Экзосомы

Известно, что различные активные вещества, циркулирующие в биологических жидкостях организма, такие как гормоны, цитокины, хемокины, нейромедиаторы, факторы роста и другие, обеспечивают передачу сигналов между клетками в целях регуляции всех биохимических процессов, протекающих в организме, и, соответственно, играют важную роль в метаболической связи органов и систем организма. 

Однако относительно недавно стало известно о существовании еще одного не менее эффективного способа межклеточной коммуникации. Этот новый сигнальный механизм опосредован экзосомами - небольшими внеклеточными пузырьками диаметром от 50 до 150 нм. Экзосомы происходят из эндосом – мембранных внутриклеточных органелл, связанных с транспортом веществ внутри клетки: образуются путем выпячивания плазматической мембраны клетки наружу, затем отпочковываются от нее и превращаются в пузырек, выходя во внеклеточное пространство. 

Важно отметить, что практически любая клетка организма, от желудочно-кишечного тракта и желез внутренней секреции до мозга и кожи, может производить экзосомы. После высвобождения из клетки-донора экзосомы с кровотоком разносятся по всему организму и обнаруживаются не только в сыворотке крови и лимфе, но и в моче, сперме, слезной жидкости, желче, околоплодной жидкости и грудном молоке. 

Как самостоятельные структуры экзосомы были описаны более 36 лет назад, когда Johnstone RM et al 1987 проводили исследования клеток- предшественников эритроцитов – ретикулоцитов. Ученые обнаружили, что рецептор трансферрина секретируется ретикулоцитами и разносится по всему организму с кровотоком во внеклеточных пузырьках. В то время победила точка зрения, заключающаяся в том, что единственная функция экзосом состоит в избирательном удалении нежелательных клеточных компонентов, и интерес медицинского сообщества к этим внеклеточным пузырькам надолго угас. 

Однако все изменилось в последние 15 лет, когда несколько исследований, проведенных подряд in vitro и in vivo (Valadi H et al 2007, Thery C et al 2009, Kosaka et al 2010, Colombo et al2014, Yanez-Mo M et al 2015 и др.), продемонстрировали, что экзосомы могут переносить от клетки к клетки генетический материал (белки и нуклеиновые кислоты) и другие биологически активные молекулы, что приводит к функциональным изменениям в клетках-реципиентах. 

Общий нарастающий интерес со стороны медицинского сообщества к экзосомам привел к тому, что в 2011 году было создано Международное научное общество по изучению внеклеточных везикул (International Society for Extracellular Vesicles), членами которого на сегодняшний день являются более тысячи учёных со всего мира. А в 2013 году за открытие экзосом в качестве главных межклеточных транспортёров, переносящих, в том числе, и генетическую информацию от клетки-донора к клетке-реципиенту, ученым Джеймсу Ротману, Рэнди Шекману и Томасу Зюдхофу была вручена Нобелевская премия по медицине. 

В своем составе экзосомы содержат белки (мембранные белки, цитозольные и ядерные белки, а также белки внеклеточного матрикса), липиды и нуклеиновые кислоты, а также могут включать воспалительные цитокины, факторы роста и другие вещества. В то же время, состав и размеры экзосом различаются в зависимости от клеток, которые их производят.

Наиболее распространенные белки на поверхности экзосом - тетраспанины, известные как мембранные каркасы. Также экзосомы содержат антигенные белки, например, главный комплекс гистосовместимости I и II, флотилин-1 и интегрины. Другие белки экзосом включают белки MVB, например, комплекс ESCRT 0,-I,-II,-III, Alix, синтенин, TSG101, мембранные транспортеры, например, белок RAB, RAP1B, RhoGDIs и аннексины.

Помимо этого, экзосомы содержат несколько ферментов, таких как глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, фосфоглицераткиназа 1 и аланиламинопептидаза, ряд шаперонов, таких как белки теплового шока, белки адгезии, такие как молекула клеточной адгезии L1 и лизосомально-ассоциированный мембранный белок 2.

Экзосомы богаты генетическим материалом. Различные типы РНК, включая мРНК и микроРНК, хранилище РНК (vtRNAs), м-РНК, рибосомальная РНК (рРНК) и транспортная РНК (tRNAs) являются важными регуляторами экспрессии генов, действующими внутри продуцирующих их клеток, а также в клетках-реципиентах после их переноса экзосомами. Кроме того, в экзосомах представлены различные типы ДНК - двухцепочечные ДНК (dsDNA), митохондриальные ДНК (mtDNA) и одноцепочечные ДНК (ssDNA).

