Диссоциативы МСК

______________

✅ ️Наши контакты (Telegram):✅ ️

>>>🔥🔥🔥(ЖМИ СЮДА)🔥🔥🔥<<<

✅ ️ ▲ ✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ✅ ️

______________

Диссоциативы МСК

How to Avoid Getting Sick at the Start of the School Year

Диссоциативы МСК

Спайсы соли и другие новые психоактивные вещества – кто виноват и что делать?

Диссоциативы МСК

Целью этого протокола является создание 3D-модели in vitro для изучения дифференциации связанных с раком фибробластов CAFs в опухолевой оптоподобной среде, которая может быть решена в различных системах анализа, таких как иммунофлюоресценция, транскрипция анализ и визуализация клеток жизни. Определение идеальной модели для исследования in vitro имеет важное значение, главным образом при изучении физиологических процессов, таких как дифференциация клеток. В опухолевой стромы фибробласты-хозяина стимулируются раковыми клетками, чтобы дифференцироваться. Таким образом, они приобретают фенотип, который способствует микросреде опухоли и поддерживает прогрессирование опухоли. Используя сфероидную модель, мы создали такую 3D-модель in vitro, в которой мы проанализировали роль ламинина и его рецептора и его рецептора в этом процессе дифференциации. Эта система сфероидной модели не только воспроизводит условия микроокружения опухоли более точным способом, но также является очень универсальной моделью, так как она позволяет различные исследования вниз по течению, такие как иммунофлуоресцентное окрашивание как внутри-, так и внеклеточного маркеры, а также отложенные внеклеточные матричные белки. Кроме того, с помощью этой модели можно изучить транскрипционный анализ qPCR, цитометрию потока и клеточного вторжения. Здесь мы описываем протокол сфероидной модели для оценки роли интегрина ЦАФов No3 З1 и его эктопически отложенного лиганда, ламинина, в дифференциации и в поддержке вторжения раковых клеток поджелудочной железы. Микросреда опухоли является очень сложной нишей и чрезвычайно важно для поддержания и прогрессирования опухолевых клеток 1. Он образуется не только раковыми клетками, но и стромальными фибробластами. Опухолевые клетки окружены стромы, которая специфична и отличается от стромы нормальных тканей 2. Laminin является внеклеточным матричным белком эктопически выражается в строми различных опухолей, таких как аденокарцинома поджелудочной железы 3. Кроме того, биохимический состав ECM, а также его биофизические свойства, такие как жесткость и напряжение, изменения в опухоли объем4. Эта опухоль строма, или 'реактивная строма', вызвана адаптацией фибробластов к соседним раковым клеткам и набором других очень важных игроков, которые разрабатывают благоприятную и благоприятную среду для прогрессирования опухоли. Дифференциация стромальных фибробластов приводит к раку связанных фибробластов CAF. Для такой модельной системы необходимо рассмотреть метод имитации физиологических параметров ТМЭ экономически эффективным и воспроизводимым способом. В рамках ТМЭ происходят различные процессы, такие как распространение, дифференциация, миграция и вторжение различных типов клеток. Эти клеточные процессы могут выполняться индивидуально с различными методами. Тем не менее, экспериментальные условия должны учитывать клеточные взаимодействия с опухолевой стромы ECM, так как жесткость субстрата влияет на процесс дифференциации CAF. Уэллс прокомментировал влияние матричной жесткости на поведение клеток и подчеркнул, что цитоскелетная организация и дифференциация статуса, наблюдаемые в клетках in vitro, могут быть артемовстовыми 7. Различные стимулы, кажется, участвуют в дифференциации CAF, в том числе механическое напряжение 5 , 7. Чтобы избежать этого, 2D мягкие субстраты могут быть возможными подходами для дифференциации исследований, так как они обходят проблему жесткой культуры блюдо пластика. Мягкая 2D поверхность, на которой фибробласты могут быть выращены, может быть коллагена-I покрытием полякриламид гели, в котором гель жесткость может манипулировать концентрацией полиакриламид и гель поперечный-ссылки. Стегея и образование богатых SMA стрессовых волокон усиливаются в фибробластах вместе с гель жесткость 8. Эти результаты подчеркивают важность мягких подсашных лесов субстрата для более физиологических моделей дифференциации