Героин бесплатные пробы Коимбра

• • • • • • • • • • • • • • • • •

• • • • • • • • • • • • • • • • •

Гарантии ❗ Качество ❗ Отзывы покупателей ❗

• • • • • • • • • • • • • • • • •

👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇

Наши контакты:

▶️▶️▶️ (НАПИСАТЬ ОПЕРАТОРУ В ТЕЛЕГРАМ)️ ◀️◀️◀️

👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆

• • • • • • • • • • • • • • • • •

🚩 ИСПОЛЬЗУЙТЕ ВПН (VPN), ЕСЛИ ССЫЛКА НЕ ОТКРЫВАЕТСЯ!

🚩 В Телеграм переходить только по ссылке что выше! В поиске тг фейки!

• • • • • • • • • • • • • • • • •

Героин бесплатные пробы Коимбра

Гемопоэз представляет собой сложный процесс развития , при котором гемопоэтические стволовые клетки ГСК бутона от гемогенного эндотелий присутствовать в различных эмбриональных сайтах гемопоэтических такие как аорта-гонад-мезонефрос и плацента 1,2. Неспособность культуры ГСК в пробирке предотвращает глубокий анализ этого процесса, а также клиническое применение этих исследований. Чтобы обойти это ограничение, предыдущие исследования попытались вывести ГСК заново либо с помощью дифференциации плюрипотентных стволовых клеток ЭСК 3, или индуцированной пластичности в соматических клетках и направленной дифференцировки с помощью перепрограммирования СМИ 4,5. Эти исследования, однако, не приводят к клинически безопасных engraftable клеток или позволяют изучение окончательного кроветворения развития 'в чашке'. Роман работа устанавливается Яманака и его коллеги, чтобы генерировать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки ИПСК из соматической фибробласты рrovides рамки для фактора транскрипции TF стратегий избыточной экспрессии на основе клеток в судьбе перепрограммирования 6,7. Эта работа побудила исследователей в различных областях, чтобы генерировать типы клеток выбора через TF перепрограммирования легкодоступных соматических клеток. Цель стратегии перепрограммирования , описанного здесь , чтобы вызвать гемогенного процесс от мыши соматических клеток с использованием TF на основе перепрограммирования подхода с целью воплощения этих результатов в человеческой системе перепрограммировать фибробласты конкретного пациента для того , чтобы изучить человека кроветворение в пробирке и генерировать пациента конкретных продуктов крови для моделирования заболевания, тестирования на наркотики и трансплантации стволовых клеток. Первым шагом для обеспечения надлежащего перепрограммирование в этой системе мыши было разработать линию репортер, который служил в качестве чтения-аута для экспрессии CD34, известным маркером в эндотелиальных клетках-предшественниках и ГСК. Это позволило скрининг различных ТФ, как известно, требуется в различных точках во время кроветворной спецификации и развития. Кроме того, необходимо обеспечить соответствующую микросреду, чтобы позволить гемопоэз, чтобы продолжить и создать мультилинейной клоногенные клетки-предшественники. Современные исследования пытаются перепрограммировать соматические клетки в гемопоэтических стволовых клеток и клеток - предшественников HSPCs встречались различные уровни успеха На сегодняшний день, поколение как мыши и перевиваемых HSPCs человека с длительным сроком и самообновлению заселив способность не была достигнута с использованием того же набора ТФ. В этом протоколе, мы приводим подробное описание ранее установленной стратегии воспроизводимо индуцируют гемопоэз в MEFs. Показано , что введение минимального набора ТФ Gata2, Gfi1b, CFO , и Etv6 способен подстрекательстве комплексную программу развития в пробирке , которая обеспечивает платформу , с помощью которого кроветворения развития и клиническое применение гемопоэтических перепрограммирования может быть дополнительно изучена Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Заявление по этике: клеточные линии мышей получены следуя инструкциям по уходу за животными в Икан школы медицины на горе Синай, и должно быть сделано в соответствии с любым принимающим учреждением. Блок формирования CFU Анализы плацентарной агрегация и колонии в метилцеллюлозы. Кровотворение представляет собой сложный процесс развития, который начинается в различных эмбриональных сайтах. Гемогенного эндотелиальные клетки находятся в этих местах и дают начало ГСК через ячейку почкованием Этот процесс в настоящее время не могут быть воспроизведены путем размещения ГСК или гемопоэтических предшественников в культуре, что вызывает необходимость методологии каким - то образом получить эти клетки в пробирке, либо путем расширения HSPC ех естественных