Экспериментальное исследование активации системы свертывания ферментами фибринолиза - Биология и естествознание курсовая работа
Главная
Биология и естествознание
Экспериментальное исследование активации системы свертывания ферментами фибринолиза
Система фибринолиза как сложный набор биохимических реакций, разделенных в пространстве. Особенности разработки метода исследования фибринолиза, учитывающего пространственную неоднородность процессов коагуляции и лизиса. Сущность понятия "макроглобулин".
посмотреть текст работы
скачать работу можно здесь
полная информация о работе
весь список подобных работ
Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Экспериментальное исследование активации системы свертывания ферментами фибринолиза
фибринолиз макроглобулин биохимический
Фибриновые сгустки образуются в организме в результате работы системы свертывания в ответ на повреждение стенки кровеносного сосуда, закрывая собой место повреждения и предотвращая кровопотерю. После восстановления сосуда, когда необходимость в сгустке исчезает, важно его растворить, что бы восстановить кровоток. Это задачу решает система фибринолиза. Система фибринолиза представляет собой сложный набор биохимических реакций, разделенных в пространстве, результатом работы которых является разрушение фибринового тромба.
Таким образом, в нашей крови постоянно присутствуют две ферментативные системы, решающие противоположные задачи - система коагуляции создает сгустки, а система фибринолиза их разрушает. Здоровье человека напрямую зависит от баланса между данными системами. С одной стороны, при смещении баланса в сторону коагуляции, человек страдает от тромбозов (инфаркт, ТЭЛА, ТГВНК). При лечении тромбозов используются тромболитические средства, которые активируют систему фибринолиза, тем самым смещая баланс в сторону кровоточивости. Применение данных средств связано с риском тяжелейших геморрагий (в т.ч. мозговых кровоизлияний). Поэтому крайне важно знать особенности регуляции этих систем для более эффективного и разумного использования таких препаратов.
Целью данной работы было исследование пространственной динамики лизиса фибринового сгустка и взаимодействия системы фибринолиза и коагуляции в реакционно-диффузной системе in vitro. Результаты работы позволят в дальнейшем создать экспериментальный базис для теоретической модели фибринолиза, что поможет разобраться в механизмах регуляции данной системы.
В работе были поставлены следующие задачи:
- Разработка метода исследования фибринолиза, учитывающего пространственную неоднородность процессов коагуляции и лизиса.
- Оценка влияния различных концентраций тромболитических препаратов на пространственную динамику фибринолиза.
- Поиск реакций сопрягающих свертывание и фибринолиз с помощью экспериментального исследования в реакционно-диффузной системе.
Система фибринолиза - одна из жизненно важных систем нашего организма. Суть фибринолиза состоит в растворении тромбов, образующихся в результате свертывания крови. Процесс свертывания запускается организмом как ответ на повреждение стенки кровеносного сосуда и препятствует потере крови организмом[1].
Фибринолиз же восстанавливает циркуляцию крови по сосуду, разрушая сгустки. Основными участниками фибринолиза являются следующие белки: фибрин (защищает плазмин от ингибирования, запускает систему фибринолиза[2]), плазмин (разрушает фибрин), активаторы плазминогена (тканевый и урокиназный), ингибиторы плазмина (АП, МГ, ТАФИ), ингибиторы активаторов плазмина (ПАИ).
Появление фибрина в плазме служит причиной старта активации системы фибринолиза. Фибрин защищает плазмин от ингибирования, который запускает петли положительной обратной обратной связи (переход активаторов плазминогена в двухцепочечную форму, переход плазмина и плазминогена в Лиз-форму). Предшественником фибрина является белок фибриноген.
Он циркулирует в крови человека в концентрации около 8,8 мкМ. Молекулярная масса фибриногена 340 кДа, размеры - 45х9х9 нм [3]. На рис.1 показан схематичный вид его молекулы [2]. Фибриноген состоит из трех пар полипептидных цепочек (Аб-66,5 кДа, Bв-52 кДа и г-46,5 кДа), связанных между собой дисульфидными мостиками.