Другим содержимым экзосом являются липидные соединения, включающие холестерин, фосфатидилсерин, сфингомиелин, керамиды, лизобисфосфатидикислоту и фосфатидилэтаноламин, которые играют важную роль в структуре мембран экзосом и их формировании. Благодаря им, экзосомы с двухслойной липидной мембраной надежно защищают свой «ценный груз» и осуществляют его транспортировку к клетке-мишени. 

До сих пор неясно, почему экзосомы нацелены на определенные клетки-реципиенты: в этом вопросе необходимы дальнейшие исследования. Однако механизмы, управляющие проникновением экзосом в клетки-реципиенты, уже изучены. На сегодняшний день описаны три основных пути: (1) прямое взаимодействие компонента экзосомы с мембранным рецептором, (2) слияние экзосом с плазматической мембраной принимающей клетки и (3) интернализация экзосом клетками-реципиентами посредством фагоцитоза или путем эндоцитоза, опосредованного клатрином, кавеолином (Harrell et al., 2019).

В настоящее время используются различные методы для выделения экзосом из питательной среды или из образцов сыворотки/плазмы. Эти методы различают экзосомы по размеру, плотности или по наличию специфических белковых компонентов и, следовательно, позволяют получать препараты с различной чистотой и составом экзосом. Наиболее распространенной стратегией, используемой для выделения экзосом, является дифференциальное высокоскоростное ультрацентрифугирование.

Если говорить о свойствах экзосом, то на сегодняшний день имеются многочисленные доказательства их регенеративной, антимикробной, противовоспалительной и антиоксидантной активности.

Так, было продемонстрировано, что экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (MSC), играют решающую роль в восстановлении поврежденного эпителия и реэпителизации (Zhang et al., 2015a), ангиогенезе (Shabbir et al., 2015; Zhang et al., 2015) и предотвращении образования рубцов путем подавления дифференцировки миофибробластов (Fang et al., 2016). 

Исследования Wei et al., 2019 показали, что экзосомы, полученные из MSC, содержащие микроРНК, уменьшают воспаление путем трансформации провоспалительного макрофага M1 в противовоспалительный фенотип M2. Фенотип M2 снижает местный уровень интерлейкина-1β, интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и увеличивает секрецию противовоспалительных факторов, таких как IL-10. 

Недавнее исследование Harrell et al., 2019 продемонстрировало, что экзосомы, полученные из MSC, ингибируют образование воспалительных CD4+ T-хелперов (Th1, Th17) и подавляет высвобождение их основных цитокинов – IFN-γ и IL-17, которые, в свою очередь, подавляют иммунную систему. Кроме того, защитные эффекты экзосом, полученные из MSC, опосредованы путем подавления окислительного стресса и поддержания равновесия окислительно-восстановительных реакций, являющихся неотъемлемой частью широкого спектра клеточных процессов, таких как экспрессия генов и энергетический метаболизм (Yang et al., 2015).

Исследования Yu et al., 2015; Li et al., 2019; Wen et al., 2020 также показали важную роль экзосом, полученных из MSC, в восстановлении тканей после повреждения: положительный эффект опосредован индуцированием дифференцировки клеток, пролиферации и предотвращением апоптоза. МикроРНК - miR-21-5p, miR-144 и miR-19a являются факторами, которые ингибируют апоптоз и снижают уровень апоптотических белков, таких как каспаза 3, каспаза 8 и каспаза 9, после повреждения тканей.

Deng et al., 2020 изучали протекание воспалительной реакции при колите и обнаружили, что экзосомы, полученные из MSC, ослабляют воспаление за счет снижения уровня TNF-α, ядерного фактора kappaBp65 (NF-kBp65), циклооксигеназы-2 (COX-2), индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS), интерлейкина-1β (IL-1β) и увеличения экспрессии IL-10. Было продемонстрировано облегчение ЛПС-индуцированного воспаления и острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) с помощью экзосом.

