществляли из средней фракции, находящейся на разделе фаз первого и второго градиентов. ПМЯЛ составили около 92% этой фракции (данные получены с использованием камеры Горяева). Выделенные ПМЯЛ дважды отмывали 10-кратным физиологическим раствором с использованием центрифуги Eppendorf 5415 при 1550 об/мин. О жизнеспособности клеток судили по окраске на стекле трипановым синим, который является индикатором погибших клеток.
2.4 Определение концентрации трансферрина в плазме крови и в асцитной жидкости опухоленосителя
Бесклеточную асцитную жидкость и плазму крови получали путем дифференциального центрифугирования асцитной жидкости и крови при 500 об/мин в течение 10 мин и затем при 14000 об/мин в течение 10 мин на Eppendorf 5415. Далее образцы замораживали при -20°С для последующего анализа.
Концентрацию трансферрина определяли с помощью иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов (“APTEC”, Германия). Измерение концентрации трансферрина проводилось в 96-луночном планшете. Калибровочная кривая строилась по контрольным образцам стандартной сыворотки (“APTEC”, Германия), содержащей трансферрин в концентрациях 7.38, 0.738, 0.0738 и 0.00738 мг/мл. Измерение оптической плотности проводилось на планшетном спектрофотометре TECAN Infinite® 200 (Швейцария) при длине волны 570 нм после добавления к 5 мкл образца 250 мкл реагента 1 (100 мМ Tрис-буфер, pH 7,5; NaCl, 180 мМ; полиэтиленгликоль (PEG); детергенты, стабилизаторы) и после добавления 50 мкл реагента 2 (100 мМ Tрис-буфер, pH 8,0; 180 мМ NaCl; антитела козы к человеческому трансферрину со стабилизаторами).
2.5 Определение параметров окислительного стресса в крови и асците
Скорость наработки активных форм кислорода (АФК) в асцитной жидкости определяли хемилюминесцентным методом. Для этого в кювету объемом 0.5 мл с буфером для регистрации помещали 5 мкл свежеотобранного асцита и 10 мкл 2 мМ люминола и регистрировали уровень хемилюминесцентного сигнала в течение 10 минут. АФК-генерирующую активность ПМЯЛ крови определяли хемилюминесцентным методом. Для этого в кювету с объемом 0.5 мл с буфером для регистрации помещали 10 мкл свежевыделенных ПМЯЛ с известной концентрацией клеток и 10 мкл 2 мМ люминола и регистрировали уровень хемилюминесцентного сигнала в течение 10 минут. Изменение концентрации оценивалось в относительных единицах.
2.6 Построение математической модели
Для построения модели использовался метод, основанный на непрерывном описании динамики систем. Формализация осуществляется на основе блочного принципа, согласно которому моделируемая система расчленяется на элементарные подсистемы, каждая из которых описывается изолированно от других. Описание элементарных подсистем проводится в терминах элементарных процессов. Элементарные процессы описываются на основе формальных блоков. Формальные блоки однозначно характеризуются упорядоченным списком формальных динамических переменных X, упорядоченным списком формальных параметров P и законом преобразования информации F. Для описания биохимических реакций, активного и пассивного переноса веществ используется принцип химической кинетики. В условиях полного перемешивания эти процессы можно описывать на основе закона действующих масс, что в общем случае приводит к системам обыкновенных дифференциальных уравнений. В этом случае динамическими переменными являются концентрации соответствующ
Исследование системы гомеостаза железа и развития окислительного стресса методами математического моделирования дипломная работа. Биология и естествознание.
Курсовая работа: Разработка мероприятий по совершенствованию организации основного производства ООО Рос-Мебель
Мировые религии (буддизм, христианство, ислам), их краткая характеристика
Реферат: Poverty Essay Research Paper The PovertyPoverty is
Доклад по теме Дисгармония сексуальная
Курсовая работа по теме Психолого-социальный аспект работы с семьей, воспитывающей ребенка с ограниченными возможностями
Реферат На Тему Кредитные Потребительские Кооперативы Граждан, Процедуры Проведения Ревизии
Реферат по теме Правосубъектность юридического лица
Реферат по теме Агван Доржиев
Использование Основных Средств Курсовая
Социальная Экономика Курсовая
Запись На Итоговое Сочинение 9 Класс
Реферат: Гортанна ангіна, набряк гортані, перихондрит
Эссе по теме Невидимая партия
Курсовая работа: Синтаксический анализатор полиномов
Қазақстан Құқықтық Мемлекет Эссе
Реферат по теме Эколого-геохимическая оценка горнорудного района (на примере Садоно-Унальской котловины, республика Северная Осетия-Алания)
Курсовая работа по теме Библиотека и семья
Курсовая работа по теме Расчет параметров трехфазного синхронного генератора
Әлемнің Жаңа Жеті Кереметі Тақырыбында Эссе Жазу
Понятие Преступности Эссе
Анатомия и морфология стебля - Биология и естествознание презентация
Экономическая оценка морального ущерба работника от несчастного случая на производстве (на примере ОАО "Черномортранснефть") - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда реферат
Изучение токсического влияния кадмия на активность аминотрансфераз у потомства белых крыс - Биология и естествознание дипломная работа