В его структуре выделяют несколько доменов: два D-домена, центральный E-домен и два бС домена. В Е-домене находятся N-концы всех трех пар полипептидных цепей. В D-домене - С-концы Вв и г цепей. гС-домен представляет собой С-конец Аб полипептидной цепи. бС-домены в фибриногене замкнуты друг на друга [2].
Плазмин - ключевой белок системы фибринолиза. Он способен садиться на фибрин и осуществлять гидролиз фибриновых нитей. Плазмин циркулирует в крови в виде своего неактивного предшественника - плазминогена (Пг) в концентрации 2 мкМ, который синтезируется в печени и имеет молекулярную массу 92 кДа. Плазминоген синтезируется в виде своей Глу-формы (ГлуПг). Глу-плазминоген имеет на своем N-конце аминокислоту глутамин. В его структуре выделяют семь доменов: преактивационный пептид, пять крингл-доменов (К1-К5) и протеbyазный домен (перечислены, начиная с N-конца) [4]. Крингл-домены обеспечивают узнавание плазминогеном лизиновых аминокислотных остатков, входящих в сайты связывания на фибрине, ингибиторах и клеточных рецепторах. Удаление плазмином преактивационного пептида приводит к переходу Глу-формы плазминогена в его Лиз-форму (ЛизПг) (рис. 2).
Лиз-плазминоген имеет более открытую конформацию, лучше связывается с фибрином и лучше активируется активаторами по сравнению с Глу-плазминогеном [5] [6] [7] [8]. Константа диссоциации ГлуПг к цельному фибрину имеет значение 5 мкМ, что на порядок ниже, чем у ЛизПг. Но для частично разрушенного фибрина константа диссоциации для глу- и лиз- форм совпадает и составляет 0.5 мкМ [9]. Крингл-домены обеспечивают узнавание плазминогеном лизиновых аминокислотных остатков, входящих в сайты связывания на фибрине, ингибиторах и клеточных рецепторах [10], [11], [12], [13], [14].
Плазмин состоит из двух полипептидных цепей, связанных дисульфидными связями. Имеет более открытую форму, нежели плазминоген и лучше связывается с фибрином.
Рис. 2. Схема активации плазминогена. Сперва, Глу-плазминоген под действием ТПА и УПА превращается в Глу-плазмин, который, затем превращает Глу-плазин(оген) в Лиз-плазмин(оген).
Плазминоген активируется до плазмина одним из двух белков-активаторов, синтезируемых в нашем организме: тканевым активатором плазминогена (ТПА) или урокиназным активатором плазминогена (УПА). При добавлении ряда белков, таких как стрептокиназа и стафилокиназа, плазминоген образует с ними автокаталитический комплекс, который также активирует плазминоген. Активация плазминогена осуществляется разрезанием пептидной связи Арг561-Вал562, в результате чего начинает функционировать его протеиназный домен, и плазминоген превращается в активную протеиназу плазмин [16].
Урокиназный активатор плазминогена
Урокиназный активатор плазминогена (о-УПА) является одноцепочечным гликопротеином с молекулярной массой 55 кДа. Синтезируется он многими клетками (соединительнотканными, эпителиальными, макрофагами, эндотелиальными клетками) и в норме циркулирует в крови в концентрации 70 пМ [16]. О-УПА состоит из домена эпидермального фактора роста (необходимого для связывания с клеточными рецепторами), крингл-домена (не имеющего афинности к лизину) и каталитического домена (гомологичного трипсиновым протеиназам). Разрезание плазмином связи Лиз158-Иле159 приводит к превращению одноцепочечного урокиназного активатора (о-УПА) в двухцепочечный (д-УПА), являющийся гораздо более эффективным[17], [18] (активность о-УПА по отношению к плазминогену составляет 0.1%-0.4% от активности д-УПА [19]). Урокиназный активатор имеет очень низкое сродство к фибрину, однако присутствие фибрина все же повышает активацию плазминогена с помощью о-УПА (но не д-УПА) [20]. Интересно, что основной ингибитор активаторов плазминогена ПАИ способен ингибировать только д-УПА, но не о-УПА [21].
