Экстази бесплатные пробы Ко Чанг

• • • • • • • • • • • • • • • • •

• • • • • • • • • • • • • • • • •

Гарантии ❗ Качество ❗ Отзывы покупателей ❗

• • • • • • • • • • • • • • • • •

👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇

Наши контакты:

▶️▶️▶️ (НАПИСАТЬ ОПЕРАТОРУ В ТЕЛЕГРАМ)️ ◀️◀️◀️

👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆

• • • • • • • • • • • • • • • • •

🚩 ИСПОЛЬЗУЙТЕ ВПН (VPN), ЕСЛИ ССЫЛКА НЕ ОТКРЫВАЕТСЯ!

🚩 В Телеграм переходить только по ссылке что выше! В поиске тг фейки!

• • • • • • • • • • • • • • • • •

Экстази бесплатные пробы Ко Чанг

В данной работе описывается методология получения штаммов L. Трансфицированных паразитов клонировали путем предельного разведения, а клоны с самой высокой интенсивностью флуоресценции у обоих видов были отобраны для дальнейшего использования в скрининговых анализах на наркотики. Простейшие паразиты рода Leishmania вызывают лейшманиоз — заболевание с разнообразными клиническими проявлениями, которое поражает миллионы людей во всем мире. Инфекция, вызванная L. Изучение большого количества препаратов-кандидатов с помощью доступных на сегодняшний день методик является достаточно сложным, учитывая, что они очень трудоемки для оценки активности соединений в отношении внутриклеточных форм паразита или для проведения анализов in vivo. В данной работе описывается генерация штаммов L. Вектор экспрессии с клонированным геном размножали в кишечной палочке , очищали, а наличие вставки проверяли методом ПЦР колонии. Очищенную плазмиду линеаризировали и использовали для трансфекции паразитов L. Интеграция гена была подтверждена методом ПЦР. Экспрессию гена eGFP оценивали методом проточной цитометрии. Флуоресцентных паразитов клонировали путем предельного разведения, а клоны с наибольшей интенсивностью флуоресценции отбирали с помощью проточной цитометрии. Простейшие паразиты рода Leishmania вызывают лейшманиоз — заболевание с широким спектром клинических проявлений. Это заболевание распространено в 98 странах, а его ежегодная заболеваемость оценивается в 0,9—1,6 миллиона случаев1. Виды Leishmania , патогенные для человека, подразделяются на два подрода, а именно L. Leishmania и L. Заражение некоторыми видами, относящимися к L. Подроды Leishmania , такие как L. Виды, принадлежащие к семейству L. Существующая химиотерапия против лейшмании, которая включает такие препараты, как пятивалентные сурьмяны, милтефосин и амфотерицин В, является высокотоксичной и дорогостоящей. Кроме того, к факторам, препятствующим эффективному лечению пациентов во всем мире, добавилась возросшая в последние десятилетия лекарственная устойчивость 5. Существенные различия были продемонстрированы между видами рода Leishmania в отношении восприимчивости к лекарственным препаратам, особенно между видами Нового и Старого Света 6,7. По этим причинам необходимо направлять усилия на выявление и разработку новых препаратов против лейшмании, уделяя особое внимание видоспецифичным подходам. Изучение больших библиотек лекарственных препаратов-кандидатов с помощью традиционных методологий является достаточно сложным, учитывая, что эти методики очень трудоемки для оценки активности соединений в отношении внутриклеточных амастигот или для проведения экспериментов in vivo 8 ; В связи с этим возникла необходимость в разработке новых методов, позволяющих уменьшить эти недостатки, включая внедрение репортерных генов и разработку высокосодержательных фенотипических скрининговых тестов 9. Использование репортерных генов показало потенциал для повышения эффективности процесса скрининга лекарственных средств, поскольку это облегчает разработку высокопроизводительных анализов и анализов in vivo. Рекомбинантные паразиты Leishmania , экспрессирующие несколько репортерных генов, были созданы различными исследовательскими группами. Эти подходы имеют ограничение, заключающееся в том, что они требуют сильного селективного давления в культуре, чтобы избежать элиминации эписомальной конструкции, а также использования дополнительных реагентов для выявления активности репортерного гена. И наоборот, зеленый флуоресцентный белок GFP и его вариант, усиленный зеленый флуоресцентный белок eGFP , были использованы при генерации большого количества трансгенных штаммов лейшмании для скрининговых анализов на лекарственные препараты in vitro благодаря их гибкости и чувствительности, а также возможности автоматизации процесса скрининга с помощью проточной цитометрии или флуорометрии Несмотря на многообещающие результаты, культуры