in vitro. Тем не менее, в наших руках экспериментальной воспроизводимости и визуализации этих гелей были сложными. Чтобы преодолеть эти недостатки, мы изменили 2D мягкую систему субстрата для 3D сфероидной модели для дифференциации и исследований вторжения. Эта модель является более клинически актуальной и, подобно органоиду in vitro, резюмирует взаимодействия в виво-клеточных клетках, производство и осаждение ECM, а также поведение клеток 9. Сфероиды образуются, когда клетки не хватает субстрата придерживаться. Когда клетки остаются без клейкой поверхности, они объединяются, образуя более или менее сферическую структуру. Если сфероиды состоят из одного типа клеток, они называются гомосфероидами; если состоит из двух или более различных типов клеток они образуют гетеросфероиды. Среди различных методов подготовки сфероидов, мы выполняем протокол с использованием неадекнтных круглых нижних колодцев. Он очень эффективен в отношении затрат. Целью этих исследований было использование первичных ЦАФов, изолированных от биопсии карциномы поджелудочной железы человека. Тем не менее, биопсии для получения клеток являются скудными, и по этой причине, CAFs, используемых в этих исследованиях были увековечены с использованием лентивирус, содержащий HTERT. Они называются iCAFs, и их нормальные аналоги, первичные человеческие фибробласты поджелудочной железы, называются iNFs. Этот протокол был использован для изучения влияния взаимодействия ламининаитегрина в процессе дифференциации CAF. Чтобы доказать специфику этого взаимодействия и его функции, ингибиторные соединения были использованы: BM2, моноклональное антитело, которое блокирует место связывания интегрина ламинин No3 цепи 10 , или lebein 1, змея яд производные соединения, которое блокирует ламинин-связывающие атегрины No3 Х1, No6 и 7 -1 11 , Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Результаты этого экспериментального проекта опубликованы в Martins Cavaco et al. Рисунок 1 , репрезентативное изображение иммунофлуоресцентного сфероида, показывает иммунофторинирование интегрина No3 субъединицы как увековеченных нормальных фибробластов, так и увековеченных ЦАФов рисунок 1A , а также иммунофлуоресценции количественное четвея рисунок 1B и транскрипционные уровни гена субъединицы интегрина No3 qPCR рисунок 1С. Эта группа результатов показывает, что в цафре, по сравнению с обычным аналогом, интегрин No3 регулируется в цафятах. Это доказало, что интегрин No3 З1 можно считать маркером дифференциации фибробластов поджелудочной железы. Это было также продемонстрировано поток цитометрии исследований Рисунок 1. A Иммунофлуоресцентное окрашивание гомосфероидов нормальных фибробластов поджелудочной железы iNFS по сравнению с гомосфероидами iCAF показывает повышенный сигнал о субъединице истегрина No3 в дифференцированных клетках. B Сигнал флуоресценции клеток в сфероиде был количественно с изображениями 3D-сфероида, используя программное обеспечение ImageJ. Средства , SEM из трех независимых экспериментов показаны и сопоставлены t-тестом яп. C Клетки, полученные из диссоциированных сфероидов были проанализированы на их транскрипционные уровни субъединицы интегрина No3. Средства - SEM из значения кВТ, как изменения в разовых данных из двух независимых экспериментов показаны и сравниваются t-тестом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Таблица 1. Клеточная композиция гетеро- и гомосфероидов. Количество клеток, необходимых для сборки гетеро- и гомосфероидов, а также соответствующая среда, которая должна быть использована для решения образования сфероидов, обобщаются в следующей таблице. Дополнительная рисунок 1. Последовательные шаги для количественной оценки иммунофлуоресцентного окрашивания белка, интересующего сфероидов, с использованием ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительная рисунок 2. Последовательные шаги для количественной оценки числа вторжений раковых клеток во время исследования вторжения, используя ImageJ. Разработка соответствующей модели in vitro для изучения дифференциации CAF является сложной задачей. После использования различных подходов, мы пришли к выводу, что 3D сфероидная модель является более практичной, физиологической и клинически актуальной моделью, в которой взаимодействие