Использование метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для детекции хантавирусной РНК - Биология и естествознание статья
Главная
Биология и естествознание
Использование метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для детекции хантавирусной РНК
Сущность и содержание метода полимеразной цепной реакции, особенности его использования в реальном времени для диагностики различных, в том числе и вирусных, заболеваний. Актуальность и этапы разработки быстрых и эффективных диагностических тестов.
посмотреть текст работы
скачать работу можно здесь
полная информация о работе
весь список подобных работ
Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Использование метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для детекции хантавирусной РНК
В настоящее время метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени широко используется для диагностики различных, в том числе и вирусных, заболеваний. Предлагаемая методика позволит проводить диагностику ГЛПС за довольно непродолжительное время. Методика включает в себя ПЦР в реальном времени, совмещенную с предварительной реакцией обратной транскрипции вирусной РНК и построением кДНК. Особенностью методики является проведение обеих реакций с помощью одного фермента - термостабильной ДНК-полимеразы Thermus thermophilus, которая обладает обратнотранскрибирующей активностью в присутствии ионов Mn І+ и полимеразной активностью в присутствии ионов MgІ+.
Башкортостан был и остается одним из самых крупных в мире районов-очагов ГЛПС. Возбудителями ГЛПС являются вирусы рода Hantavirus (семейство Bunyaviridae), которые подразделяются на несколько различных серотипов. Изоляты, выделенные в Башкортостане (Tkachenko et al., 1984), относятся к серотипу Puumala, представители которого вызывают менее тяжелые формы ГЛПС, нежели, например, серотип Hantaan. Однако, за последние несколько десятилетий (с момента регистрации ГЛПС в 1957 г.), эпидемиологическая картина мало изменилась. ГЛПС по заболеваемости занимает первое место среди природно-очаговых инфекций в РФ. Число зарегистрированных случаев в отдельные годы может достигать 20 тысяч и более, нередки летальные исходы (Морозов, 2001; Ткаченко, Дроздов, 2002). Поэтому разработка быстрых и эффективных диагностических тестов является актуальной проблемой.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени имеет несколько преимуществ перед обычной ПЦР (Klein, 2002; Tse, Capeau, 2003, Mackay, 2004):
1. возможность наблюдения за накоплением целевого продукта в данный момент на любой из стадий реакции амплификации
2. отсутствие постреакционных манипуляций для детекции образования целевого продукта (электрофоретический анализ и пр.), и, вследствие этого
3. сокращение времени от начала проведения ПЦР до получения конечного результата.
При этом, с использованием новой термостабильной ДНК-полимеразы Thermus thermophilus (Tth-полимеразы), появилась возможность проводить построение кДНК и последующую ее амплификацию в одной пробирке (Myers, Gelfand, 1991), опять же, значительно сокращая время проведения реакции.
Рибоолигонуклеотид. Для постановки модельных экспериментов был синтезирован 35-членный рибоолигонуклеотид HVIRNA (НПФ «СИНТОЛ», Москва.), соответствующий консервативному участку S-сегмента РНК хатавируса штамма CG-1820 / Уфа-83 (серотип Puumala):
5' - UGGCAUUUACAUCAAGGACAUUUCCAUACCUAAGG-3'
Праймеры. Для проведения синтеза кДНК использовался 16-членный праймер HV1, соответствующий участку с 288 по 303 нуклеотид «+» цепи кДНК S-сегмента штамма CG-1820 / Уфа-83:
или соответствующий тому же участку кДНК праймер HV1-FAM (или его 21-членный аналог HV11-FAM), меченый флуоресцентным красителем карбоксифлуоресцеином (место модификации указано заглавной буквой):
5' - taggTatggaaatgtc-3' (5' - aggcttaggTatggaaatgtc-3').