этих трансгенных штаммов были крайне неоднородны по уровню флуоресценции, поскольку количество копий гена GFP не было одинаковым у всех паразитов. Кроме того, поддержание флуоресценции требовало постоянного селективного давления на паразитов в культуре, поскольку ген GFP был введен в эписомальную конструкцию. По причинам, изложенным выше, многие усилия были сосредоточены на разработке новых методологий получения стабильных рекомбинантных штаммов. Эти усилия в основном основывались на интеграции репортерных генов в рибосомные локусы, используя преимущества более высокой скорости транскрипции рибосомных генов Штаммы L. В различных группах были выведены штаммы L. Bolhassani et al. Они использовали интеграционный вектор pLEXSY, первоначально разработанный для трансгенной экспрессии белков в системе, использующей L. У этих паразитов флуоресценция однородна и поддерживается во внутриклеточных формах, что может быть обнаружено в поражениях подушечек лап инфицированных мышей В данной работе описана методика получения штаммов L. Штаммы, полученные в результате этого процесса, используются в нашей лаборатории для проведения скрининговых анализов на наркотики, которые оценивают потенциальную антилейшманийную активность молекул природного и синтетического происхождения. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Для поддержания стерильности образцов все этапы, связанные с культивированием паразитов, должны выполняться в колпаке уровня биобезопасности 2 BSL-2 или в соответствии с местными правилами охраны труда и техники безопасности. Графическое описание этого протокола можно найти на рисунке 1. Здесь изображены все шесть основных разделов, описанных в статье. Флуоресценция паразита подтверждается с помощью проточной цитометрии. Трансфицированные культуры могут быть обогащены для флуоресцентных паразитов путем клонирования путем ограничения разведения, а клоны с самой высокой средней интенсивностью флуоресценции могут быть отобраны для дальнейшего применения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Трансфекция L. В этом примере промастиготы L. Схематическое изображение интегрированной экспресс-кассеты и участков отжига праймера для диагностической ПЦР изображено на рисунке 2. Рисунок 2 : Схематическое изображение интегрированной кассеты экспрессии. Прямоугольники, помеченные как Chr-S серого цвета , представляют собой соседние хромосомные последовательности локуса 18S рРНК ssu , в который интегрирована экспрессионная кассета. Участки отжига прямых и обратных праймеров, используемых для проверки наличия вставки методом колонной ПЦР шаг 1. Участки отжига прямых и обратных праймеров, используемых для верификации геномной интеграции с помощью диагностической ПЦР шаг 5 , отмечены черными стрелками, помеченными как sat-fwd праймер F и ssu-rev праймер F соответственно, которые разграничивают продукт 2, При полном расщеплении очищенной плазмиды из позитивных колоний с помощью Swa I при гель-электрофорезе должны быть получены два характерных фрагмента: фрагмент массой 2,9 к.. После трансфекции поликлональный отбор производится в основном качественно. Состояние культур паразитов во время отбора антибиотиками контролируется под микроскопом, обращая особое внимание на морфологию и подвижность паразитов. После успешного восстановления культуры трансфицированных паразитов в канале FL-1 проточного цитометра должны быть обнаружены те, которые эффективно экспрессируют eGFP рис. Эти результаты гарантируют, что будут получены рекомбинантные паразиты, которые конститутивно экспрессируют eGFP в виде интегрированного трансгена и будут оставаться стабильными в последующих пассажах культуры паразитов. Клонирование путем предельного разведения позволяет обогащать популяцию флуоресцентных паразитов с более низкой эффективностью трансфекции, таких как L. Для каждого из использованных в работе видов Leishmania было получено по четыре клона табл. A Репрезентативные результаты ПЦР колонии. Дорожка 1: лестничная лестница размером 1 кб блоки в парах оснований ; дорожки 2, 10 и отрицательные образцы на наличие вставки eGFP; дорожки и положительные пробы на наличие вставки eGFP. B Результаты линеаризации с помощью лестницы Swa I. Lane 1: 1 kb единицы в парах оснований ; дорожки реакции пищеварения плазмид, очищенных от трех различных колоний, положительные на наличие вставки eGFP. Рисунок 4 : Репрезентативные результаты подтверждения экспрессии eGFP и хромосомной вставки экспрессионной кассеты. A Гистограмма проточной цитометрии в канале FL B Сравнение