Тканевый активатор плазминогена (о-ТПА) является одноцепочечным гликопротеином с молекулярной массой 68 кДа. Синтезируется он эндотельальными клетками и в норме циркулирует в крови в концентрации 70 пМ [21], хотя только 20% от этого количества находится в свободной форме, другая же часть циркулирует в комплексе со своим ингибитором ПАИ. N-концевая часть о-ТПА состоит из finger-домена, домена эпидермального фактора роста и двух крингл-доменов. С-концевая часть молекулы содержит каталитический домен, характерный для трипсиновых протеаз. Finger и второй крингл-домен способны взаимодействовать с фибрином [22]. Во взаимодействии о-ТПА с ингибитором ПАИ участвуют его второй крингл-домен, каталитический домен (активный сайт) и аминокислотные остатки 296-304 [23]. Хотя о-ТПА и является ферментом, его активность по отношению к своему субстрату-плазминогену довольно мала в отсутствии фибрина, тогда как в присутствии последнего активность повышается примерно в 1000 раз, благодаря формированию тройного комплекса активатор-плазминоген-фибрин [24]. Плазмин может превращать одноцепочечный активатор (о-ТПА) в двухцепочечный (д-ТПА) путем разрезания связи Арг275-Иле276 [25].
Антиплазмин (АП) является основным ингибитором плазмина [26]. Этот белок принадлежит к семейству серпинов и является гликопротеином с молекулярной массой 70 кДа. Синтезируется антиплазмин в печени и циркулирует в крови в концентрации 1 мкМ. Антиплазмин взаимодействует с лизин-связывающими кринглами и активным сайтом плазмина. Плазмин, находящийся в связанном с фибрином состоянии, гораздо меньше подвержен ингибированию антиплазмином: эффективность его инактивации уменьшается в 430 раз и его время жизни составляет около 7 минут (тогда как время жизни свободного плазмина примерно 1 с) [27].
Макроглобулин (МГ) - ингибитор большого числа протеиназ, его молекулярная масса 725 кДа. В системе фибринолиза наиболее заметное действие оказывает на плазмин, хотя эффективность ингибирования плазмина макроглобулином составляет примерно 10% от эффективности ингибирования антиплазмином. Концентрация Mg в крови составляет 3.5 мкМ [28]. Вероятно, физиологическая роль макроглобулина состоит в ингибировании плазмина, когда запасы антиплазмина исчерпаны.
Ингибитор активаторов плазминогена
Ингибитор активаторов плазминогена (ПАИ) является основным ингибитором и тканевого и урокиназного активаторов. Этот белок принадлежит к семейству серпинов и является гликопротеином с молекулярной массой 52 кДа. Синтезируется ПАИ эндотелиальными клетками, моноцитами, макрофагами, гепатоцитами и тромбоцитами, в крови человека присутствует в различных концентрациях вплоть до 2 нМ. Основным источником ПАИ считаются тромбоциты [29], что является значительным для предотвращения преждевременного фибринолиза в момент формирования сгустка [30].
Тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза
Тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза (ТАФИ) является одноцепочечным гликопротеином с молекулярной массой 60 кДа. Он синтезируется в печени и циркулирует в крови в концентрации 220 нМ [31]. ТАФИ является проферментом и нуждается в активации для превращения в активный фермент ТАФИа. Такая активация осуществляется в основном комплексом тромбин-тромбомодулин [32], [33], но также может осуществляться и плазмином [34], [35], трипсином [34] или одним тромбином [32], [34], хотя и гораздо медленнее. ТАФИа является нестабильным при 37°С, время его полужизни при этой температуре 8-9 мин [33]. Ингибирующее действие ТАФИ заключается в удалении С-концевых лизиновых аминокислотных остатков, появляющихся на фибрине в процессе его деградации [36].
Расщепление фибрина плазмином ? ключевая реакция фибринолиза, физиологической ролью которого является растворение фибриновых сгустков крови, образующихся в результате работы системы свертывания. Сгустки представляют собой скопление клеток крови, переплетенное сетью полимеризованного белка фибрина. Фибриновая часть сгустка формируется следующим образом. Сериновая протеаза тромбин активирует белок фибриноген, отщепляя от него отрицательно заряженные фибринопептиды A и B и образуя при этом активный мономер фибрина размерами 45нм x 2нм.
