Добавление антибиотика в питательные среды.

У новичков достаточно часто возникает проблема со стерильностью. У многих дома нет скороварки (а уж тем более автоклава) или по какой-то иной причине, невозможно добиться биологической чистоты питательной среды и в готовый раствор приходиться добавлять антибиотик. Но какое количество его добавить? Ампулу? Две? Десять? Таблетку? Горсть таблеток? Да, и какой антибиотик стоит выбрать? Эта статья поможет рассчитать количества добавляемого антибиотика для гомогенной жидкой среды (агар, жидкая питательная среда), но сразу скажу, адекватное количество антибиотика практически невозможно рассчитать для гетерогенной твёрдой среды (зерновой маточник). Хотя, такие расчёты есть и о них поговорим позднее. Для начала, рассмотрим вообще, что такое антибиотик, какого он спектра действия и класса бывает и как его правильно добавлять в жидкие и агаровые среды.

Какие бывают антибиотики?

Грибы и бактерии являются извечными и древними врагами, бьющимися за пищевые ресурсы. Хотя, отношения у них могут складываться по-разному и на разной основе (конкуренты, компаньоны, паразиты, контаминаты), но так или иначе, каждый класс микроорганизмов вырабатывает специфические вещества для борьбы с конкурентами за пищевые ресурсы. Эти вещества называются - антибиотики (то есть «против жизни»).

Так бактерии вырабатывают свой класс антибиотиков, чаще аммиак/сероводород, которые крайне вредны для макроорганизмов и высших грибов. Грибы в свою очередь (как и высшие бактерии - «лучевые грибки»), вырабатываю свой класс антибиотиков, начиная от простейших соединений (спирта - дрожжи, ацетона - кандида), так и заканчивая классом очень сложных биохимических молекул, имеющие в своей основе или индольное или бета - карболиновые основания, чтособственно мы и привыкли называть настоящими антибиотиками.

Строго говоря, любое химическое вещество вырабатываемое микроорганизмами или биостатик или антибиотик или пища для других (в том числе и их метаболиты). Антибиотики, чаше всего определяют, как некие биохимические вещества, которые подавляют рост микроорганизмов (то есть вмешиваются в процесс деления микроорганизмов и влияют на их ДНК И РНК) или полностью их убивают (то есть действуют на клеточные стенки бактерий). Поэтому существуют (весьма условно) два класса антибиотиков - бактериостатические (влияющие на размножения бактерий и останавливающий их процесс размножения) и бактерицидные (нарушающие стенки бактерий, что приводит к их гибели). Почему, я сказал, что это весьма условно? Дело в том, что любой антибиотик, применённый в «лошадиной дозе», перестаёт принадлежать к какому - то классу соединений, а становиться полностью «биоцидным», то есть убивает любой микроорганизм, включая и своего хозяина, его порождающего!

Так, дрожжи, при концентрации спирта (антибиотик, вырабатываемый этими грибками для борьбы с бактериями) более 23% могут погибнуть от своего же собственного антибиотика! Бактерии, вырабатывающие аммиак, при его концентрации более 7%, убивает любую форму жизни, в том числе и его производящих бактерий ! Поэтому, ещё раз подчеркну важность адекватного добавления любого антибиотика в жидкую питательную среду! При выборе антибиотика, для проращивания грибного мицелия на жидкой или агаровой питательной среде, необходимо остановиться на классе антибиотиков, которые вырабатывают «лучистые грибки». (В своей книге «культивация грибов», Пол Стемец, подробно останавливается на этом виде «грибков», особенно при производстве компоста). Так, вот, эти высшие бактерии, вырабатывают особый класс биохимических соединений, которые не подавляют рост высших грибов, сами по себе они и их антибиотики крайне термостойкие (как и сами «лучистые грибки» - они термофилы и способны жить при 60 0С ). Антибиотики, которые вырабатывает, допустим триходермы или бактерии, крайнегубительно сказываются на рост грибов (их антибиотики разрушают даже самые «толстые» клеточные стенки и используются при лечении рака, для этой же цели). В общем, остановимся на классе антибиотиков, вырабатываемым классом «лучистых грибков», как более «дружественные» к грибному мицелию и термостойкие. Правда, на сегодняшний день все антибиотики или полностью синтетические или полусинтетические, редко остались чисто природные антибиотики, да и те в виде солей (сульфатов или хлоридов),но это им придает более термическую стойкость. Ниже приводиться таблица, которая взята с сайта «Международного института микробиологии», ознакомимся с ней.