Об антимикробных свойствах экзосом, полученных из MSC, сообщалось в нескольких клинических испытаниях (Краснодембская и др., 2010; Харман и др., 2017; Кортес-Арайя и др., 2018). Исследования показали, что экзосомы содержат антимикробные пептиды и белки, обладающие бактерицидным действием (Gläser et al., 2005; Краснодембская и др., 2010; Аллен и Стивенс, 2011; Алькаяга-Миранда и др., 2017). 

Экзосомы, полученные из MSK, показали терапевтический эффект при повреждении легких, вызванном E. coli (Zhu et al., 2014). Кроме того, в исследовании на животных сообщалось об усилении антимикробной функции иммунных клеток при инфильтрации легочной ткани, вызванной экзосомами, полученными из MSC (Hao et al., 2019). Еще одно исследование на экспериментальной модели показало, что экзосомы могут защищать мозг от сепсиса (Chang et al., 2018). 

Экзосомы, полученные из MSC, повышают способность моноцитов к бактериальному фагоцитозу при тяжелой бактериальной пневмонии (Monsel et al., 2015) и кишечных инфекциях (Islam et al., 2001). Более того, после использования экзосом повышались иммунорегуляторные свойства моноцитов и снижалась секреция воспалительных цитокинов (Monsel et al., 2015). Имеются доказательства того, что экзосомы, полученные из MSC, с их иммуномодулирующей, проангиогенной и противовоспалительной активностью, могут предотвращать воспалительные реакции и облегчать пневмонию, вызванную COVID-19, и повреждение легких (Raghav et al., 2021). В целом, все это свидетельствует о положительной роли экзосом в инфекциях, особенно их влиянии на усиление фагоцитоза моноцитов, и создает многообещающие основания для использования экзосом в качестве потенциальных лекарств против патогенных микроорганизмов.

Экзосомы и заживление ран

Заживление ран - это сложный процесс, который включает три различные фазы - воспаление, пролиферацию и ремоделирование: при этом в каждой фазе доминируют уникальные популяции клеток. Введение стволовых клеток используется для оптимизации всех трех этапов заживления ран: они уменьшают воспаление, ускоряют фазу пролиферации и помогают в ремоделировании тканей, показывая лучшие результаты заживления (El Ayadi et al., 2020). На сегодняшний день исследования показывают, что стволовые клетки оказывают свое терапевтическое воздействие, главным образом, с помощью паракринных механизмов, высвобождая экзосомы и факторы роста. 

Действительно, проведенные исследования продемонстрировали терапевтический потенциал экзосом в части воздействия на каждую фазу заживления кожных ран, главным образом за счет микроРНК. 

Так, во время фазы воспаления экзосомы воздействуют на различные иммунные клетки и резидентные клетки тканей, снижая воспалительную реакцию (Li et al., 2019, Li Xiao et al., 2016, Shi Zhengzhou et al., 2019). 

Во время фазы пролиферации экзосомы способствуют закрытию раны, активируя эндотелиальные клетки (Xu et al., 2020, Zhang et al., 2016) и фибробласты (Ma et al., 2019, Zhao et al., 2018), способствуя созданию проангиогенной среды и инициируя выработку внеклеточного матрикса. 

Во время заключительной фазы каскада реакций, протекающих при заживлении ран, фазы ремоделирования экзосомы изменяют соотношение матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов для достижения благоприятных результатов заживления ран (Yang et al., 2020). 

Всего было проведено 51 исследование, оценивающее эффективность применения экзосом в моделях заживления эксцизионных ран у грызунов (32 на мышах и 19 на крысах). 

Большинство экзосом, использованных в моделях заживления ран, были получены из MSC(40%), за ними следовали экзосомы из стволовых клеток пуповины (10%). Менее чем в 10% исследований использовались экзосомы из других источников, включая эмбриональные стволовые клетки, PRP и плазму человека, клетки HUVEC, фибробласты, кератиноциты и макрофаги.

Предпочтительным источником травмы было иссечение кожи, в некоторых исследованиях применялся ожог. Экзосомы доставлялись к ранам путем подкожных инъекций.

Для выделения экзосом в 64% исследований использовалось ультрацентрифугирование, в 18% - специальные наборы для выделения экзосом, в 7% -комбинация методов ультрацентрифугирования и фильтрации, в то время как в 5% исследований использовалась фильтрация тангенциальным потоком.