Такие мономеры быстро полимеризуются между собой в длинные двухцепочечные нити (протофибриллы) ,радиусом 3-5 нм [2], [37]. Образовавшиеся протофибриллы впоследствии собираются в более крупные структуры ? фибриллы, которые и составляют сеть сгустка [2]. Параметры сгустка зависят от условий полимеризации: концентраций тромбина и фибриногена, ионной силы раствора [37]. Образовавшиеся фибриллы имеют относительно постоянный диаметр по всему объему сгустка и могут ветвиться [38]. При физиологических условиях диаметр фибрилл может составлять 50-100 нм [38]. Суть фибринолиза заключается в расщеплении фибриновых волокон. Такое расщепление способен делать плазмин, являющийся сериновой протеазой и циркулирующий в крови в виде своего неактивного предшественника плазминогена. Превращение плазминогена в плазмин происходит под действием специфических активаторов [39].
Появление фибрина в плазме вызывает изменение скорости активации плазминогена с помощью ТПА на 3 порядка [24], тем самым инициируя запуск фибринолиза. Активный центр плазмина содержит аминокислотные остатки, типичные для сериновых протеаз (His 602, Asp 645, Ser 740), в то время как лизин-связывающие участки, входящие в состав пяти крингл-доменов плазмина обеспечивают взаимодействие фермента с фибрином, фибриногеном и б2-антиплазмином [39], поэтому связанный с фибрином плазмин гораздо хуже ингибируется антиплазмином [2], что является очень важным физиологическим эффектом, т.к. в данном случае активация системы фибринолиза происходит только в области наличия сгустка. На каждом мономере фибрина находятся два сайта связывания плазмина [40] (рис. 3), хотя в процессе деградации появляются дополнительные центры связывания на С-концевых остатках лизина расщепленных цепей фибрина [41]. В результате лизиса от фибрина отщепляются продукты деградации разных размеров и массы [42].
Таким образом процесс фибринолиза можно разделить на две основные фазы: образование фибрина в котором открываются сайты связывания для ТПА и плазминогена, тем самым запуская фибринолиз, и разрушение фибриновых нитей, при котором открываются новые сайты связывания плазмина (C-концевые лизиновые остатки) [43].
Рис.3. Сайты связывания плазминогена, ТПА и фибрина [2]. Аб, Bв и г цепи представлены оранжевым, синим и зеленым цветом соответственно. Аб392-610 - область связывания как плазминогена, так и ТПА. г312-324 - сайт связывания ТПА, Аб148-160 - сайт связывания плазминогена.
В первой фазе так же происходит изменение конформации активаторов плазминогена т.к. появившийся плазмин превращает одноцепочечнуые конформации ТПА и УПА в двухцепочечные путем разрезания связи Арг275-Иле276 и Лиз158-Иле159 соответственно (рис.4). Двухцепочечная урокиназа имеет в 250 раз большую активность по отношению к плазмину, нежели одноцепочечная [19]. В то же время, двухцепочечная форма урокиназы становится подвержены ингибированию с помощью ПАИ [44]. Для ТПА же ингибирование ПАИ характерно как для двухцепочечной, так и для одноцепочечной формы [45], константы ингибирования представлены в таблице 1 .
Рис.4. Схема ингибирования системы фибринолиза.
Таблица 1. Константы ингибирования второго порядка [10^7/М/с] ТПА и УПА с помощью ПАИ-1 [45]
Эмболические осложнения тромболитической терапии
Тромболитическая терапия является довольно опасной для пациента из-за возможных осложнений. К наиболее серьезным осложнениям относятся как геморрагические осложнения в виде мозговых кровоизлияний, так и тромботические, в виде рестенозов коронарных артерий, инфарктов мозга и ДВС [46], так же частым осложнением является острая желудочковая аритмия [47]. В клиническом исследовании эффективности ТПА J-ACT [46] проводившемся в 2005-2012г на 103 пациентах были отмечены тромботические осложнения в виде 7 случаев инфаркта мозга, 1 случая инфаркта миокарда, 1 случая ДВС синдрома.