Для последующей амплификации полученной кДНК использовались пары праймеров HV1/HV3 и HV1-FAM/HV3-ROX соответственно. Праймер HV3 комплементарен участку с 304 по 320 нуклеотид «+» цепи кДНК S-сегмента штамма CG1820 / Уфа-83:
Праймер HV3-ROX комплементарен тому же участку кДНК и мечен флуоресцентным красителем карбокси-Х-родамином:
Праймеры HV1 и HV3 были синтезированы в нашей лаборатории, праймеры с флуоресцентной меткой - НПФ «СИНТОЛ», Москва.
Для детекции результатов в реальном времени в реакции с немечеными праймерами использовали интеркалирующий флуоресцентный краситель SYBR Green I (Molecular Probes, USA), специфичный для двуцепочечной ДНК, который добавлялся непосредственно в реакционную смесь.
Ферменты. Синтез кДНК и последующая ПЦР проводились с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы Thermus thermophilus - Tth-полимеразы («Сибэнзим», Новосибирск). Важным моментом является способность Tth-полимеразы вести обратную транскрипцию. Нужно отметить, что этой способностью Tth-полимераза обладает только в присутствии ионов Mn І+, а для полимеразной активности необходимы ионы MgІ+(Гребенникова и др., 1995). Поэтому, при проведении реакции, после стадии построения кДНК в буферной системе, содержащей ионы Mn І+, в реакционную смесь добавлялись ионы MgІ+ в достаточной для полимеразной активности фермента концентрации.
Синтез кДНК и ПЦР в реальном времени. Синтез комплементарной модельному рибоолигоонуклеотиду ДНК и последующую амплификацию полученной кДНК проводили в приборе iCycler iQ фирмы Bio-Rad (USA), в 30 мкл реакционной смеси, содержащей буфер для реакции обратной транскрипции (1 х 50мМ Tris-HCl, pH=8,5/25єС; 100мM KCl, 0,5мM MnCl2), 0,25 ммоль смеси dNTP, 40 пкмоль каждого праймера (т.к. обе реакции идут друг за другом, то в реакционную смесь добавляется сразу пара праймеров), 1 пкмоль рибоолигонуклеотида и 1-2 ед. Tth-полимеразы. Критической стадией при проведении данной реакции является стадия отжига праймера-затравки на рибоолигонуклеотидной матрице и последующее построение кДНК. Поэтому время для проведения этих операций было сознательно завышено и составило 5 мин. на каждую стадию: первая стадия - отжиг праймера при 32єС - 5 мин., синтез кДНК при 50єС - 5 мин., затем в реакционную смесь добавляли MgCl2 до конечной концентрации 10мМ и проводили вторую стадию - 25 циклов - 80єС -4 с., 32єС - 8 с. Вся реакция, включая и время на добавление в реакционную смесь ионов MgІ+, занимает менее одного часа.
Параллельно для наглядности и сравнения эффективности методов проводились ПЦР в реальном времени с кДНК, полученной с помощью двух обратных транскриптаз: M-MLV-обратная транскриптаза, фирмы «Силекс» и AMV Reverse Transcriptase, фирмы «Promega». Синтез кДНК проходил на той же самой рибоолигонуклеотидной матрице в общем объеме 20 мкл при разбавлении ее в 10 раз. Реакционная смесь состояла из буфера (для M-MLV - обратной транскриптазы: 1 х 70мМ Tris-HCl, pH=8,3/25єС, 16,6мМ (NH4) 2SO4, 75мM MgCl2; для AMV - обратной транскриптазы: 1 х 25мМ Tris-HCl, pH=8,3/25єС, 25мМ KCl, 5мМ MgCl2, 0,25мМ спермидин, 5мМ DTT), 0,25 ммоль смеси dNTP, 10 пкмоль праймера HV1 или HV1-FAM (HV11-FAM), 1 пкмоль рибоолигонуклеотида и 10 ед. обратной транскриптазы. Подготовленную смесь прогревали при 65єС в течение 2 мин, затем медленно охлаждали до комнатной температуры и проводили синтез кДНК при 37єС в течение 30 мин. Далее брали по 1 мкл полученного раствора в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени со следующим режимом: 20 циклов - 32єС - 8 с., 80єС - 4 с. Время проведения реакции: синтез кДНК - 1 час, ПЦР - 40 минут.