условиях или генерации де Novo. Этот протокол демонстрирует нашу новую технологию, которая пытается получить эти клетки через сверхэкспрессией TF в MEFs. На рисунке 1 показан общий процесс перепрограммирования. После 3-х дней расширения и воздействия DOX начать активацию трансгена, клетки диссоциируют и разделить на 4-й день на покрытые желатином пластин ивыращенные в дополненной кроветворной средах. После длительной культуры пост трансдукции с перепрограммирования СМИ, клетки принять четкие морфологические изменения. На й день клетки принимают эндотелиальную морфологию, отличную от MEFs. Это окрашивание показывает, что эти клетки получить фенотипических маркеров, указывающие на гемогенного индукции. Далее культура приводит в клетках, экспрессирующих CD45, сохраняя при этом экспрессию репортера huCD После культивирования клетки плацентарного агрегации принимают клоногенных потенциал и генерировать колонии в метилцеллюлозы , содержащих различные гемопоэтические морфологию и нагнетающий типа клеток рисунок 3. Схема, иллюстрирующая процесс перепрограммирования, и каждый шаг в ней. Общий процесс перепрограммирования сначала включает MEF расширение, с последующим расщеплением при соответствующей плотности в покрытые желатином 6-луночных планшетах. На 4-й день клетки обрабатывают трипсином и разделены на 6-луночных планшетах. Через каждые 6 дней средства массовой информации изменяется и в выбранных временных точках клетки могут быть проанализированы с помощью FACS, КОЕ или экспрессии генов анализов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. A Это изображение показывает слияние клеток окрашиваются для CD45 и СЦА1 в то время как флуоресцирующих GFP с подстилающей светлопольному изображением перепрограммированных клеток. Создание HSPCs De Novo из легко достижимых соматических клеток предлагает уникальный метод для изучения кроветворения в пробирке, и возможность потенциально применять эту технологию для человеческой системы. Этот перевод будет генерировать новый инструмент для изучения болезни гематологического человека в блюдо, а также обеспечить по тестированию на наркотики платформы и ген возможности таргетинга для лечения многочисленных нарушений с новой терапии или трансплантации HSC. В этой области, недавние исследования расширили на способности генерировать HSPCs De Novo, демонстрируя важность нескольких особенностей процесса перепрограммирования. Они включают в себя выбор исходных клеточных популяций и коктейлей TF, а также , как условия культуры совместно культуры нишу и добавки цитокины, небольшие молекулы и т. Несколько исследований применяют технологию перепрограммирования к человеческой системе без прохожденияплюрипотентная промежуточный продукт , 27,28 нежелательным шагом в этих процессах. Вот протокол, который был первым, чтобы генерировать HSC-подобные клетки из соматических клеток через процесс развития, избегая при этом использования факторов плюрипотентности и образование плюрипотентных промежуточных продуктов. Сформированные ГСК-подобные клетки, по-видимому, развиваются через процесс развития, в первую очередь требует клеток проходить через кроветворный эндотелиальный промежуточный похож на EHT. На й день перепрограммирования эндотелиальные подобных промежуточных форм, которые содержат эндотелиальные и кроветворные профили экспрессии генов. HSC-подобные клетки появляются из этих промежуточных клеток на й день, которые содержат клеточной поверхности, иммуно-фенотип и профили экспрессии генов очень похожи на ГСК и могут производить эритроидных и миелоидных колоний в КОЕ анализах. Это говорит о том, что, в отличие от большинства других исследований, этот протокол перепрограммирование резюмирует сложный процесс развития в лабораторных условиях , и может завивкуэто дальнейшее изучение кроветворения и болезней гематологические процессы, приводящие к эмбриональное кроветворение. Эти исследования позволяют дальнейшие исследования о том, как лечить и вылечить множество гематологических расстройств, которые существуют, и как манипулировать кроветворения с этой целью. Это может быть сделано путем индуцирования кроветворения программы в фибробластах конкретного пациента , чтобы установить в пробирке моделей заболеваний. Использование мышиных фибробластов поддерживает различные полезные качества этого процесса перепрограммирования. Сами фибробласты легко получить от мышей-доноров, что делает соте простой. Переводя эту технологию для людей, таким образом, только требует пациентов образцы