Случаи активации системы свертывания во время тромболитической терапии отмечены в работе [48]. В данной работе отмечается повышение уровня фибринопептида А, который является маркером тромбина, у пациентов, которые проходили тромболитическую терапию стрептокиназой, и получили осложнения в виде реокклюзий сосудов.
Анализ литературы показал, что пространственная динамика фибринолиза является мало изученной областью, с другой стороны, известно, что пространственное распределение компонент играет немаловажную роль в процессах тромбообразования и лизиса. Так, например, более высокая концентрация тромбина вблизи места активации свертывания приводит к более плотной структуре фибринового сгустка в данной области.
В результате первых же экспериментов по исследованию фибринолиза в пространственно-диффузной среде было обнаружено явление сильной активации системы свертывания во всем объеме плазмы, в которую добавлен тромболитический препарат [49].
Эффект активации свертывания в крови, при добавлении в неё стрептокиназы был отмечен только в работах [48], [50], но в данных работах не были определены реакции активации белков коагуляции ферментами фибринолиза, не было обнаружено значительной активации системы коагуляции при добавлении других активаторов плазминогена (в наших же экспериментах урокиназа и тканевый активатор плазминогена также вызывают активацию свертывания).
Какие ферменты системы фибринолиза активируют систему свертывания? Какие белки системы свертывания активируются ферментами фибринолиза? Как зависит скорость распространения волны фибринолиза в сгустке от концентраций тромболитических препаратов? Зачем в организме имеются два типа активаторов плазминогена?
На все эти вопросы точных ответов, однозначно подтвержденных экспериментами, пока нет.
Поэтому целью данной работы было исследование влияния ферментов фибринолиза на пространственную динамику процессов свертывания и лизиса, а так же на активацию системы свертывания, которое позволило бы дать ответы на некоторые из поставленных вопросов.
- Разработка метода исследования фибринолиза, учитывающего пространственную неоднородность процесса.
- Оценить влияние различных концентраций и типов тромболитических препаратов на пространственную динамику фибринолиза.
- Проверить возможность активации белков коагуляции (Fg,II,IX,X,XI) ферментами фибринолиза (УПА, ТПА, СК, Пм).
Урокиназа. В экспериментах использовалась высокомолекулярная урокиназа (HMW-uPA, American Diagnostica, Stamford, CT), M=52 кДа. Белок находился в буфере 50 mM TRIS-HCl, 100 mM NaCl, 0.1% PEG, 200 mM Mannitol, pH 7.4.
Тканевый активатор плазминогена. Использовался медицинский препарат «Actilyse» (Boehringer Ingelheim, Германия). 1 флакон содержит алтеплаза 50 мг (1 мл готового р-ра - алтеплаза 1 мг); вспомогательные вещества: L-аргинин (1.742 г/фл.), фосфорная кислота (536 мг/фл.), полисорбат 80 (менее 5 мг/фл., менее 100 мкг/1 мл готового раствора).
Стрептокиназа. В экспериментах использовался очищенный белок Streptokinase from hemolytic Streptococcus (PN S3134), активность >4200МЕ/мг (Sigma, Saint Louis, MO).
Подготовка плазмы. Человеческая кровь здоровых доноров была предоставлена Гематологическим научным центром РАМН. Использовался пул плазмы 4 здоровых доноров. В кровь был добавлен 3.8% цитрат натрия (pH 5.5) в объемном отношении кровь/антикоагулянт 9:1, а также добавлен трипсиновый ингибитор контактной активации в конечной концентрации 0.4 г/литр для ингибирования контактного пути активации свертывания. После предварительного отделения эритроцитов центрифугированием в течение 15 минут при 1600g, плазму центрифугируют 5 минут при 10 000g для удаления тромбоцитов. Полученная таким образом свободная от тромбоцитов плазма содержит 15-70 мкМ ионов свободного кальция, а концентрация тромбоцитов в ней не превышает 10 9 клеток/литр.
Плазма дефицитная по XI фактору: Замороженная плазма (Affinity biologicals, Ancaster, Ontario).
Плазма дефицитная по IX фактору: Замороженная плазма (Precision biologics, Westlake Village, CA).
Фибриноген: Очищенный белок Fibrinogen from human plasma (Sigma, Sant Louis, Missouri). M=340кД.
