В настоящем исследовании, мы объединили в пробирке модель опухоли легких 3D с силикомарганца в модели для оптимизации предсказания реакции лекарственного средства на основе конкретных мутационный фоне. Модель генерируется на decellularized свиных эшафот, воспроизводящем тканеспецифические характеристики относительно внеклеточной матрицы состава и архитектуры, включая базальную мембрану. Мы стандартизирован протокол, который позволяет генерировать искусственную опухолевой ткани в течение 14 дней, включая три дня лечения наркозависимости. Наша статья содержит несколько подробных описаний 3D считывания методы скрининга , как определение индекса пролиферации Ki67 окрашивания в, апоптоз от супернатантах MELISA и оценки эпителиальной к переходу мезенхимальных EMT , которые являются полезными инструментами для оценки эффективности терапевтические соединения. Мы могли бы показать по сравнению с 2D-культуры сокращение распространения в нашей 3D модели опухоли, которое RELATред к клинической ситуации. Поток-биореактор был использован для регулировки культуры в физиологических условиях, в котором улучшено образование тканей. Кроме того, мы покажем интеграцию реакций лекарственных средств при лечении гефитинибом или TGF-бета-1 стимуляции - апоптоза, пролиферации и индекс ЕМТ - в булевское в силикомарганца модели. Кроме того, мы объясним, как наркотиков реакции опухолевых клеток с определенным мутационного фона и подсчетаerstrategies против сопротивления можно предсказать. Мы уверены , что наша 3D экстракорпоральное подход особенно с его расширением в силикомарганца обеспечивает дополнительную ценность для доклинических испытаний лекарственных средств в более реалистичных условиях , чем в культуре клеток 2D. Одной из причин этого дефицита является тот факт, что в настоящее время эффективность потенциальных новых соединений оценивают в крупномасштабных скринингов на клеточных культурах 2D-клеточных линий рака или в моделях на животных. Животные модели имеют более высокий уровень сложности , но есть существенные различия между мужчинами мышей и 6,7. В последнее десятилетие, модели рака 3D с использованием различных подходов были сформированы , чтобы преодолеть разрыв между 2D культуры раковых клеточных линий и комплекса в естественных условиях 6,8,9 опухоли. Воздействие 3D среды на дифференциации клеток , а также на передаче сигналов было показано в нескольких исследованиях лет назад например. Сегодня многие 3D - модели клеточной культуры имеются такие , как сфероида культур, гидрогели или микрожидкостных чипов Несмотря на то, Фесе модели повышения сложности по сравнению с традиционными системами 2D культуры, в большинстве случаев они испытывают недостаток в микросреду ткани, который, как известно, опухолевые поддерживающие эффекты, а также влияет на эффективность лекарственного средства. Таким образом, архитектура ткани и важными компонентами внеклеточного матрикса , таких как различные коллагенов, а также структуры базальных мембран сохраняются Кроме того, скорость распространения в нашей модели опухоли тканевой инженерии снижается по сравнению с искусственно высокими показателями, достигнутыми в 2D культуре. Поскольку распространение является важным параметром при оценке эффективности лекарственных средств, тестирование на наркотики включена в нашей модели более похожиусловия в естественных условиях 17 опухолей. Для того , чтобы оценить потенциал нашей модели , чтобы правильно спрогнозировать биомаркеров-зависимый эффективность препарата, мы здесь представить данные для двух различных клеточных линий рака легких , которые отличаются по своему статусу EGFR -biomarker. Этот мутационный статус начал определяться рутинно у пациентов с немелкоклеточным раком легких. Целенаправленные процедуры с ИТК , такие как EGFR Ингибитор гефитинибом против опухолей , несущих мутации EGFR активируя показать более высоких результатов по сравнению с теми , с платиновой химиотерапии на основе Мы создали несколько методов для чтения, что имеют отношение к оценке эффективности соединения. Кроме того, после того, как TGF-бета-1 стимуляции мы можем исследовать сложные действия в опухолевых клетках , которые начали процесс ЕМТ, который , как полагают, является важным шагом в злокачественной трансформации 22,23 и который соединен с оМ наркотиковCE В целях дальнейшего укрепления и ускорения наркотиков скрининга и столкнуться с сопротивлением, это дополняется в силикомарганца моделирования. На основе нескольких экспериментов, реакция опухоли может быть предсказано в силикомарганца относительно результатов для полного спектра лекарственных средств и их комбинаций. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. На основе эшафот SISmuc фиг. Эта модель позволяет определить индекс пролиферации и количественной оценки апоптоза с использованием MELISA , как показано на фиг. Рисунок 4 рисунке 5С и D. Моделирование известного драйвера мутации EGFR в красном и C-MET совместно активации в зеленом, значение около 0,7 показывает повышенную пролСкорость iferation кривая лосося и уменьшение скорости апоптоза фиолетово кривая с течением времени отражает гефитиниб в желтом сопротивления в HCC клетках происходит наряду с активацией МЕК и PI3K рис 6В, темно - зеленый и голубой. Рисунок 1. Пролиферация ставка снижается в 3D по сравнению с 2D культуре клеток. Шкала баров в А и В:. Рисунок 2. На й день начинается лечение. Супернатанты собирают и используют для MELISA для того , чтобы количественно оценить апоптоз в течение долгого времени Синие стрелки и коробки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3. Без какого - либо лечения, обе клеточные линии образуют монослой на SISmuc А и В , а также урегулировать прежние крипт структуры. В то время как модель роста клеток А не изменяется после обработки гефитиниб С , количество HCC клеток снижается сопровождается изменением в удлиненной формы клеток D. Рисунок 4. HCC клетки , культивируемые в 3D показывают общее выражение пан-цитокератином ФКК зеленый в A, A1 , но только единичные клетки экспрессируют виментин красный в A, а2. После того, как TGF-бета-1 стимуляции, клетки меняют свою морфологию в удлиненную форму и выражение виментину сильно увеличивается красный в B, б2 , тогда как экспрессия PCK сохраняется зеленый в B, B1. Шкала бар в B: мкм для A B. Рисунок 5. Динамическая Культура клеток Расширяет тканей поколения. Шкала бар в D:. Характерная опухоль считывания параметров пролиферации в лососе и апоптоз в фиолетовом представлены в виде шестиугольника. Стрелки указывают на активацию, торможение притупляются стрелки. Терапевтические мишени представлены темными и светлыми серыми прямоугольниками, ингибирование гефитинибом показан желтым цветом A. EGFR и C-MET коэкспрессией вызывает сопротивление Гефитиниб , как свидетельствует увеличение пролиферации кривая семга и объявленияecrease апоптоза фиолетово кривая после того, как о произвольной временной точке 8 В. C Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Модель в пробирке оценивает различные важные аспекты сложных действий , таких как изменение пролиферации опухолевых клеток и апоптоз на конкретном мутационного фона , который может быть также смоделированных в силикомарганца Здесь мы представляем стандартизированный протокол для 3D поколения модели опухоли и соединения тестирования включая количественную оценку пролиферации и апоптоза и создания Predictive в силикомарганца модели. Модель 3D опухолей основана на линии опухолевых клеток, несущих специфические мутации. Клетки выращивают на матрице decellularized ткани в клеточных коронок. Матрица decellularization, крепление между двумя металлическими кольцами клеточных коронок , монтаж системы биореактора, а также засев эшафоте были визуализированы в Jove , прежде чем Для стратифицированной медицины, идентификация мутаций druggable водителя путем секвенирования следующего поколения является серьезной проблемой , особенно в НМРЛ , и мы надеемся выявить новые генетические маркеры в будущем Для тестирования в пробирке, соединение интерес должна быть ориентирована на сайт , который очень активен в выбранной клеточной линии , или в первичных клетках. На первом этапе 3-го поколения модели опухоли, количество и культура клеток периода выбранной опухоли клетки должны быть AdjuSTED если используются клетки, отличающиеся от здесь упоминается. Для того, чтобы найти оптимальную концентрацию соединения, то целесообразно, чтобы определить величину IC50 с помощью коммерчески доступного анализа жизнеспособности в 2D. На основании этого теста, соединение следует использовать в концентрации IC 50 и следующей более высокой концентрации в 3D-модели. Мы выбрали три дня лечения, с одной стороны, с тем, чтобы получить результаты в течение двух-трех недель, и для легкого по сравнению с 2D-тест опухолевых систем, с другой стороны. Тем не менее, периоды лечения может быть продлен для исследования долговременного эффекта. Тем не