В таблице указано количество добавляемого антибиотика в жидкую или агаровую питательную среду, единица измерения микрограмм на миллилитр рабочего раствора. Мировые лаборатории, закупают готовый антибиотик в виде порошка, и грамм такого антибиотика стоит, соответственно! Так, грамм стрептомицина стоит 70 евро! В общем, как во время войны, СССР покупал антибиотики по цене 10 грамм золота за грамм пенициллина ! В общем, это не наш путь. Ладно, обратимся ещё к одной «забугорной» таблицы, но на этот раз «Всемирного института микробиологии»(американского).

Ту тоже, по сути, тоже самое. Покупают на фирме антибиотик, растворяют в воде и фильтруют (часто антибиотики впитывают в глинозём). Здесь готовят, так называемый «маточник», то есть растворяют на литр грамм покупного антибиотика, а потом из него берут нужное количество и дальше доводят растворением, до необходимой концентрации.

Эта таблица тоже понятная, здесь даже приведён срок службы антибиотика в питательной среде. Так при температуре 37 0С, срок действия антибиотика от 3 до 5 дней (в зависимости от вида), при температуре 27 0С, срок службы его «удлиняется» ещё на три дня. За это время мицелий уже должен колонизировать достаточную (площадь или объём) питательной среды и начать сам вырабатывать свой собственный антибиотик. (Это при условии инокуляции питательной среды не три споры на десять литров раствора, разумется!). Антибиотик «НИСТАТИН», при заданном количестве не подавляет рост мицелия высших грибов (этим раствором «промывают» уже взрослый мицелий или на свежую питательную среду из агара закладывается агаровый «клин»). Ладно, это всё лирика, с концентрацией всё понятно, но как её задать, используя таблетки и ампулы, покупаемого в аптеке антибиотика? Очень просто, надо внимательно прочитать инструкцию!

Произведём расчёт антибиотика, для примера.

Возьмем «гентамицина сульфат» как наиболее распространённый. Находим инструкцию (в интернете и читаем).

Состав:

Каждые 2 мл раствора для инъекций (1 ампула) содержат 80 мг гентамицина в форме сульфата. Значит, на объём одной ампулы (2 миллилитра) содержится 80 миллиграммов гентамицина (в форме сульфата). Значит, будем вести расчёт. Смотрим таблицу, для данного антибиотика и его параметры задачи -«5 - 50 мкг / мл» выбираем, дозировку общепринятую - «30 -35 мкг/мл» и делаем расчёт: 30 микрограмм -1 миллилитр, Х микрограмм -1000 миллилитров (то есть на литр раствора), значит Х = 30 Х 1000/1 =30 000 микрограмм или 30 миллиграмм. Значит в одной ампуле объёмом 2 миллилитра содержится 80 миллиграмм растворённого в воде антибиотика, а нам для одного литра раствора требуется 30 миллиграмм. Можно поступить двояко - или отобрать нужный раствор из готового объёма или его разбавить,а потом отобрать. Будем действовать методом создания «маточника». Рассчитаем на сколько нам хватит такого раствора (одной ампулы) в миллилитрах /литрах. 1000 миллилитров должно содержать в себе 30 миллиграмм Х Миллилитров значит содержит в себе 80 миллиграмм, Х= 1000 х 80 /30 = 2666.66666667 миллилитров или 2,6 литров водного раствора. То есть, одной ампулы гентамицина достаточно для приготовления 2,6 литра раствора! Причём, я выбрал концентрацию не для питательного раствора, который должен пройти стерилизацию, а для раствора, который должен пройти процесс пастеризации! Для автоклавов расчёт гентамицина сульфата равен - 5 микрограмм на миллилитр питательной среды. (15 -20 минут при давлении 15 футов на квадратный дюйм и температуре 121 0С). Для «мягкой» и дробной стерилизации (при 60 - 70 0С) берется, соответственно большее количества антибиотика -50 мкг/мл. Для отбора любого раствора антибиотика, помимо его растворения в чистой воде, если изначальный антибиотик был взят в виде таблеток, то на конец иглы шприца наматывается ватный фильтр и раствор втягивается в шприц за счёт вакуума. Надеюсь, расчёт понятен. Теперь перейдём к расчёту, отечественному, где антибиотик задаётся в виде активных единиц (а не в виде микрограмм на миллилитр). Берём инструкцию к «пенициллину-G» известному как «бензилпенициллин». Пенициллин G натриевая соль (Penicillin G sodium)