Протромбин: Очищенный белок factor II from human plasma (Sigma, Sant Louis, Missouri).
Видеомикроскопия. Эксперименты проводились на системе по видеомикроскопии [51], [52], схема которой представлена на рис.5. Для предотвращения контактной активации и стабилизации рН плазмы в течение эксперимента (при контакте с воздухом из плазмы выходит СО 2 , вследствие чего меняется ионный состав плазмы и ее рН) за 10 минут до проведения эксперимента в плазму добавляли КТИ в конечной концентрации 0.2 мг/мл в буфере с HEPES (pH 7.4). Подготовленная плазма инкубируется 10 мин при 37°C для предотвращения холодовой активации свертывания. Затем производится рекальцифицикация плазмы и добавляется тромболитический препарат. Конечная концентрация ТПА достигала 1.5, 2.5, 5, 10, 20, 30, 40 мкг/мл [53], [54], концентрация урокиназы составляла 180МЕ/мл [53], стрептокиназы - 200МЕ/мл [53], также проводились контрольные эксперименты, без добавления тромболитических препаратов. Полученный раствор заливается в кювету, в которую вставляется активатор свертывания, покрытый тканевым фактором свертывания. Кювета с растущим сгустком освещается красным светом и в течение 90 мин регистрируется изменение интенсивности светорассеяния сгустка. При образовании сгустка плазма крови переходит из жидкого в гелеобразное состояние, и вследствие этого процесса происходит изменение интенсивности светорассеяния плазмы.
Рис.5. Схема установки: Установка состоит из исследовательской кюветы (1), которая помещается в воду, находящуюся в прозрачном термостатируемом отсеке при 37°С (2), и освещается сбоку светодиодами красного цвета свечения (3). Изображение области контакта плазмы (4) с активатором (5) фокусируется на ПЗС матрице фотокамеры (6) с помощью фотообъектива (7). Оцифрованное ПЗС камерой изображение передается в компьютер.
Наблюдение за фибриновым сгустком производится по методу темного поля. Экспериментальная кювета в водяном термостате освещается сбоку под углом 45є светодиодами красного цвета (длина волны свечения 660 нм). Рассеянный сгустком свет фокусируется на цифровую видеокамеру фотообъективом.
Для проведения эксперимента, сбора и предварительной обработки данных используется специальная программа Tromboimager (ООО «Гемакор»). После помещения активатора в кювету программе дается команда начать съемку, далее каждые 15 секунд пространственная картина интенсивности светорассеяния (выдержка составляет 50 мсек) записывается на жесткий диск.
При обработке все полученные изображения полагаются симметричными относительно перпендикуляра к активатору. Это позволяет перейти от двумерных распределений интенсивности светорассеяния к одномерным на отрезках, проведенных вдоль распространения роста тромба. На первом этапе обработки данных по светорассеянию выбирается узкая полоса, перпендикулярная активирующей поверхности (репер). Вдоль этой полосы для всех моментов времени вычисляются профили интенсивности регистрируемого сигнала. При этом, для снижения шумов, производилось усреднение значений светорассеяния внутри полосы в направлении, перпендикулярно росту сгустка (т.е. параллельно активатору). Первый, фоновый, профиль светорассеяния вычитается из всех последующий экспериментальных профилей.
Планшетный фотометр: Для проверки активации протромбина и фибриногена использовался 96-луночный планшетный фотометр. В лунки с буфером (0.5% БСА, 20mM HEPES, 140mM NaCl) pH7.4 добавлялся: 1: фибриноген [2мг/мл] c протромбином [4мкМ]. 2: фибриноген [2мг/мл] c протромбином [4мкМ] и активным фактором XIa[240нМ]. 3: фибриноген [2мг/мл] c протромбином [2мкМ] и активным фактором XIa [240нМ]. 4: фибриноген [2мг/мл] c протромбином [4мкМ] и урокиназой [1000МЕ/мл]. 5: фибриноген [2мг/мл] c активным фактором XIa[240нМ]. Измерялось светорассеяние образующегося фибрина (длина волны 450 нм). Предварительно оценивалась чувствительность фотометра по тромбину: концентрация тромбина более 1.5nM успешно регистрировалась.