В результате проводимых модельных реакций обратной транскрипции и амплификации мы получали ДНК-продукты размером 32 пн, которые для наглядности анализировали в 10% полиакриламидном геле (рис. 1а). На рис. 1б представлена кривая накопления ДНК-продукта в реальном времени в зависимости от количества циклов реакции. Видно, что количество наработанного продукта можно было детектировать уже с 15 цикла, и далее его накопление увеличивалось экспоненциально.
1 - маркер pBSK/Hpa II 1 - амплификат с праймерами HV1/HV3
2 - амплификат с праймерами HV1/HV3 2 - минус-контроль
Т. к. система флуоресцентных красителей FAM-ROX обладает большей чувствительностью, чем краситель SYBR Green I, то, хотя накопление ПЦР-продукта начинается несколько позже (рис. 2б), оно идет быстрее, поэтому для реакции с такими праймерами достаточно 20-22 циклов, что значительно сокращает время на проведение анализа.
1 - маркер pBSK/Hpa II 1 - амплификат с праймерами HV1F/HV3R
2 - амплификат с праймерами HV1F/HV3R 2 - амплификат с праймерами
4 - амплификат с праймерами 3 и 4 - минус-контроль
Для сравнения на рис. 3а, б приведены результаты опытов с применением обратных транскриптаз. На кривой накопления ПЦР-продукта видно, что амплификат кДНК, полученной обратной транскриптазой M-MLV фирмы «Силекс», начинает детектироваться так же, с 14-16 цикла, но его накопление почти в два раза медленнее, и не достигает такого количества, как в предыдущих случаях. Накопление амплификата кДНК, полученной обратной транскриптазой AMV фирмы «Promega», достигает больших значений, но начинается только с 18-20 цикла и требует увеличения числа циклов реакции до 35, что значительно увеличивает время проведения анализа.
1 и 2 - амплификаты кДНК, полученной обратной транскриптазой M-MLV:
1- с праймерами HV1F/HV3R, 2- с праймерами HV11F/HV31R
3 и 4 - амплификаты кДНК, полученной обратной транскриптазой AMV:
1- с праймерами HV1F/HV3R, 2- с праймерами HV11F/HV31R
5 - минус-контроль, 6 - маркер pBSK/Hpa II
Таким образом, проведенные модельные эксперименты показали возможность использования Tth-полимеразы и метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для создания быстрого и эффективного диагностического теста - детекции хантавирусной РНК.
полимеразный цепной диагностика вирусный
1. Морозов В.Г. Применение индуктора эндогенного интерферона амиксина для лечения геморрагической лихорадки с почечным синдромом. /РМЖ - 2001, т. 9, №15, с. 656-660/.
2. Ткаченко Е.А., Дроздов С.Г. Хантавирусы и хантавирусные лихорадки. /Эпидемиология и вакцинопрофилактика - 2002, №6, с. 14-18/.
3. Гребенникова Т.В., Глюков А.И., Чистякова Л.Г., Киселев В.И., Северин Е.С. Использование термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus KTP в комбинированной реакции обратной транскрипции и амплификации для детекции РНК интерлейкина 2-б и определения экспрессии гена множественной устойчивости к антибиотикам (MDR-1). /Молекулярная биология - 1995, т. 29, №4, с. 930-941/.
4. Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations. /Trends Mol. Med. - 2002, V. 8 (6), p. 257-260/.
5. Mackay I.M. Real-time PCR in microbiology laboratory. /Clin. Microbiol. Infect. - 2004, V. 10 (3), p. 190-212/.
6. Myers T.W., Gelfand D.H. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. /Biochemistry - 1991, V. 30 (31), p. 7661-7666/.
