Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы и декорина в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека - Биология и естествознание дипломная работа

Главная

Биология и естествознание
Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы и декорина в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека

Строение и классификация гликозаминогликанов. Биосинтез, локализация и функции протеогликанов. Состав протеогликанов в трансформированных клетках. D-глюкуронил С5-эпимераза. Выделение РНК фенольным методом. Проверка чистоты РНК на содержание примеси ДНК.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Министерство образования и науки Российской Федерации
Новосибирский Государственный Университет
Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы и декорина в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека
К.б.н. Григорьева Эльвира Витальевна
Нами было высказано предположение, что происходит изменение в процессе биосинтеза декорина. Известно, что ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфат протеогликанов (в том числе и декорина) является D-глюкуронил С5-эпимераза - фермент, который осуществляет модификацию углеродной цепи хондроитинсульфата в дерматансульфат. Возможно, что происходит нарушение экспрессии либо активности этого фермента, что приводит к нарушению структуры и состава протеогликанов в опухолевых клетках.
Основной проблемой в изучении данного вопроса является то, что ген D-глюкуронил С5-эпимеразы до сих пор не клонирован и ранее работы с этим геном не проводились. Однако после окончания секвенирования генома человека методом компьютерного анализа была обнаружена последовательность ДНК, гомологичная гену D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши. Это позволило начать нам начать работу по изучению экспрессии человеческого гомолога мышиной D-глюкуронил С5-эпимеразы и ее корреляции с экспрессией гена декорина в опухолевой ткани молочной железы человека.
Таким образом, целью данной работы являлось: установление взаимосвязи между экспрессией гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и гена декорина в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.
Молекулы гликозаминогликанов (ГАГ) представляют собой неразветвленные углеводные цепи с характерными повторяющимися дисахаридными единицами, которые включают в себя гексозамин (D- глюкозамин или D-галактозамин) и уроновую кислоту (D-глюкуроновую или L-идуроновую), присутствующую во всех ГАГ, за исключением кератансульфата, где она замещена остатками галактозы (рис.2).
В зависимости от гексозамина, входящего в состав углеводной цепи гликозаминогликана, выделяют следующие основные классы гликозаминогликанов: гиалуроновая кислота (ГК), гепарансульфаты/гепарин (ГС/Ге), хондроитинсульфаты (ХС), дерматансульфаты (ДС), кератансульфаты (КС) (рис. 2)
Если в состав ГАГ входит глюкозамин, то углеводную цепь относят к классу ГС/ Ге, если в состав входит галактозамин, то углеводную цепь ГАГ относят к классу ГС/ ДС [1].

Глюкуроновая кислота в гепарансульфатах и дерматансульфатах может быть эпимеризована в идуроновую кислоту под действием фермента D-глюкуронил С5-эпимеразы (рис. 3). Степень эпимеризации варьирует в различных тканях и зависит от структуры корового белка [2].
Рис. 3. Эпимеризация глюкуроновой кислоты в идуроновую кислоту
Посттрансляционная модификация ГАГ заключается не только в эпимеризации остатков уроновых кислот, но и в последующем специфическом присоединении отрицательно-заряженных групп SO42- и СOO -. За исключением гиалуроновой кислоты все ГАГ в различной степени могут быть О-сульфатированы (рис. 4), а гепарин и гепарансульфат кроме того могут содержать N-сульфатированные группы в остатках глюкозамина [1].

Степень сульфатирования ГАГ намного выше, чем других макромолекул и достигает 3-4 сульфатных групп на дисахарид.
Благодаря сульфатным и карбоксильным группам ГАГ имеют очень высокую плотность отрицательного заряда, что во многом определяет их биологические свойства и регулирует их взаимодействие с другими молекулами.
Биосинтез и распад гликозаминогликанов (ГАГ) осуществляются при участии выс окоспецифичных ферментов - гликозилтрансфераз и гликозидаз (сульфатаз) в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) и аппарате Гольджи.
Биосинтез ПГ начинается с синтеза тетрасахаридного связывающего участка и последующей полимеризации ГАГ цепи (рис. 5).
