Физиологическая адаптация нового RuMP штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum к тяжелой воде - Биология и естествознание статья
Главная
Биология и естествознание
Физиологическая адаптация нового RuMP штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum к тяжелой воде
Последовательный рассев штамма на агаризованных средах. Колонии, сохранившие высокие ростовые и биосинтетические параметры. Аминокислоты: аланин, валин и лейцин/изолейцин. Смеси молекул с различным количеством включенных атомов дейтерия.
посмотреть текст работы
скачать работу можно здесь
полная информация о работе
весь список подобных работ
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Физиологическая адаптация нового RuMP штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum к тяжелой воде
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, просп. Вернадского, 86.
Разработан метод физиологической адаптации нового фенилаланин-продуцирующего RuMP штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum к максимальным (98 об.%) концентрациям 2 Н 2 О с целью последующего микробиологического синтеза 2 Н-меченого фенилаланина. Метод заключается в последователь н ом рассеве штамма на агаризованных средах М9 с 2 об.% [U - 2 Н] MetOH со ступенчато возрастающим градиентом концентрации 2 Н 2 O (от 0 до 98 об.% 2 Н 2 О) и последующей селекцией колоний по признаку устойчивости к 2 Н 2 О. В результате применения разработанного подхода для данного штамма метилотрофных бактерий на среде с 98 об.% 2 H 2 О были отобраны отдельные колонии, сохранившие высокие ростовые и биосинтетические параметры. За счет использования адаптированного штамма можно получить 0.95 грамм 2 Н-меченого фенилаланина с 1 литра ростовой среды. Показано, что наряду с фенилаланином штамм синтезирует и выделяет в ростовую среду в количестве 5-6 ммоль метаболически связанные с ним аминокислоты: аланин, валин и лейцин/изолейцин. Согласно данным метода масс-спектрометрии EI MS метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных (Dns) производных аминокислот, 2 Н-меченые аминокислоты, полученные микробиологическим синтезом представляли собой смеси молекул с различным количеством включенных атомов дейтерия; уровень дейтерированности молекул определяли из масс-спектров по наиболее распространенному пику молекулярного иона (M) + каждой аминокислоты - для фенилаланина уровень дейтерированности составил 6; для аланина -3.1; для валина -4.7; для лейцина/изолейцина - 5.1 атома дейтерия.
Для приготовления ростовых сред и адаптации штамма использовали 2 H 2 O (99.9 ат.% 2 H) и [U- 2 Н] MetOH (97.5 ат.% 2 H), полученные из Российского научно-исследовательского центра ИЗОТОП (Санкт-Петербург, РФ). Для создания высокого градиента концентрации 2 Н 2 О в ростовых средах использовали 2 Н 2 О с атомным содержанием дейтерия 99.9%. Фосфатсодержащие соли были дважды перекристаллизованы в абсолютной 2 Н 2 О перед их использованием и высушены в вакууме. Тем не менее, процент дейтерированности ростовых сред после стериллизации влажным паром, измеренный методом ЯМР был ниже на 8-10% изотопной чистоты исходной 2 Н 2 О). По необходимости 2 H 2 O очищали от вредных примесей, перегоняя её над перманганатом калия [11].
Выращивание штамма проводили в минеральной среде M9 [12], приготовленой на основе различных концентраций 2 Н 2 О (см. таблицу) с добавками протонированного лейцина и [U- 2 H] MetOH при 37 0 С в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с наполнением средой до 50 мл в условиях интенсивной аэрации по методике [13]. После 6-7 суток роста клетки отделяли центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин). В культуральной жидкости анализировали секретируемые аминокислоты.
Адаптацию штамма к 2 Н 2 О проводили на агаризованных средах М9 (2%-ный агар), содержащих ступенчато возрастающий градиент 2 Н 2 О (от 0 вплоть до 98 об.% 2 Н 2 О). При этом использовали последовательный рассев штамма до отдельных колоний и последующую селекцию колоний, выросших на средах со ступенчатом градиентом 2 Н 2 О. Отобранный штамм хранили в 50%-ном растворе (в 2 Н 2 О) глицерина при -14 0 С.