Результаты и обсуждение . Разработка методики исследования фибринолиза
Для исследования процесса фибринолиза было решено использовать систему видеомикроскопии Tromboimager (ООО «Гемакор»), которая успешно используется для диагностики состояния системы свертывания и позволяет регистрировать пространственную динамику роста фибринового сгустка. Необходимо было проверить возможность регистрации лизиса сгустка при имеющихся параметрах оборудования и продумать постановку эксперимента, которая отражала бы процесс фибринолиза наиболее приближенно к in vivo ситуации. Было решено остановиться на двух основных типах методики (рис 6). В первой постановке (гетерогенное распределение тромболитического препарата в пространстве, гомогенный сгусток) в кювету сначала заливается плазма донора и активатор свертывания (тромбин). Через некоторое время плазма переходит из жидкого состояния в гелеобразное (образуется сгусток). Затем, сверху на сгусток наливается тромболитический препарат. Начинает происходить диффузия тромболитического препарата в сгусток, вследствие чего фибриновые волокна разрушаются, процесс фиксируется системой видеомикроскопии. Данная постановка отражает in vivo ситуацию, при которой у пациента образовался тромб и ему в организм ввели тромболитический препарат. Во второй постановке (гомогенное распределение тромболитического препарата в плазме, гетерогенный сгусток) в кювету сперва заливается плазма донора в которую добавлен тромболитический препарат. Затем в кювету вставляется пластина с иммобилизованным тканевым фактором свертывания, от которой начинает расти сгусток. В таком случае мы можем параллельно наблюдать динамику роста и разрушения сгустка. Такая постановка моделирует ситуацию, когда в организм человека уже введен тромболитический препарат и в определенном месте начинает расти новый тромб. Так же плюсом данной постановки является то, что она позволяет фиксировать спонтанное образование сгустков в плазме.
Для исследования пространственной динамики фибринолиза и поиска реакции сопряжения фибринолиза и свертывания в рамках данной дипломной работы использовалась вторая постановка (гомогенное распределение тромболитического препарата в плазме, гетерогенный сгусток).
Рис. 6. Два типа постановки эксперимента. Слева - гетерогенное распределение тромболитического препарата (сгусток снизу, препарат сверху). Справа - постановка с вставленным активатором свертывания, препарат растворен в плазме.
Пространственная динамика фибринолиза
Для исследования пространственной динамики процессов свертывания и фибринолиза рассчитывались зависимости значений таких параметров, как скорость распространения волн свертывания/фибринолиза, время задержки начала коагуляции и фибринолиза от различных концентраций и различных типов тромболитических препаратов.
Зависимость кинетических параметров распространения волн коагулаяции и фибринолиза от концентрации тромболитического препарата
В качестве тромболитического препарата использовался тканевый активатор плазминогена в концентрации 1.5, 2.5, 5, 10, 20, 30, 40 мкг/мл. Замерялись следующие параметры:
LagTimeCoagulation - промежуток времени между моментом активации свертывания и моментом начала роста фибринового сгустка.
CoagulationSpeed - средняя скорость движения переднего фронта волны свертывания за первые 10 минут.
LagTimeFibrinolysis - промежуток времени между моментом активации свертывания и моментом начала регистрации фибринолиза (момент, при котором интенсивность светорассеяния сгустка на расстоянии 100мкм от активатора начала падать).
FibrinolysisTime - промежуток времени между моментом образования сгустка и моментом его лизиса. Параметр вычислялся для средней интенсивности на расстоянии 100-400 мкм от активатора.
Для расчета параметров LagTimeCoagulation, LagTimeFibrinolysis, FibrinolysisTime происходит усреднение интенсивности по горизонтальной оси на расстоянии 100 мкм от активатора. С помощью этого мы переходим двумерным координатам - интенсивность и время (расстояние зафиксировано). Качественно, результат показан на рис.7.
Определяется максимальная интенсивность (I max), затем определяются моменты времени, когда интенсивность имела значения I max/2. T1 будет соответствовать параметру LagTimeCoagulation (момент начала роста сгустка), Т2 - LagTimeFibrinolysis (момент разрушения сгустка). Параметр FibrinolysisTime рассчитывается как Т2-Т1, но для интенсивности усредненной не на узкой линии 100мкм от активатора, а на прямоугольнике 100-400мкм от активатора (рис.8). Ширина прямоугольника 2.5 мм.