Основные ферменты, участвующие в синтезе тетрасахарида, указаны в Табл.1
Табл. 1. Основные ферменты синтеза тетрасахаридного сязывающего региона
Синтез протеогликанов начинается в ЭПР переносом ксилозы от UDP-ксилозы на остаток серина корового белка, осуществляемое ферментом О-ксилозилтрансферазой (XylT) [3]. Последующее добавление двух галактозных остатков, производимое двумя различными галактозилтрансферазами (GalT-I, GalT-II ) происходит в начальных/средних отделах аппарата Гольджи. В качестве донора галактозных остатков используется UDP-галактоза. Одна галактозилтрансфераза образует в-1,3-, а другая-- в -1,4-гликозидную связь[4]. Затем присоединяется глюкуроновая кислота при помощи фермента глюкуронилтрансферазы-1 (GlcAT-I), которая завершает синтез тетрасахаридного связывающего участка (Xyl-Gal-Gal-GluAU)[4].
Дальнейший синтез заключается в последовательном присоединении уроновой кислоты и гликозамина/галактозамина [5].
Табл. 2. Основные ферменты биосинтеза протеогликанов
Хондроитинсульфат-4-сульфотрансфераза
Хондроитинсульфат-6-сульфотрансфераза
Дераматансульфат- 6- сульфотрансфераза
Дерматансульфат- 2- сульфотрансферза
Элонгация тетрасахарида начинается с добавления GalNAc ферментом галактозилтрансферазой (вGalNAcT-I), затем в биосинтез включается фермент глюкуронозил-трансфераза, которая присоединяет остаток глюкуроновой кислоты.
После завершения синтеза углеводной цепи происходит ее модификация - эпимеризация глюкуроновой кислоты, проводимая ферментом D- глюкуронил С5-эпимеразой (С5-EPI) и сульфатирование/деацетилирование, проводимое ферментом N-деацетилаза/сульфатаза. Затем сульфотрансферазы проводят сульфатирование по различным положениям (см. Табл. 2) [6].
Таким образом, образуются полностью модифицированные зрелые молекулы протеогликанов, которые транспортируются к месту назначения.
Известно, что в опухолевых клетках состав протеогликанов изменяется. Показано, что в клетках практически всех исследованных опухолевых тканей происходит увеличение содержания протеогликанов по сравнению с нормальной тканью: в опухолевых клетках карциномы желудка происходит увеличение содержания ПГ по сравнению с нормальной тканью в два раза [26], в карциноме поджелудочной железы в 4 раза [27], в карциноме прямой кишки - в 2 раза [28].
В опухолевых клетках происходит снижение сульфатирования ГАГ - в клетках карциномы желудка в 10 раз увеличивается содержание несульфатированных дисахаридных единиц, однако происходит увеличение сульфатирования ХС и ДС цепей по 6-сульфо-положению в 4 раза [26]. В клетках аденокарциномы кишечника увеличивается число несульфатированных единиц в 3 раза, в 3 раза уменьшается количество 4-сульфатированных единиц, увеличивается в 5 раз количество дисахаридных единиц, сульфатированных по 6-положению [29].
Показано, что изменяется структура ПГ в опухолевых клетках - в лейомиоме количество остатков L-идуроновой кислоты в уменьшается по сравнению с нормой с 55% до 45% [32].
Для многих опухолей показано изменение соотношения ДС и ХС. В карциноме желудка увеличивается содержание ХС по сравнению с нормой в 4 раза [26], в карциноме поджелудочной железы содержание ХС увеличивается в 22 раза [27], в клетках карциномы гортани - в 5 раз [30], в аденокарциноме кишечника - в 11 раз [29]. Для опухоли прямой кишки показано, что содержание хондроитинсульфатов увеличивается с 27% до 70% [28], в карциноме молочной железы содержание ХС увеличивается на 32,2 % [31].
Наряду с увеличением хондроитинсульфатов происходит снижение содержания дерматансульфатов, характерных для непролиферирующих тканей.
Для опухоли прямой кишки показано, что содержание дерматансульфатов падает с 73% до 30% [28], в карциноме молочной железы содержание ДС падает на 18,5 % [31]. Лучше всего изменения показаны для ДСПГ декорина.
Отсутствие других публикаций по данному вопросу не позволяет сказать, есть ли какая-либо ткане- или видоспецифичность в экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы у человека и одинаковы ли экспрессия/активность этого фермента в нормальных и опухолевых тканях, существует ли связь между изменением состава ПГ и изменением экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы.
Данная работа посвящена исследованию взаимосвязи экспрессии декорина и D-глюкуронил С5-эпимеразы в клинических образцах нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.
Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовались праймеры, синтезированные в компании "Лаборатория Медиген", Новосибирск.
Праймеры для человеческого гомолога гена мышиной D-глюкуронил С5-эпимеразы (GI:29740243), для гена декорина человека (NM001920,GI:19743844), гена в-актина человека, гена GAPDH (NM_002046.2, GI:7669491).