Морфологию клеток исследовали с помощью интерференционно-поляризационного микроскопа МБР-5 (Венгрия).
Бактериальный рост оценивали по величине оптической плотности суспензии клеток, измеренной на спектрофотометре Beckman-DU6 (США) при 540 нм в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм.
Тонкослойную хроматографию (ТСХ) аминокислот проводили на пластинках Silufol UV-254 (Чехо-Словакия) в системе растворителей: изо-PrOH-аммиак, (7:3).
Секретируемый фенилаланин определяли на приборе Beckman DU-6 (США) при 540 нм в образцах культуральной жидкости, объёмом 10 мкл после ее обработки 0.1% раствором нингидрина в ацетоне.
Уровни включения дейтерия в молекулы аминокислот определяли методом масс-спектрометрии EI MS в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот на приборе MB-80A (Hitachi, Япония) при ионизирующем напряжении 70эВ, используя прямую дериватизацию лиофилизированных культуральных жидкостей дансилхлоридом и диазометаном [14].
Изучение продукции фенилаланина на 2 Н 2 О-содержащих средах .
Во всех экспериментах не зависимо от присутствия 2 Н 2 О в ростовой среде было зафиксировано увеличение продукции фенилаланина на ранней фазе экспоненциального роста, когда выход микробной биомассы был незначителен, в то время как на фазе позднего экспоненциального роста наблюдалось снижение уровня его накопления в ростовой среде (рис. 3). Для того чтобы объяснить эффект снижения уровня накопления фенилаланина были высказаны возможные предположения о морфологической неоднородности микробной популяции, ингибировании биосинтеза фенилаланина конечным продуктом нарушении транспорта фенилаланина через клеточную мембрану. Результаты по микроскопическому исследованию растущей популяции микроорганизмов показали, что данный характер динамики накопления фенилаланина не коррелировал с качественными изменениями клеточной морфологии на поздних стадиях роста, что служило подтверждением морфологической однородности микробной популяции. Скорее всего, накопленный экзогенно в процессе роста фенилаланин ингибировал ферменты собственного пути биосинтеза. Кроме того, не исключена возможность, что при выращивании без рН-статирования может происходить как обратное превращение секретируемого фенилаланина в интермедиаторные соединения его биосинтеза по пути шикимовой кислоты, так и спонтанная ассимиляция фенилаланина клеткой для обеспечения своих собственных метаболических потребностей, что отмечено в других работах [15, 16]. Эффект уменьшения уровня накопления фенилаланина наблюдался при росте как на протонированной, так и на среде с 98 об.% 2 Н 2 О, что затрудняло его исследование (рис. 3). Из-за того, что на среде с 98 об.% 2 Н 2 О ухучшались все ростовые параметры, было сделано предположение, что уменьшение уровня накопления фенилаланина в ростовой среде относится не к изменению транспорта фенилаланина через клеточную мембрану, а к негативному биостатическому эффекту 2 Н 2 О. Данные по исследованию культуральной жидкости методом ТСХ показали, что кроме фенилаланина данный штамм синтезирует и накапливает в ростовой среде незначительные количества (на уровне 5-6 ммоль) метаболически связанных с ним аминокислот (аланин, валин, лейцин/изолейцин), присутствие которых также подтверждалось анализом смеси метиловых эфиров N-DNS-производных аминокислот методом масс-спектрометрии EI MS.
Изучение уровней включения дейтерия в молекулы аминокислот .
В настоящей работе уровни включения дейтерия в молекулы аминокислот определяли методом масс-спектрометрии EI MS в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот, за счет сопоставления молекулярных масс протонированных и 2 Н-меченых производных аминокислот.