Состав и форма выпуска

1 флакон с порошком для приготовления инъекционного

раствора содержит бензилпенициллина натриевой соли 1 млн ЕД; в упаковке 100 шт.

Фармакологическое действие

Фармакологическое действие — антибактериальное. Блокирует синтез пептидогликана оболочкичувствительных микроорганизмов и вызывает их лизис. Значит, один флакон содержит в себе 1 миллион единиц (1 000 000 единиц). Расчёт бензилпенициллина в рабочий раствор или в питательную среду на основе агара составляет 50 - 100 единиц на миллилитр рабочей среды. Возьмем рекомендуемое число для пастеризации 100 единиц. 100 единиц на 1 миллилитр раствора Х единиц на 1000 миллилитров (литр) рабочего раствора, значит Х =100 Х 1000/1 =100 000 единиц на один литр раствора.

На сколько хватит пузырька?

100 000 единиц на 1000 миллилитров раствора 1 000 000 на Х миллилитров(литров) раствора, значит Х = 1000 х 1 000 000 / 100 000 = 10 000 миллилитров или 10 литров готового раствора (маточника)! И это притом, что мы взяли цифру для пастерилизации! Думаю, с этим разобрались, более или менее. Перейдём к другому вопросу - «когда добавлять антибиотик, а точнее, на каком этапе»? Для процесса пастеризации, два термостойких антибиотика - гентамицина сульфат и стрептомицина сульфат можно добавлять сразу в рабочий раствор. Они выдерживают процесс пастеризации, а при процессе стерилизации частично разрушаются! Другие же антибиотики, надо задавать в раствор, когда он остынет до 50 - 60 0С. То есть в бутылку (она обычно закрывается или ватно -марлевой пробкой или «синтетической» из синтепон), через иглу добавляют раствор (по всеми правилам, конечно!). Агаровая питательная среда и жидкий раствор при этом тщательно перемешивается с антибиотиком (стоит ли говорить, что колбу надо брать не голыми руками ? ). И ещё, на последок про антибиотики и хранения «маточника». Используйте только свежеприготовленный раствор. Большинство антибиотиков стабильны в виде порошка, но быстро распадаются в растворе. Храните «основу» из антибиотика при -20 oC и избегайте повторяющихся циклов замораживания / оттаивания, это сохранит жизнеспособность большинства антибиотиков в течение не менее 6 месяцев. Ампициллин «распадается» особенно быстро, и чашки с агаровой средой следует использовать в течение 1 месяца для оптимальной эффективности. Карбенициллин более стабилен, чем ампициллин, и может использоваться вместо ампициллина в большинстве случаев. Антибиотики различаются по своей чувствительности к нагреванию и / или освещению - не добавляйте их в среду с температурой выше 55 oC и храните чашки Петри, завернутые в фольгу, если используется светочувствительный антибиотик, такой как тетрациклин. Надо отслеживать рН рабочего раствора! Многие антибиотики (такие как пенициллин) разрушаются в кислотной среде, мгновенно! Многие не выдерживают высокую щёлочность, поэтому надо следить за рН рабочей среды.