Последовательности нуклеотидных праймеров
5' - CCAGTGAAGGTGTATCCTTGCAACT - 3'
5' - CTACCGGTGTGCTTTGCCCTGCTGC - 3'
5' - TGGGATCCATATGCGTTGCTTGGCAGCT - 3'
глюкуронил эпимераза опухолевый клетка
К 40мкл раствора выделенной РНК добавляли 20мкл раствора 8М LiCl, перемешивали и инкубировали на льду 30 мин. Центрифугировали 15 мин, на Eppendorf 5415D, при 12006g и аккуратно удаляли супернатант.
Сразу же добавляли к осадку 200мкл предварительно охлаждённого 80% этилового спирта. Аккуратно удаляли спирт. Осадок сушили 15мин на 370С. Растворяли осадок в 40мкл воды.
2.2.3 Проверка чистоты выделенной РНК на содержание примеси ДНК
Проводили ПЦР реакцию с выделенной РНК и праймером для в-актина. Поскольку фермент Taq-ДНК-полимераза не работает с матрицы РНК, реакция не должна проходить.
ПЦР проводили в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, pH 8,3 на амплификаторе «Терцик» (Компания "ДНК Технологии", Россия). Обьем реакционной смеси составлял 20 мкл, с содержанием ~100 нг геномной ДНК, 2 мкл 10x ПЦР-буфера, 20 пмоль праймера, 0,2 ммоль каждого дезоксинуклеотидтрифосфата и 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы. Реакционную смесь покрывали равным объёмом минерального масла. ПЦР проводили при следующих условиях: начальная денатурация 3 мин при 95 оС, далее 27 циклов при следующих условиях: денатурация 7 мин при 95,0оС, отжиг праймеров 15 сек при 55,0оС, элонгация 3 сек при 72,0оС.
Табл. 3. Эволюционная консервативность белковой последовательности D-глюкуронил С5-эпимеразы
Гомология нуклеотидной последовательности
Гомология аминокислотной последовательности
Компьютерный анализ показал высокую гомологию нуклеотидной последовательности у мыши и быка с человеком- 81% и 84% соответственно (см. Табл. 3), еще больше оказалась гомология аминокислотной последовательности- 96% у мыши и 97% у быка.
Анализ нуклеотидных замен показал, что в основном, происходили замены в 3, 6, 9…3n положении, что, как правило, не приводит к смене аминокислоты.
По всей видимости, D-глюкуронил С5-эпимераза играет важную роль в жизни клетки, и мутации, приводящие к смене аминокислот, элиминировались в процессе эволюции отбором.
DNA: GGCTGGAGCTGCGGCACCGCAGGCCTGAGCCACCCCTTCTCTGCTGTCTCC+1: G W S C G T A G L S H P F S A V S
DNA: TTCTCTTCCTCAGGGCTCCCGTGTCTGCTCGCCCTCCGACGCTGCTCAGGA+1: F S S S G L P C L L A L R R C S G
DNA: ATTTGACAAGAAACTGAAGTTTTGATTCAGATATATTTTGAATTGAAACCA+1: I * Q E T E V L I Q I Y F E L K P
DNA: GAGATGTTCTAGAGTTTAGATTCTTTCATTTGATTAAGGTATGGTCTGAAT+1: E M F * S L D S F I * L R Y G L N
DNA: ATGCGTTGCTTGGCAGCTCGGGTCAACTATAAGACTTTGATTATTATCTGC+1: M R C L A A R V N Y K T L I I I C
DNA: GCACTCTTCACTTTGGTCACAGTACTTTTGTGGAATAAGTGTTCCAGTGAC+1: A L F T L V T V L L W N K C S S D
DNA: AAAGCAATCCAGTTTCCACGGCGTTCGAGTAGTGGCTTCAGAGTGGATGGG+1: K A I Q F P R R S S S G F R V D G
DNA: TTTGAAAAAAGAGCAGCAGCATCTGAGAGTAACAACTATATGAACCACGTG+1: F E K R A A A S E S N N Y M N H V
DNA: GCCAAACAACAGTCTGAGGAAGCATTCCCTCAGGAACAGCAGAAAGCACCC+1: A K Q Q S E E A F P Q E Q Q K A P
DNA: CCTGTTGTTGGGGGCTTCAATAGCAATGTGGGAAGTAAGGTGTTAGGGCTC+1: P V V G G F N S N V G S K V L G L
DNA: AAATATGAAGAAATTGACTGTCTCATAAATGATGAACACACAATTAAAGGG+1: K Y E E I D C L I N D E H T I K G