Полученные микробиологическим синтезом 2 Н-меченые аминокислоты представляли собой смеси изотопнозамещённых форм молекул, различающихся количеством атомов водорода, замещённых на дейтерий. Вследствие этого эффекта пики молекулярных ионов метиловых эфиров N-Dns-аминокислот в масс-спектрах были полиморфно расщеплены на кластеры за счет примеси молекул с отношениями m/z , больше или меньше детектируемых прибором величин (М) + с различным вкладом в суммарный уровень дейтерированности. В качестве примера на рис. 4, б приведен масс-спектр смеси метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот полученных со среды с 98 об.% 2 Н 2 О (масс-спектр приведен относительно контрольных условий (а) на обычной воде). Подсчет уровня дейтерированности молекул аминокислот проводили по величине самого интенсивного пика молекулярного иона (М) + , зарегистрированного самим масс-спектрометром; для фенилаланина - шесть (М + при m/z 418 вместо М + при m/z 412 для протонированного метилового эфира N-Dns-фенилаланина), для аланина -3.1 (М + при m/z 339.5 вместо М + при m/z 336.4), для валина -4.7 (М + при m/z 369.2 вместо М + при m/z 364.5), для лейцина/изолейцина -5.1 атома дейтерия (М + при m/z 383.6 вместо М + при m/z 378.5). Таким образом, общее количество дейтерия в молекуле фенилаланина составило 75%, аланине -77.5%, валине -58.8%, лейцине/изолейцине 51%. Уровни дейтерированности 2 Н-меченых аминокислот семейства лейцина должны быть ниже остальных вследствие того что лейцин добавляли в ростовую среду в протонированном виде, что подтвердилось экспериментальными данными (см. выше). В то же время биосинтез фенилаланина был косвенно связан с ауксотрофностью по лейцину, поэтому дейтеривая метка в молекуле самого фенилаланина также была несколько разбавлена.
Полученные данные в целом подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация к 2 H 2 О является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные клетки возвращались к нормальному росту и биосинтезу фенилаланина в протонированных средах после некоторого лаг-периода. В то же время эффект обратимости роста на 2 H 2 O/Н 2 O- средах теоретически не исключает возможности того, что этот признак стабильно сохраняется при росте в Н 2 О, но маскируется при переносе клеток на дейтерированную среду. В общих чертах, при переносе клетки в дейтерированную среду она не только постепенно теряет обычную воду за счет насыщения внутриклеточной среды 2 H 2 О, но и происходит очень быстрый изотопный ( 1 Н- 2 H)-обмен в гидроксильных, карбоксильных, сульфгидрильных и аминогруппах всех биологических макромолекул, включая нуклеиновые кислоты и полипептиды. Затем в процессе роста клетки дейтерий включается в углеродные скелеты макромолекул, образуя связи типа С- 2 H [17]. В связи с тем, что физико-химические параметры С- 2 Н связи существенно отличаются от ее протонированного прототипа [18], можно предположить, что клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые способствуют стабилизации работы макромолекулярных компонентов жизненно-важных систем, которые подверглись дейтерированию. Не исключено, что положительные эффекты, наблюдаемые при адаптации к 2 H 2 О связаны с образованием в 2 H 2 O конформаций 2 Н-меченых макромолекул с иными структурно-динамическими свойствами, чем конформаций, образованных с участием водорода, и поэтому имеющих другую активность и биологические свойства, подходящие для работы в 2 Н 2 О. С другой точки зрения пространственная структура 2 Н-меченых макромолекул может стабилизироваться в 2 H 2 О за счет вторичного изотопного эффекта дейтерия и действия 2 H 2 О как растворителя (большая структурированность, плотность и вязкость по сравнению с Н 2 О) [19].
Суммируя полученные для изученного штамма данные, можно сделать вывод об адаптивной стабилизации посредством постепенного привыкания к 2 Н 2 О и как следствие этого улучшения ростовых и биосинтетических параметров. Выбор метилотрофных бактерий в качестве модельных объектов для данных исследований представляется наиболее целесообразным, так как метилотрофы как организмы, реализующие RuMP и сериновый пути ассимиляции MetOH, эволюционно просты и достаточно лабильны в генетическом аспекте и тем самым быстрее реагируют и приспосабливаются к изменчивым факторам среды. В настоящее время аналогичные подходы по адаптации других штаммов метилотрофных бактерий к 2 Н 2 О активно изучаются.