FibrinolysisSpeed - средняя скорость движения фронта фибринолиза. Вычислялась по формуле:
Где X- расстояние от активатора до фронта волны фибринолиза [мкм]. Схема определения фронта волны свертывания и фибринолиза показана в приложении 1.
Так же строились зависимости положения фронта коагуляции/свертывания и от времени и концентрации ТПА.
Рис.7. Схема определения параметров LagTimeCoagulation, LagTimeFibrinolysis и FibrinolysisTime.
Рис. 8: Распространение волны фибринолиза от активатора (сверху). Зеленым цветом отмечена область на расстоянии от 100 до 400мкм от активатора. Красная линия - 100мкм от активатора. Фотография сделана через 30 минут после вставки активатора.
Таблица 2. Зависимость скоростей коагуляции и фибринолиза [мкм/мин] от концентрации ТПА (n=3).
Обнаружено, что скорость распространения фронта коагуляции возрастает при добавлении в плазму тромболитического препарата. Вероятно, это вызвано активацией факторов свертывания компонентами фибринолиза.
Зависимости скорости фибринолиза от концентрации тромболитического препарата не прослеживается в диапазоне клинических концентраций ТПА (2.5-20мкг/мл). Значения скоростей представлены в таблице 2.
На рис.9 видно, что при увеличении концентрации ТПА время задержки фибринолиза падает до полутора минут и остается на данном уровне при концентрациях больших 10 мкг/мл. При уменьшении концентрации ТПА время задержки фибринолиза экспоненциально растет.
Рис.9. Зависимость параметров LagTimeFibrinolysis, LagTimeCoagulation и FibrinolysisTime от концентрации ТПА (n=3).
Время лизиса сгустка минимально при концентрациях ТПА 2.5-30 мкг/мл. При изменении концентрации в меньшую сторону время лизиса растет по причине роста лаг тайма. При изменении концентрации в большую сторону время лизиса также растет.
При добавлении тромболитического препарата время задержки свертывания уменьшается с 120 сек до 70-80 сек и остается на данном уровне во всем диапазоне концентраций ТПА (0.75-40 мкг/мл).
Если анализировать динамику изменения фронта волны фибринолиза в зависимости от времени, то можно увидеть, что фронт фибринолиза останавл
Экспериментальное исследование активации системы свертывания ферментами фибринолиза курсовая работа. Биология и естествознание.
Дипломная работа по теме Разработка мобильного приложения информационной поддержки деятельности сервис-инженера
Реферат: Транспортная инфраструктура Швейцарии
Лабораторная Работа По Физике Восьмой Класс
Курсовая работа по теме Основные теории происхождения языка
Сочинение Повествование На Тему Моя Комната
Реферат: Отчет по практике в ОАО Россельхозбанк
Реферат: Проблемы информационного общества
Методы Применяемые При Съемках Застроенных Территорий Реферат
Курсовая Работа На Тему Особенности Формирования Субфедеральной Долговой Политики На Примере Удмуртской Республики
Курсовая работа: Проблема огораживаний в Англии
Реферат по теме Ионизирующие излучения
Курсовая Работа Макроэкономика И Ее Проблемы
Доклад по теме Расторопша пятнистая (остро-пестро)
Реферат по теме Учение К.Маркса и Ф.Энгельса о воспитании
Методическое указание по теме Организация и планирование текущего ремонта здания
Сочинение Решимость По Тексту Айне
Доклад по теме Комплексное лечение квантовой и электромагнитной терапией
Состав Отчета Об Учебной Практике Введение
Написать Сочинение Молчалины Блаженствуют На Свете
Дипломная работа по теме Факторы успешности профессиональной деятельности спортсменов
Индикаторная роль растений и животных - Биология и естествознание презентация
Морфология и классификация прокариотов и эукариотов. Генетика микроорганизмов - Биология и естествознание реферат
Типы тканей в организме человека - Биология и естествознание реферат