Для визуализации и характеристики изолированных экзосом применяли комбинацию вестерн-блоттинга, проточной цитометрии, анализа отслеживания наночастиц и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). 

По результатам всех исследований сообщалось о благоприятных результатах экзосомальной терапии со значительным улучшением состояния или заживлением ран (независимо от модели, способа введения, концентрации экзосом, количества введений или источника экзосом). 

Так, введение экзосом стимулировало ангиогенез раны и значительно увеличило скорость заживления ран в 81% случаях. Другие основные результаты действия экзосом включали увеличение выработки коллагена, повышение жизнеспособности клеток раневого ложа, снижение фиброгенеза и уменьшение некроза лоскута и уменьшение образования рубцов.

Ученые сделали вывод, что 13 уникальных белков и 14 микроРНК способствовали заживлению ран после их обработки экзосомами. 

Два исследования, проведенные He et al., 2019 и Kim et al., 2019 сообщили об ослаблении воспаления посредством процесса поляризации макрофагов; введенные экзосомы индуцировали изменение провоспалительного фенотипа M1 на противовоспалительный фенотип M2, таким образом влияя на каскад заживления и улучшая терапевтические результаты.

Аналогичным образом, в исследовании Su et al., 2020 сообщалось о подавлении активации Т-клеток во время фазы воспаления после введения экзосом. В другом исследовании Li Xiao et al., 2016 введение экзосом экспрессирующих miR-181c, значительно снижало экспрессию TLR4 макрофагами, что впоследствии уменьшало воспаление раны in vivo.

Лечение остеопороза с использованием экзосом 

Остеопороз - это заболевание, характеризующееся снижением костной массы, разрушением микроструктуры кости и частыми переломами, распространенное у пожилых людей. Переломы, особенно переломы шейки бедра и компрессионные переломы позвонков, являются наиболее частыми и опасными осложнениями остеопороза. 

Для изучения эффективности экзосомной терапии в отношении восстановления костей при остеопорозе в 2019-2022 годах в Китае были проведены 15 исследований (Chen CY et al 2019, Gong l et al 2020, Hu Y et al 2020 и др.). Общий объем выборки составил 242 животных, из которых ровно половина получали лечение экзосомами, а другая половина - плацебо. 

Для оценки эффективности экзосомной терапии были выбраны следующие характеристики испытуемых: 

· минеральная плотность костной ткани: является важным показателем для измерения массы и прочности костной ткани, который может отражать степень остеопороза и оценивать риск переломов;

· объем трабекулярной кости/объемная доля ткани: отражает костную массу трабекулярной кости в различных образцах;

· число, разделение и толщина трабекул: основные показатели для оценки пространственной морфологии и структуры костных трабекул; 

· толщина кортикального слоя: параметр, отражающий изменения свойств кортикальной кости, которые способствуют всестороннему пониманию роста кости и ее заболеваний.

Экзосомы, использованные в испытаниях, были получены из различных стволовых клеток человека и/или крыс/мышей, включая стволовые клетки, полученные из мочи (USCs), MSCпуповины человека (hucMSCs), MSC костного мозга (BMSCs) и MSC, полученные из жировой ткани (ADSCs). 

Пути доставки экзосом включали внутривенную инъекцию, также использовались зонд и инъекцию в надкостницу. Частота применения экзосом была распределена через день, еженедельно и два раза в неделю. Циклы лечения во всех исследованиях варьировались от одной недели до шести месяцев.

Результаты всех исследований, независимо от клеток, из которых были получены экзосомы, продемонстрировали эффективность экзосом при остеопорозе на животных моделях. 

Так, терапия экзосомами способствовала увеличению костной массы, улучшала микроархитектуру кости и повышала прочность костей путем уменьшения средней ширины костномозговой полости между костными трабекулами. Одновременно экзосомы значительно увеличивали толщину кортикального слоя трабекулярной кости, по сравнению с лечением плацебо, снижая риск потери костной массы и остеопороза. 

Экзосомы, полученные из стволовых клеток, способствовали анаболизму, а не катаболизму, смещая динамический баланс в сторону регенерации костной ткани.

Ученые сделали вывод, что различные нуклеиновые кислоты (микроРНК, lncRNAs и piRNAs), белки, липиды и другие активные молекулы в экзосомах стимулируют восстановление кости посредством индукции и разрастания новой костной ткани, усиленной остеогенной дифференцировки, пролиферации остеобластов, ингибирования апоптоза, стимулирования ангиогенеза и иммунной регуляции.