кожи, что делает приобретение конкретного пациента продуктов крови и последующей клеточной тэужалить жизнеспособным вариантом для лечения болезни гематологические. Кроме того, фибробласты очень эпигенетически отличие от гемопоэтических клеток, демонстрируя способность выбранных ТФ в этом перепрограммирования протоколе к эпигенетически репрессировать идентичности фибробластов, а также провоцировать гемогенного программу путем изменения эпигенетической памяти исходных клеток 29, Хотя трансплантация исследования пока не демонстрируют полную мультилинейной функцию приживление этих клеток, полученных, видя, если эти факторы вызывают гемогенного программу, которая генерирует полностью функциональные гемопоэтические клетки в человеческой системе будет представлять большой интерес. Несколько шагов в этом протоколе могут быть изменены в случае возникновения трудностей во время перепрограммирования, такие как количество посеянных клеток до трансдукции и количества вируса, используемого для трансдукции. Оптимальные результаты были получены с использованием клеток на 6-луночный планшет этап 3. Точно так же, меньшие объемы вируса могут быть использованы, должны некрозу клеток быть проблемой, до тех пор, как перепрограммирования протекает, как описано что можно проверить с помощью анализа FACS, КОЕ анализов и генного профилирования. Обеспечение того, чтобы шаги 2. Шаги 3. Соответствующее количество DOX на лунку трансдуцированных клеток должны быть последовательными и свежей, чтобы обеспечить экспрессию трансгенов таким образом, что требует частой смены печатных носителей. Хотя это и не абсолютно необходимо, культура клеток в темноте при использовании DOX может помочь предотвратить потерю функции DOX. После того, как трансдукции клетки следует тщательно контролировать под микроскопом по морфологии и анализировали с помощью различных аналитических методов таких, как FACS и анализов КОЕ , чтобы гарантировать, Successful вирусной трансдукции и перепрограммирование. Перепрограммировали клетки могут не принять столько морфологических изменений, как и ожидалось, требующих ранее упомянутые аналитические методы, чтобы служить в качестве наилучших показателей надлежащего перепрограммирования. Недавние исследования использовали различные свойства этого перепрограммирования протокола, такие как Gata2 в коктейле TF или фибробластов в качестве популяции клеток начальной Эти методики также появляются, чтобы побудить программы развития в процессе перепрограммирования. Другие стратегии показали важность гемопоэтических ниши во время перепрограммирования 9,10,25, Выявление всех факторов , которые помогают в перепрограммирования будет иметь важное значение для разработки протокола , который генерирует добросовестные ГСК из легко достижимых клеток конкретного пациента. Таким образом, здесь мы опишем стратегию для генерации HSC-подобные клетки от индуцированного процесса развития в мышиных фибробластов через индуцируемый Gata2, Gfi1b, финансовые директора, иEtv6 избыточная экспрессия. Эта технология будет переведена в человеческой системе, где, в сочетании с другими опубликованными исследованиями, позволит поколение пациента специфических продуктов крови подходит для различных клинических применений. Daniel, M. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing После того, как вагинальная пробка визуализируется, рассмотреть этот день 0,5. Отделить засоряющихся самок на дату подключи и проверить их на День , чтобы подтвердить беременность. В день Выньте эмбрионы осторожно, пока отрезав оставшиеся брюшной ткани. Примечание: Восстановление около 8 эмбрионов с 4 на каждой стороне. Поместите матки часorns, содержащие эмбрионы в 10 см чашку с мл стерильной охлажденным фосфатным буферным раствором PBS. Стерильными ножницами и щипцами, делают надрез вдоль рогов матки, чтобы изолировать мешочки, несущие эмбрионов. Передача мешочки на новую 10 см чашку с мл стерильной охлажденной PBS и место на льду. Поместите несколько из мешочков в новую 10 см чашку с мл стерильной охлажденной PBS. Используя стерильные ножницы и пинцет аккуратно разрезать мешочки без резки слишком глубоко , чтобы избежать прокалывания эмбрионов. Отдельные эмбрионы из плаценты путем перерезания пуповины. Перенос эмбрионов на новую 10 см чашку, содержащую мл охлажденного PBS и оставить на льду во время завершения оставшихся вскрытий. Обезглавьте эмбрионов с использованием стерильного пинцета. Тщательно вырубить средней линии эмбриона, используя стерильные ножницы и пинцет, начиная