DNA: AGACGAGAGGGGAACGAAGTCTTTCTTCCATTCACTTGGGTTGAGAAATAT+1: R R E G N E V F L P F T W V E K Y
DNA: TTTGATGTTTATGGAAAGGTGGTTCAGTATGATGGCTATGATCGGTTTGAA+1: F D V Y G K V V Q Y D G Y D R F E
DNA: TTCTCTCATAGCTATTCCAAAGTCTATGCACAGAGAGCCCCCTATCACCCC+1: F S H S Y S K V Y A Q R A P Y H P
DNA: GATGGTGTGTTTATGTCTTTTGAAGGCTACAATGTGGAAGTCCGAGACAGA+1: D G V F M S F E G Y N V E V R D R
DNA: GTCAAGTGCATAAGTGGGGTTGAAGGTGTGCCATTATCTACACAATGGGGA+1: V K C I S G V E G V P L S T Q W G
DNA: CCTCAAGGCTATTTCTATCCAATCCAGATTGCACAGTATGGATTAAGTCAT+1: P Q G Y F Y P I Q I A Q Y G L S H
DNA: TACAGCAAGAATCTAACTGAGAAACCTCCTCACATAGAGGTATATGAAACA+1: Y S K N L T E K P P H I E V Y E T
DNA: GCAGAAGACAGAGACAAAAACAAGCCTAATGACTGGACTGTGCCAAAGGGC+1: A E D R D K N K P N D W T V P K G
DNA: TGCTTTATGGCGAATGTGGCTGATAAGTCTAGATTCACCAATGTCAAACAG+1: C F M A N V A D K S R F T N V K Q
DNA: TTTATTGCACCAGAAACCAGTGAAGGTGTATCCTTGCAACTGGGAAACACA+1: F I A P E T S E G V S L Q L G N T
DNA: AAAGATTTTATTATTTCATTTGACCTCAAGTTCTTGACAAATGGAAGTGTG+1: K D F I I S F D L K F L T N G S V
DNA: TCCGTGGTTCTAGAGACCACAGAAAAGAATCAGCTCTTCACTATACATTAT+1: S V V L E T T E K N Q L F T I H Y
DNA: GTCTCAAATGCTCAGCTAATTGCTTTTAAAGAAAGAGATATATACTATGGC+1: V S N A Q L I A F K E R D I Y Y G
Предполагаемый белковый продукт человеческого гомолога мышиной D-глюкуронил С5-эпимеразы анализировали с помощью различных компьютерных программ. Было показано, что продукт данного гена представляет собой:
· мембранный белок, который имеет трансмембранный домен (рис.10) 10-32 аминокислот (программы HMMTOP,SOSUIignal)
· сигнальный пептид расположен на N-конце белковой молекулы (программа Signal P V1.1)
· не заякорен через гликозилфосфатидилинозитол (GPI) (программа DGPI)
· наиболее вероятная локализация предполагаемого белка - в мембранах аппарата Гольджи (программа PSORT II)
Таким образом, предполагаемый продукт исследуемого гена по основным характеристикам аналогичен D-глюкуронил С5-эпимеразе быка и мыши, нуклеотидные последовательности всех трех генов также проявляют высокую степень гомологии.
Сравнив нуклеотидную последовательность (рис. 11) D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши, быка и человеческого гомолога, были выявлены наиболее консервативные участки у всех трех генов и подобраны праймеры к этим участкам.
Homo sapiens CACACAATTAAAGGGAGACGAGAGGGGAAсGAAGTCTTTCTTCCATTCA 400
Bos taurus CACACAATTAAAGGGAGACGAGAGGGGAATGAAGTCTTTCTTCCATTCA 347
Mus musculus CACACсATTAAAGGGAGACGAGAGGGGAATGAAGTTTTсCTTCCATTCA 600
*********************************************
Homo sapiens AGTGAtTGGCTAGTaAGGAACCAGGATGAGAAAGGTGGCTGGCCAATTA 1321
Bos Taurus AGTGACTGGCTgGTGAGGAACCAGGATGAGAAAGGTGGCTGGCCgATTA 1247
Mus musculus AGTGACTGGCTAGTGAGGAACCAGGATGAGAAAGGTGGCTGGCCAATTA 1560
***** ***** ** ***************************** ****
Рис. 11. Гомология нуклеотидной последовательности гена D-глюкуронил С5-эпимеразы
Прописные буквы - нуклеотидные замены
Подчеркивание - подобранные праймеры (эпимераза 329/1240)
Праймеры были подобраны таким образом, чтобы последовательности находились в экзонах известных генов D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши и быка.