Представлены данные по биосинтезу дейтерий-меченных аминокислот L-фенилаланин-продуцирующим штаммом факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum. В культуральной жидкости накапливаются и аланин, валин и лейцин (изолейцин). статья [2,3 M], добавлен 23.10.2006
Уровни включения стабильных изотопов дейтерия. Молекулы секретируемых аминокислот L-фенилаланинпродуцирующего штамма Brevibacterium methylicum и L-лейцинпродуцирующего штамма Methylobacillus flagellatum. Аминокислотные остатки суммарных белков. статья [1,7 M], добавлен 23.10.2006
Представлены данные по биосинтезу L-фенилаланина, продуцируемого экзогенно штаммом факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, способного ассимилировать метанол в качестве источника углерода и энергии. статья [1,2 M], добавлен 23.10.2006
The biosynthesis of 2H-labeled phenylalanine was done by converse of low molecular weight substrates in a new RuMP facultative methylotrophic mutant Brevibacterium methylicum. Isotope components of growth media and characteristics of bacterial growth. статья [1,3 M], добавлен 23.10.2006
Сообщается о методе, который заключается в многоступенчатой адаптации бактерий к дейтерию путём рассева их на средах, содержащих возрастающие концентрации 2Н2O и с последующей селекцией отдельных колоний, выросших на этих средах. статья [556,6 K], добавлен 23.10.2006
Хелатирующие соединения. Строение и комплексообразование ЭДТА. Бактериальная деградация ЭДТА. Кометаболизм. Периодическое культивирование и его условия. Методика приготовления питательных сред. Вычисление энергетического выхода роста штамма LPM-4. дипломная работа [77,4 K], добавлен 15.12.2008
Бактериальные штаммы. Условия адаптации. Получение штаммов - продуцентов аминокислот, адаптированных к максимальным концентрациям 2Н2О в среде. Изучение ростовых характеристик M. flagellatum. Секретируемые аминокислоты метилотрофных бактерий. статья [1,2 M], добавлен 23.10.2006
Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д. PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах. Рекомендуем скачать работу .
© 2000 — 2021
Физиологическая адаптация нового RuMP штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum к тяжелой воде статья. Биология и естествознание.
Сочинение: Роль эпиграфа в одном из произведений русской литературы XIX века. А.С.Пушкин. Евгений Онегин.
Заболевание Легких Реферат
Лес Летом Сочинение 3 Класс
Контрольная работа по теме Отражение розыскного процесса в уголовном праве
Реферат по теме Неожиданные штрихи к портрету Дмитрия Донского
Курсовая работа по теме Прокурорский надзор за исполнением закона в ходе досудебного производства, при производстве предварительного следствия и дознания
Теории Происхождения Нефти Реферат
Курсовая работа: Виды и уровни разработки бизнес-стратегии предприятия
Черные Дыры Реферат По Астрономии
Реферат На Тему Культура Древних Русичей
Контрольная Работа 3 Класс С Прямоугольником
Реферат по теме Виды кровезаменителей
Реферат: Советский Союз в послевоенном мире
Курсовая работа по теме Повышение эффективности маркетинговой деятельности предприятия ОАО 'Молочные продукты'
Распорядок Студента Сочинение На Английском
Дипломная Работа На Тему Характеристика Та Асортимент Горіхоплідних Культур
Курсовая работа по теме Фармакогкостический анализ видов маклеи
Дипломная работа по теме Совершенствование организационной структуры и внедрение инноваций в структуру организации (на примере ООО 'Скиф-Карго')
Сочинение Про 1 Снег
Курсовая работа по теме Международные стандарты бухгалтерского учета
Биотехнологии и пищевая промышленность - Биология и естествознание контрольная работа
Найдивніші тварини на землі - Биология и естествознание презентация
Расследование и учет хронических профессиональных заболеваний и отравлений - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда реферат