результатов трансфекции между L. Более высокая эффективность трансфекции наблюдалась у L. C Результаты ПЦР для подтверждения геномной интеграции. L: лестница Таблица 1: Клоны, полученные путем предельного разведения. Четыре клона были получены путем предельного разведения для каждого из видов Leishmania , использованных в данной работе. Для каждого клона указывается процентное содержание флуоресцентных паразитов и средняя интенсивность флуоресценции. Преимущества и недостатки различных репортерных генов были изучены у нескольких простейших паразитов. Флуоресцентная активность этих белков может быть обнаружена с минимальными манипуляциями с помощью флуоресцентной микроскопии, флуориметрии или проточной цитометрии. Было проведено мало исследований по генерации GFP-экспрессирующей L. Viannia , несмотря на продемонстрированную устойчивость GFP и их производных в качестве репортерных генов у видов Leishmania Старого Света 15,16,18, Varela et al. Анализ проточной цитометрии как аксенических промастигот, так и внутриклеточных амастигот показал полезность этих паразитов для скрининговых анализов лекарственных препаратов. Однако флуоресценция была очень неоднородной, а количество флуоресцентных паразитов в трансфицированной популяции зависело от постоянного селективного давления антибиотиком туникамицином. Эти факты ограничивают использование этих паразитов в качестве внутриклеточных амастигот для скрининговых анализов на наркотики, учитывая, что туникамицин не может быть добавлен к инфицированным макрофагам 38 , в результате чего паразиты с низкой флуоресценцией присутствуют в популяции внутриклеточных амастигот, что может повлиять на количественную оценку инфицированных макрофагов. Использование таких векторов, как pLEXSY, представляет собой мощный и надежный инструмент для стабильной модификации паразитов вида Leishmania путем интеграции трансгенов посредством гомологичной рекомбинации Доказано, что использование этой системы обеспечивает стабильную и однородную экспрессию целевого белка Эти характеристики благоприятствуют экспрессии eGFP и его использованию во внутриклеточных анализах с однородными уровнями флуоресценции в инфицированных клетках, а также его использованию для экспериментальных инфекций на мышиных моделях. В этом протоколе есть несколько важных шагов для получения оптимальных результатов. Во-вторых, отбор рекомбинантных клонов после трансформации в E. Кроме того, темпы роста L. Во время проведения экспериментов, описанных в этой статье, L. Темпы роста также могут варьироваться от штамма к штамму в разных лабораториях; Поэтому для оценки времени, необходимого для достижения концентрации паразита, необходимой для электропорации, необходимо охарактеризовать скорости роста лабораторных штаммов. Использование буфера, о котором сообщили Bolhassani et al. При поликлональной селекции крайне важно не допустить перерастания электропорированных культур перед добавлением селективного антибиотика; В противном случае нерекомбинантные паразиты перерастут рекомбинантных Потребуется один или два последовательных прохода посев в свежую среду с соответствующим антибиотиком, чтобы получить мутную культуру устойчивых к антибиотикам рекомбинантных паразитов и четкий отрицательный контроль. Пассажи должны быть сделаны в течение 5 дней после первого добавления антибиотика. В то время как у L. По этой причине факультативный этап клонирования путем ограничения разведения является модификацией, которая в основном требуется для получения популяции L. Использование плазмид pLEXSY ограничено геномной модификацией видов Leishmania , поскольку изначально они были разработаны для использования L. Метод, описанный в этой статье, позволяет производить рекомбинантных паразитов Leishmania с конститутивной и стабильной экспрессией eGFP или любого другого интересующего нас репортера. У этих паразитов флуоресценция однородна, и она поддерживается во внутриклеточных формах. Таким образом, штаммы, полученные в ходе этого процесса, могут быть использованы для стандартизации высокопроизводительных скрининговых анализов лекарственных средств для оценки потенциальной антилейшманийной активности молекул природного и синтетического происхождения. Carrasco, J. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Genetics. Клонирование с помощью Kpn I приводит к слиянию белка-мишени с С-концевой полигистидиновой меткой из шести остатков, за которой следует стоп-кодон, кодируемый в плазмиде pLEXSY По этой причине последовательность обратного праймера не содержит стоп-кодона. Амплифицировать ген-мишень с помощью полимеразы высокой точности, чтобы обеспечить сохранность кодирующей последовательности. Добавьте праймеры в конечной концентрации 0,2 мкМ. Очищают фрагмент с помощью обычного набора для очистки продукта ПЦР или стандартного осаждения ацетата натрия и этанола, как описано в другом месте Очистите реакцию, как описано в шаге 1. Трансформируют компетентные клетки E. Скрининг на наличие вставки в плазмидах методом колонной ПЦР. Используйте прямой праймер для амплификации eGFP, описанный в шаге 1. Праймер А предназначен для отжига Праймеры добавляются в конечной концентрации 0,2 мкМ. Подготавливают очищенную плазмидную ДНК из положительного клона для последующей трансфекции с помощью коммерческого набора для выделения плазмид или стандартного щелочного осаждения Пропустите продукт сбраживания в электрофорезе агарозного геля, чтобы отделить полученные фрагменты. В результате этого разложения образуются два фрагмента: фрагмент массой 2,9 к.. Очистите кассету для сцеживания с помощью коммерческого набора для экстракции агарозным гелем. Выращивайте культуры паразитов до тех пор, пока не накопится достаточное количество промастигот в логарифмической или ранней стационарной фазе, чтобы использовать примерно 4 x 10 7 паразитов за одну трансфекцию. Максимальная плотность клеток на культуральную колбу до достижения стационарной фазы может варьироваться в зависимости от вида Leishmania и того, насколько хорошо штаммы адаптированы к лабораторным условиям. При необходимости объедините содержимое нескольких колб с культурой. Центрифугируют культуру паразитов при 2 x g в течение 3 мин при комнатной температуре RT. Поставить на лед на 10 мин. Добавьте в пробирку с линеаризованной плазмидой мкл предварительно охлажденных паразитов и перенесите все мкл в электропорационную кювету на льду. Параллельно электропорируют клетки паразита без плазмидной ДНК в качестве отрицательного контроля. Электропорация по одному из этих двух протоколов: Экспоненциальный спад: В, мкФ, один импульс. Поставьте кювету обратно на лед на 10 мин и перенесите электропорированных паразитов в 5 мл соответствующей питательной среды. Поликлональный отбор в культуре Примерно через 20 ч после электропорации наблюдают за культурами под микроскопом. Наблюдайте за посевами под микроскопом до тех пор, пока не будет видна четкая разница между паразитами, электропорированными с плазмидной ДНК и без нее. Проверьте флуоресценцию паразита с помощью проточной цитометрии. Центрифугу 1 мл культуры в неподвижной фазе при 2 x g в течение 3 мин при RT. Настройки усиления для прямого и бокового рассеяния, а также канала FL1 могут различаться в зависимости от цитометра. Для этого примера был использован цитометр CyFlow space Sysmex. Запустите контрольную выборку с нефлуоресцентными паразитами, чтобы определить популяцию паразитов на точечной диаграмме FSC и SSC. Создайте вентиль G1 , содержащий популяцию паразитов, и отфильтруйте канал FL-1 через этот вентиль для определения автофлуоресценции промастигот и установки вентили диапазона G2 для канала FL Запустите трансфицированных паразитов, чтобы проверить, есть ли флуоресценция. Запишите процент флуоресцентных паразитов в G1 и среднюю интенсивность флуоресценции в G2. Добавьте мкл этого разведения в каждую лунку луночного планшета. Оставьте тарелку нетронутой минимум на 12 часов. Следите за планшетом под микроскопом при минимальном увеличении x до тех пор, пока не будут обнаружены лунки с ростом паразитов. Когда лунка планшета заполнена паразитами, используйте содержимое для посева культуры объемом 5 мл. Это занимает недели. Когда клонированные культуры достигнут стационарной фазы, проверьте флуоресценцию с помощью проточной цитометрии, как описано в шаге 4. Выберите клоны, которые будут использоваться для дальнейших анализов in vitro и in vivo на основе процентного содержания флуоресцентных паразитов и средней интенсивности флуоресценции, измеренной в канале FL Play Video. Cite this Article Carrasco, J. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close. The rate of migration varies with gel composition. Dilute to with sample before loading. The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender CE module and the pulse controller PC module , and a ShockPod cuvette chamber. Pkg of 50, 0. Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E. Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray. Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing.

Героин Долгопрудный купить