с обезглавленной области, чтобы открыть живот. Позиция щипцов под тон висцеральные органы включая сердце, печень, и легкие и скрести их Обрежьте оставшиеся ткани на мелкие кусочки с помощью ножниц и щипцов и передачи в 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл трипсина. Пипеткой вверх и вниз с 10 мл пипеткой раз перемешать и диссоциируют ткани. Культура около эмбрионов на 10 см чашку. Примечание: Замораживание клетки один раз пластин вырожденная. Замороженные клетки могут быть разморожены и пассировать еще 2 раза. Клетки могут быть альтернативноразделить 2 раза до замораживания, а затем еще раз после того, как оттаивают. Примечание: 4 пластины на вирус будет требоваться. Аспирируйте от желатина перед добавлением клеток к пластинам. Добавляют воду H 2 O , чтобы компенсировать объем до 2 мл. Подготовьте трубку для каждого фактора например. Как производятся пузырьки, поместите кончик P против стеклянной пипеткой и медленно выталкивать 2 мл мМ N, N-бис 2-гидроксиэтил аминоэтан сульфокислоты BES физиологического раствора вниз Пастера пипеткой 1 мл за один раз. Инкубируйте все пробирки в культуре шкафу при комнатной температуре в течение не менее 15 мин. Заменить собранные средства массовой информации из каждой пластины с 4 мл стандартной DMEM. Примечание: 4 пластины на первоначальные результаты трубки смеси в 16 мл собранных средств массовой информации. После 12 ч инкубации, собирают средства массовой информации и добавить в те же 50 мл пробирки. Примечание: каждая труба должна теперь содержать около 48 мл среды, содержащей вирус. Для того, чтобы сосредоточить собранный вирус, первый фильтр собранных средств массовой информации через 0,45 мкм с низким уровнем связывания с белками фильтров. Налейте отфильтрованные носители, содержащие вирус в концентрации вируса центрифужные пробирки около 16 мл за один раз. После инкубации удалить пластины и аспирация желатин. Пластинчатые MEFs со стандартной DMEM при плотности клеток на лунку клетокна 6-луночный планшет на желатинизированный 6-луночного планшета ов со стадии 3. На 4 день aspiratе средства массовой информации из каждой лунки и мыть клетки с 1 мл PBS на лунку. Граф клеток с помощью гемоцитометра, вращаются со скоростью мкг в течение 5 мин, вновь суспендируют в 12 мл гемопоэтических сред, описанных в пункте 3. Заменить СМИ со свежими, дополненной кроветворной культуральной среды через каждые 6 дней в течение всего срока культуры от 35 до 36 дней. Прохождение клетки через г хвои монтировали на 5 мл шприцев несколько раз, чтобы дополнительно механически диссоциируют плацентарных клеток. Фильтр одноклеточных суспензий через клеточные сита 70 мкм. Граф клеток с гемоцитометра и облучают при сГр для митотического инактивация Примечание: DOX не требуется на данном этапе. Поместите фильтр на 0,65 мкм непосредственно на гемопоэтических культуральной среды в чашке, что позволяет ему плавать, чтобы создать поверхности раздела жидкость-газ и установить чашку в сторону. Диссоциируют день 25 трансдуцированных MEFs полученного на стадии 3. Чтобы создать агрегат 18,21, первый спин вниз MEF и плацентарный смесь клеток со стадии 4. Аспирата СМИ и ресуспендирования осажденные клетки в мкл стандартной среды DMEM с использованием P пипетка, рисование одноклеточной суспензии клеток в мкл nonbevelled кончика пипетки. Закупоривать кончик пипетки с парафиновой пленки. Поместите заблокированного наконечник в центрифужную пробирку объемом 15 мл и спином вниз в течение 5 мин при х г Таким образом, гранулы формы на охватываемый конец наконечника. Удалите наконечник из 15 мл трубки тщательно и местонаконечник на конце P пипеткой. Выбросьте парафиновую пленку и выдавливать осадок клеток на плавающий фильтр с шага 4. Примечание: Тарелка не более 3 агрегатов на фильтре. Пластинчатые равные объемы этой смеси в 3 35 х 10 мм необработанной блюда культуры дляКОЕ анализах В качестве контроля культуры облучали плацентарные агрегаты без перемешивания в перепрограммирован MEFs дней и место в КОЕ анализах, как описано выше в пунктах 4. Примечание: Эти агрегаты сами по себе не образуют колоний. Cytospin 22 отобранных колоний , чтобы показать морфологический фенотипа отдельных клеток. Это демонстрирует клонального мультилинейной потенциал перепрограммированных клеток, которые принимают кроветворную функцию после трансдукции с этим минимальным набором ТФ. Play Video. Cite this Article Daniel, M. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close.

Лимасол купить WAX картриджи