менее, следует учитывать, что длительное лечение или высокие дозы тестируемого соединения может привести к полной потере клеток, тем самым предотвращая оценку пролиферации или других иммуногистохимических маркеров. Для надежного анализа сети сигнализации, опухолевые ответы при обработке определенного соединения должны быть проанализированы различия между пролиферацией и APOптоз. Эти чтения ауты по-разному соединены в сети сигнализации. Таким образом, отличительной анализ обоих параметров позволяет лучше понять действия препарата и последующего целевого прогнозирования. Как упоминалось ранее, пролиферацию опухолевых клеток уменьшается в нашей 3D-модели по сравнению с 2D условиях культивирования, и, таким образом, следует уменьшить ложно-положительных результатов испытанных цитостатических соединений. Для определения индекса пролиферации, общее число ядер и число ядер, положительных в отношении Ki67 окрашивания должны быть определены количественно с помощью программного обеспечения Фиджи, например. Это может быть упрощено путем использования макросов в 2D культурах опухолевых клеток, которые, однако, не представляется возможным, если клетки образуют плотные агрегаты, так как это приводит к более низким или более высоким числом ядер, соответственно. Во всех случаях, макро-параметры должны быть скорректированы тщательно для каждой линии и окрашивания клеток. Апоптоз может быть количественно определена неинвазивно из супернатантов измерения каспазы-расщепляется цитокератин 18, ВГIch ограничена клетками с эпителиальными характеристиками, с использованием MELISA. Это имеет несколько преимуществ: I Это позволяет контролировать эффективность проводимого лечения с течением времени и определить начальную точку эффективного лечения. II Образцы не разрушаются и могут быть использованы для других методов считыванием. III , апоптоз клеток эпителиальной можно отличить от мезенхимального апоптоза, который является оптимальным в условиях совместного культивирования. Этот метод, однако, может быть неподходящим для опухолевых клеток, подвергшихся EMT, тем самым теряют эпителиальную фенотип. Таким образом, выражение цитокератином 18 каждой линии опухолевых клеток, используемой должна быть проверена с помощью иммуногистохимического окрашивания перед применением этой методики. Тестирование соединений также может быть выполнена в более клеточноподобного фенотипа опухолевых стволовых клеток. Обычно в наркологической различные инвазивные стадии пренебрегают, хотя большинство из таргетных препаратов, таких, как ИТК, применяются в более поздних стадиях опухолей. Наша модель позволяет исследовать инвазивные или нетп-инвазивная опухолевые клетки, в связи с сохраненной базальной мембраной 17 , который клетки должны пересечь в процессе вторжения. Важнейшим шагом на пути к клеточной подвижности и инвазии является ЕМТ , которые могут быть вызваны в различных моделях рака легких путем стимуляции с TGF-бета-1 17, Это, однако, уменьшает пролиферацию и тем самым число клеток на эшафоте. Этот отрицательный побочный эффект может быть обойдена путем применения динамических условиях культивирования, что сильно увеличивает плотность опухолевых клеток в 3D-модели. Даже при том , что биореактор регулирует культуру в физиологических условиях, то необходимо учитывать , что свойства клеток и передача сигналов может быть под влиянием воздействия напряжения сдвига Использование В силикомарганца моделирования для ускорения клеточной линии конкретных Тестирование на наркотики Хотя только полуколичественный, последовательность событий правильно смоделирована нашими в силикомарганца модели по уходуполностью принимая во внимание известные мутации для каждой конкретной клеточной линии. Это включает в себя линии клеток специфические модификации различных уровней активации рецептора, степень, в которой участвуют киназ активируются и когда и как долго выход сети, такие как апоптоз или пролиферацию следовало ожидать. Впоследствии модель в силикомарганца вычисляет соответствующее поведение сети в течение долгого времени, например. Следовательно, новый терапевтический потенциал комбинации могут быть быстро предварительно оценены в силикомарганца, которая служит в качестве основы для дальнейшего тестирования в лабораторных условиях. Кроме того, выходные данные экспериментов ин витро можетиспользоваться для уточнения в системе силикомарганца сетевыми корректировками , которые соответствуют экспериментальные результаты