Таким образом, мы провели компьютерный анализ гена D-глюкуронил С5-эпимеразы человека и подобрали праймеры (эпимераза 329/1240) к наиболее консервативным участкам гена. Далее необходимо было посмотреть экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в ткани молочной железы человека.









Прокариоты и эукариоты, строение и функции клетки. Наружная клеточная мембрана, эндоплазматическая сеть, их основные функции. Обмен веществ и превращения энергии в клетке. Энергетический и пластический обмен. Фотосинтез, биосинтез белка и его этапы. реферат [20,8 K], добавлен 06.07.2010
Основные элементы и химический состав мышечной ткани. Виды белков саркоплазмы и миофибрилл, их содержание к общему количеству белков, молекулярная масса, распределение в структурных элементах мышцы. Их функции и роль организме. Строение молекулы миозина. презентация [368,2 K], добавлен 14.12.2014
Углеводы – группа органических соединений. Строение и функции углеводов. Химический состав клетки. Примеры углеводов, их содержание в клетках. Получение углеводов из двуокиси углерода и воды в процессе реакции фотосинтеза, особенности классификации. презентация [890,0 K], добавлен 04.04.2012
Железы пищеварительного аппарата. Классификация женских половых органов. Классификация и строение мужских половых органов. Камеры сердца и сосуды, питающие сердце. Пути оттока крови. Отделы головного мозга. Локализация центров слуха, зрения, движения. контрольная работа [39,1 K], добавлен 28.12.2011
Кожные болезни современности. Строение и функции эпидермиса, характеристика его слоев. Анатомия и гистология дермы. Подкожная жировая клетчатка, ее основные функции. Классификация и строение жировой ткани. Структура адипоцита - клетки жировой ткани. реферат [27,0 K], добавлен 24.09.2013
Клеточные структуры, строение, состав и свойства основных компонентов растительной клетки. Поглощение и выделение веществ и энергии клеткой. Хлоропласты, их строение, химический состав и функции. Строение молекулы хлорофилла, флавоноидные пигменты. контрольная работа [1,0 M], добавлен 05.09.2011
Репликативный синтез ДНК и пролиферация, особенности организации хроматина в нервных клетках. Репарация (система "ремонта") ДНК в мозге животных. Рибонуклеиновые кислоты мозга. Экспрессия генов в нервной системе позвоночных. Онтогенез мозга животных. курсовая работа [575,0 K], добавлен 26.08.2009
Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д. PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах. Рекомендуем скачать работу .

© 2000 — 2021



Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы и декорина в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека дипломная работа. Биология и естествознание.
Проблема Наркомании В Подростковом Возрасте Реферат
Реферат: Религия как способ разрешения нравственных проблем (По роману Достоевского "Преступление и наказание"). Скачать бесплатно и без регистрации
Реферат: Holocaust The Destruction Process Essay Research Paper
Отчет по практике по теме Аналіз керівництва на підприємстві
Диспансеризация Детей И Подростков Реферат
Реферат: Россия и ОАЭ
Декабрьское Сочинение Купить
Сочинение Мои Старые Друзья Игрушки
Эссе По Литературе 10 Класс
Мини Сочинение Отношение Автора К Героям Дубровского
Дипломная работа: Організація маршрутних автобусних перевезень пасажирів на прикладі ВАТ "Атасс-Боріспіль"
Реферат по теме Научные основы приготовления высококачественного сена, травяной муки и резки. Рациональное использование соломы
Реферат: Конституційно-правовий статус прокуратури в Україні
Реферат по теме Источниковедческий исследование книги 'Бытие'
Реферат: Lord Of The Flies And Othello Comparison
Дипломная Работа Режиссерский Анализ Пьесы
Реферат: Инверсионные кровли. Скачать бесплатно и без регистрации
Курсовая работа по теме Управление персоналом инновационного предприятия
Классификация сект в русском сектоведении
Реферат: Студентка СПбМТК
Техногенные катастрофы - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда творческая работа
Территориальные связи воронов в различных городских и пригородных популяциях Московской области - Биология и естествознание дипломная работа
Особенности популяционно-биологических показателей плотвы Rutilus rutilus (L.), обитающей в Вислинском заливе - Биология и естествознание курсовая работа