7. Tse C., Capeau J. Real time PCR methodology for quantification of nucleic acids. /Ann. Biol. Clin. - 2003, V. 61 (3), p. 279-293/.
Метод полимеразной цепной реакции в реальном времени, его использование в диагностике мутаций в генах, приводящих к возникновению рака молочной железы и яичника. Действие генов-супрессоров на формирование опухолевого процесса. Наследственные формы рака. дипломная работа [306,1 K], добавлен 09.10.2013
Рассмотрение сути метода полимеразной цепной реакции. Понятие амплификации как процесса увеличения числа копий дезоксирибонуклеиновой кислоты. Основные принципы подбора праймеров при создании тест-системы. Подготовка пробы биологического материала. курсовая работа [610,8 K], добавлен 14.11.2014
Дефицит кислорода как стрессовый фактор для растений. Энергетическое состояние клетки в условиях гипоксии. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени. Динамика активности фумаратгидротазы в зеленых листья кукурузы в условиях гипоксии. курсовая работа [325,9 K], добавлен 09.08.2016
Выявление трансформантов среди растений Т2 поколения. Выявление инсерционных мутантов, имеющих фенотипические изменения. Идентификация трансгенной природы трансформированных растений Arabidopsis thaliana. Использование метода полимеразной цепной реакции. контрольная работа [380,4 K], добавлен 25.03.2016
Изготовление микропланшетов. Определение спектра поглощения. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в образцах ПЦР-смеси после амплификации. Протокол полимеразной цепной реакции с использованием TaqMan. Система детекции результатов анализа. дипломная работа [873,4 K], добавлен 15.12.2008
Коннекторный и рестриктазно-лигазный методы конструирования рекомбинантных молекул ДНК in vitro, их применение в генной инженерии. Реакция лигирования; рестриктазные операции. Использование метода амплификации сегментов ДНК в полимеразной цепной реакции. презентация [985,3 K], добавлен 17.08.2015
Методы обнаружения нуклеотидных замен в геномной ДНК. Обнаружение мутации в геномной ДНК при помощи блот-гибридизации с помощью меченых олигонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов. Исследование фрагментов ДНК при полимеразной цепной реакции. учебное пособие [2,5 M], добавлен 11.08.2009
Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д. PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах. Рекомендуем скачать работу .
© 2000 — 2021
Использование метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для детекции хантавирусной РНК статья. Биология и естествознание.
Реферат Образец Литературы
Дипломная работа: Territorial varieties of English pronunciation
Цели Бизнес Планирования Реферат
Контрольная Работа По Теме Литосфера 7 Класс
Реферат: Виды загрязнений окружающей среды
Реферат: Особенности использования различных видов наружной рекламы
Реферат: Фельетоны М.Е. Кольцова. Скачать бесплатно и без регистрации
Доклад по теме Tеренций
Курсовая работа по теме Налогообложение предприятия на примере ООО "Стройсервис"
Доклад по теме Философия текста
Дипломная работа по теме Автоматизированное рабочее место 'Статистика поликлиники'
Сочинение 2 Класса Грачи Прилетели
Биография На Тему Ярослав Мудрый
Дипломная работа по теме Совершенствование системы способов минимизации рисков, используемой на ОАО 'ЕПК Волжский'
Темы Магистерских Диссертаций По Юриспруденции
Предмет И Метод Права Курсовая
Курсовая работа по теме Разработка макета фасада ювелирного магазина: понятие, функции, методика разработки макета
Курсовая работа: Финансовые ресурсы торгового предприятия, источники и использование
Реферат по теме Гирудотерапия. Пиявки
Реферат по теме Социология конфликта
Проектирование технологической линии газоочистки МСЗ №4 "Руднево" - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда дипломная работа
Ураган - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда презентация
Закономерности формирования и динамики авифауны гор Азиатской Субарктики - Биология и естествознание автореферат