лучше всего. Полуколичественное в стратегии силикомарганца имеют некоторые ограничения относительно размера сети около белок-белковых взаимодействий можно считать. Кроме того, она имеет решающее значение для интеграции всех ключевых белковых узлов в топологии сети, чтобы получением реалистичных результатов. Таким образом , в силикомарганца модель дает лишь приближение существующей сети в клетке живой опухоли. Тем не менее, это целенаправленный вид позволяет моделировать конкретные изменения , представляющие интерес. Это помогает нам систематически понять сложность таких сигнальных сетей рака, а также получения новых терапевтических стратегий. В заключение, мы убеждены в том, что мы разработали полезную ткань сконструированную в пробирке инструмент , который может быть легко интегрирован в precliское тестирование на эффективность отдельных лекарственных соединений и их комбинаций. Для снижения затрат и времени тестирования, эта модель опухоли , кроме того , дополнена в инструмент прогнозирования силикомарганца позволяет расширить собранные данные камерного типа специфического прогнозирования эффектов препарата и комбинации лекарственных средств , включая клиники , ориентированных на целевые терапии или новых игроков , чтобы рассмотреть например. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Bioengineering. Изменение средней каждые 2 - 3 дня. Разделите клетки два раза в неделю. Клетки используют до прохода 20 не будет достигнуто. Выполните культуру, как указано выше. Проверьте клетки регулярно каждые 4 - 6 недель для загрязнений, таких как микоплазмы загрязнениями. Культивирование A или HCC клеток на покровные стекла Поместите 1 стерильный покровного стекла в каждую лунку луночного планшета с использованием пинцет. Семенной опухолевых клеток обеих клеточных линий в объеме мкл в лунках сстеклянные покровные, соответственно. За это время отсасывает старой среды с использованием пипетки Пастера и добавляют мкл свежей среды, через каждые 2 - 3 дня культивирования. Семенной клеток либо HCC или клеток А в общем объеме мкл на сторону бывших просвете кишечника зафиксированной в клеточных коронок. Добавьте 1 мл среды внутри клеток короны и 1 мл снаружи. Изменение культуральной среды через каждые 2 - 3 дня. Динамические условия культивирования Настройка тестовой системы опухоли с decellularized матрицей внутри клетки коронок и посевом клеток, как описано в подразделе 2. Соберите автоклавного биореактор и вставьте посеяны SISmuc, опубликованной ранее Изменить всю культуральную среду после того, как 7 дней. Для этого переместите биореактор из инкубатора под колпаком с ламинарным потоком. Аспирируйте среду в СМИ колбу с помощью пипетки Пастера. Поднимите биореактор, аспирируя избавиться от среды в системе трубопроводов. Пипетка 45 мл свежей среды в колбу. Поместите биореактор обратно в инкубатор и подключить его к насосу. Лечение статической модели с опухолью Gefitinib Культура модель опухоли, как описано в разделе 2. Изменение среды на й день, как описано в пункте 3. Измените среда с добавлением TGF-бета-1 каждые 2 - 3 дня до й день, как описано в разделе 4. Кроме того, взять пробу перед обработкой Т0. В статических условиях культивирования, можно получить до мкл пробы из внутренней части клеточной короны. В динамических условиях культивирования, винт шприц на устройстве для отбора проб и принимать по 1 мл среды из системы биореактора. MELISA для Апоптоз Количественное Для количественной оценки апоптоза в супернатанты выполнения анализа гибели клеток в соответствии с инструкциями изготовителя. Разрешить все реагенты для достижения RT перед выполнением анализа. Vortex все реагенты. Разведите промывочную таблетку в мл свежей деионизированной водой. Развести конъюгат пероксидазы хрена с 9,2 мл Сопряженных разбавляющего буфера и перемешать. Пипетка 25 мкл стандарта или пробы на лунку. Закройте планшет и инкубировать ее на шейкере в течение 4 ч при комнатной температуре. Промыть пластины вручную, в 5 раз с мкл приготовленного промывочного раствора. Инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин. Добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку. Встряхните планшет в течение 10 секунд и оставьте микропланшет в течение 5 мин перед чтением абсорбцию. Определяют оптическую плотность при длине волны нм в ридере для микропланшетов. Вычислить стандартную кривую и концентрации в образцах, используя соответствующую программу для обработки данных типа ELISA, такие