В то же время потенциальную полезность экзосом для лечения остеопороза у людей еще предстоит изучить на более крупных, биологически релевантных моделях животных: необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять возможные механизмы действия, а также подтвердить оптимальные терапевтические условия для экзосомной терапии, включая дозировку, концентрацию, цикл лечения и другие аспекты. 

Применение экзосом в лечении мужского бесплодия

Причины, вызывающие бесплодие у мужчин, многочисленны. Среди них -  генетические аномалии, повреждение яичек, варикоцеле, иммунологические нарушения, системные заболевания, факторы окружающей среды, эндокринные нарушения и воздействие гонадотоксических агентов. В дополнение к указанным факторам, по разным оценкам, в 10 - 35% случаев мужского бесплодия виноваты инфекционные агенты (грибы, паразиты, вирусы и некоторые другие микроорганизмы), вызывающие воспаление мужских половых органов и снижающие функцию сперматозоидов, приводя к бесплодию.

Мужское бесплодие проявляется в различных формах аномалий спермы, таких как, потеря мембранного потенциала митохондрий, увеличение апоптоза за счет активации каспазы 3 и повреждение ДНК. Кроме того, воспалительная реакция часто приводит к закупорке семенных канальцев.

Новым экспериментальным методом лечения мужского бесплодия является применение экзосом. На сегодняшний день экзосомная терапия показала многообещающие результаты в отношении восстановления сперматогенеза и регенерации сперматозоидов, благодаря своим противовоспалительным, антиоксидантным, регенеративным и антимикробным свойствам.   

Согласно исследованиям, проведенным на животных, экзосомы, полученные из амниотической жидкости, восстанавливали такие параметры сперматозоидов, как подвижность, концентрация, а также количество сперматогоний, сперматоцитов и, в конечном счете, возвращали мужскую фертильность (Mobarak et al., 2021). Сообщалось о защитном эффекте экзосом при повреждениях клеточных мембран и ДНК сперматоизодов при окислительном стрессе, вызванном процессом криоконсервации (Камар и др., 2019; Махиддин и др., 2020). Интересно, что обработка сперматозоидов экзосомами, полученными из MSC, в дополнение к улучшению параметров спермы после замораживания-размораживания, повышала ее адгезивные свойства за счет перемещения молекул адгезии, таких как CD44, CD29, CD54 и CD106 (Мокаризаде и др., 2013).

Недавно на базе Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова успешно завершилось открытое проспективное клиническое исследование по изучению эффективности и безопасности применения препарата МЕДИРЕК®, содержащего экзосомы, выделенные из MSC, на коллагеновом геле, у бесплодных мужчин с выраженными нарушениями сперматогенеза. 

Ученые сделали вывод, что терапия экзосомами способствует восстановлению ниши сперматогоний, увеличению общего количества сперматозоидов и повышению концентрации тестостерона. Также наблюдалось восстановление герминогенного эпителия, способного давать начало пригодным для оплодотворения сперматозоидам.

Вывод

Таким образом, мы видим, что применение экзосом в медицине стремительно развивается благодаря передовым технологиям производства экзосом и лучшему пониманию их биологических функций. Число исследований, подтверждающих терапевтическую роль экзосом также растет, одновременно, увеличивается число коммерческих разработок на их основе. И это логично, ведь экзосомы, в отличие от большинства лекарственных средств, демонстрируют очень низкую иммуногенность и представляют собой наиболее безопасный способ побудить определенные клетки к определенному действию. 

Однако некоторые аспекты этого нового способа межклеточной коммуникации ученым еще только предстоит выяснить. Например, до сих пор неясно, каким образом микроРНК, мРНК и белки избирательно загружаются в экзосомы и как экзосомы могут быть нацелены на определенные типы клеток. Более того, мы до сих пор не знаем, может ли определённая клетка секретировать субпопуляции экзосом с различным составом груза и функцией. Необходимы дополнительные исследования, чтобы определить потенциал и ограничения экзосом и их микроРНК-груза в межклеточной коммуникации, но результаты таких исследований обещают открыть совершенно новую перспективу в понимании межорганных перекрестных взаимодействий.