как происхождение. Иммунофлуоресцентного Окрашивание 3D - модели Для иммунофлуоресцентного окрашивания, выполнить поиск антигена путем размещения депарафинировали и регидрировали слайды в пароварке с предварительно нагретым цитратного буфера рН 6,0 в течение 20 мин. Примечание: Смотрите таблицу материалов и оборудования для приготовления цитратного буфера. Удалить блокирующий сыворотку прижав слайды бумажной салфеткой и нанести первичное антитело к окруженным секций в разведении в соответствии с инструкцией производителя кролик анти Ki67 1: , кроличьими анти виментину 1: , мышь анти пан-цитокератином 1 : Для получения двойного окрашивания, необходимо использовать первичные антитела из разных видов хозяев. Тщательно смыть несвязанного антитела с промывочным буфером три раза в течение 5 мин. Для выявления специфических антиген-антитело привязок, применяют вторичные антитела в разведении 1: до секций и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Смыть УНБкруглый вырез антитела с промывочным буфером три раза в течение 5 мин. Выполните шаги 5. Выполните все действия, описанные в луночного планшета на качающейся платформе и удаления реагентов опрокидыванием планшета. Для монтажа, определить каплю водной среды, содержащей DAPI для контрастное ядер на немелованной предметное стекло и передать покровное к нему с клетками, с которыми сталкивается монтажную среду с помощью щипцов. Дайте ему высохнуть, прежде чем визуализации. Определение индекса пролиферации Выполните иммунофлуоресцентногоокрашивание против Ki67 в соответствии с разделом 5. Возьмем флуоресцентных изображений срезах тканей или 2D культивированных клеток с помощью инвертированного микроскопа. Для количественной оценки, использовать 10 изображений 3D-секций или 5 изображений 2D культур увеличение 20х каждого состояния из непересекающихся частей образца. Определить количество ядер и количество ядер положительно для Ki67 в 2D Граф Ki67 положительных ядер вручную , используя счетчик плагин ячейки программного обеспечения Фиджи Нажмите кнопку 'Initialize' и выберите тип счетчика. Нажмите на каждую Ki67 положительного ядра. Количество кликов отображается рядом с выбранным типом счетчика. Для автоматического подсчета клеток от общего числа ядер создать макрокоманду , используя Фиджи 27, Adjусть макрос для каждого окрашивания и клеточной линии. Ниже смотрите пример того, как создать макрос. Начало записи макросов. Нажмите 'Повышение контрастности', установите 'насыщенный', как '1' и 'нормализации'. Установите 'нерезкой маски' для повышения резкости изображения. Нажмите кнопку 'автоматический порог', выберите метод 'RenyiEntropy' с 'белые объекты на черном фоне', чтобы binarise изображение. Нажмите кнопку 'Создать', чтобы сохранить макрос для анализа дальнейших изображений. Определить количество ядер и количество ядер положительных для Ki67 в 3D вручную, как описано в подразделе 5. В Silico поколения Опухоль модели и моделирование Анти- EGFR терапии в клетках HCC Сетевое поколение с помощью анализа сетевого программного обеспечения Используйте различные известные базы данных для формирования сети опухоли на основе важных экспериментальных параметров Считывание и мутационный фоне HCC клеточной линии. Открытое программное обеспечение 21 сетевого анализа , чтобы визуализироватьсеть. Установившаяся анализ отражает систему равновесия и ответственность на сигнальные раздражители например. Нажмите кнопку 'Выполнить анализ': Примечание: Далее ОТРЯД применяется экспоненциальная функция для интерполяции логическое подключение к сети, что позволяет динамическое моделирование поведения сети с течением времени цветные кривые сигмовидной активности. Нажмите кнопку 'OK' для сохранения протокола. Нажмите кнопку 'Reset', чтобы начать новую моделирования. Перейти к панели «Параметры»: Используйте те же узлы для графического представления, как описано в разделе 6. Нажмите кнопку 'Сброс', чтобы закончить моделирование. Play Video. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close.

Экстази бесплатные пробы Бирмингем

Закладки Шишки Кемь

Экстази бесплатные пробы Бирмингем

Метадон Шу Купить закладку

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

Экстази бесплатные пробы Бирмингем

Конопля Конаково купить

Экстази бесплатные пробы Бирмингем

Birmingham Prison

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

Йонъин купить WAX картриджи

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

Report Page