между клетками карциномы поджелудочной железы с увековеченными CAFs могут быть изучены. Эта модель предотвратила спонтанную дифференциацию фибробластов, из-за artefactual stressors such as stiffness пластмассы клетки пластмассы, по крайней мере в недолгосрочных условиях культуры до 48 h. Хотя точная жесткость сфероида, используемого в этих исследованиях, не была измерена, Ito et al. Средний фистрайственность-индекс гетеросфероидов была измерена через 1 и 3 дня после сборки. Размер сфероидов был разным, MSC, казалось, увеличить их агрегации потенциала, что привело к уменьшению размера с течением времени от ,5 мкм до 99,8 мкм 21 , Следовательно, жесткость сфероида также увеличилась с 5,0 х 10 -3 до 7,5 х 10 -3 Па Это до сих пор неизвестно и может отличаться от того, что было описано Ито и др. Жесткость также зависит от количества и перекрестного соединения клеточного производства и осажденного ECM, от различных взаимодействий клеток в сфероиде, от количества клеток в сфероиде или от продолжительности культуры. Как и любая другая модель, экспериментальный дизайн включает в себя некоторые переменные, которые нуждаются в оптимизации, такие как количество клеток, необходимых для формирования сфероидов, временные точки лечения и микроскопические изображения. Описанный экспериментальный дизайн был оптимизирован с целью иметь сфероидный размер, который будет иметь минимальное влияние на распространение питательных веществ и кислорода, так как существует предел диффузии из-за ограничений массового транспорта 9. Например, значительно влияет транспортировка кислорода в сфероиды размером более мкм, а также диффузия глюкозы и лактата, в агрегатах больше мкм 9 , Сфероиды диаметром более мкм обычно представляют собой концентрически слоистую структуру, состоящую из некротического ядра, окруженного жизнеспособным слоем тихих клеток и внешним ободком размножающихся клеток 9 , Чтобы избежать ограниченного распространения соединений, и устранить проблему недоступного сфероидного ядра, клетки лечились TGF-No1, BM2 и lebein-1 до образования сфероидов, когда клетки индивидуально подвешены в растворе образования сфероидов. Кроме того, чтобы обеспечить доступность кислорода и питательных веществ для большинства клеток сфероида и предотвратить образование некротического ядра, количество клеток на сфероид было сокращено до клеток, которые образуют сфероиды диаметром мкм. Важно тщательно смешивать различные типы клеток в растворе образования сфероидов, поэтому сфероиды состоят примерно из одинакового количества клеток, избегая значительных различий в размерах между сфероидами. Тем не менее, иногда некоторые сфероиды могут быть немного больше, чем другие, и что приведет к более- стеки, приобретенные в микроскоп. Некоторые сфероиды могут также отклоняться от идеально сферической формы, но это также учитывается, когда рентабельность сфероидов очеркирована. Эти различия в размерах и форме учитываются в нормализованных значениях количественной оценки, как это объясняется в следующем пункте. Другим важным фактором, касающимся формы сфероида, является тип клеток. Для визуализации сфероидов, криосекции фиксированных сфероидов также могут быть использованы, однако целостность сфероида может быть скомпрометирована при разделе, в зависимости от типа клетки и иммунодефицита протокола. Кроме того, окрашивание всего сфероида в его 3D-структуре оказалось более простым вариантом. Приобретение микроскопических стеканных изображений сфероида в виде 3D-структуры занимает в среднем мин на сфероид. Иммунофлуоресцентные сигналы на изображениях сфероидов трудно поддаются количественной оценке, поскольку они представляют собой плоскости 3D-структур. Используемый метод был основан на ранее описанном, где авторы экстраполировали и считали сфероид ячейкой Таким образом, сигнал флуоресценции корректируется с помощью equation 1. В качестве фона была определена интегрированная плотность сигнала в зоне, не представляющих интереса для клеток ROI. Измеренная плотность интегрированного сигнала — это сумма значений интенсивности пикселей в выбранной рентабельности инвестиций. Поскольку сфероиды являются 3D структурами, приобретаются конфокальные изображения из разных стеков. Для обработки таких изображений можно измерить флуоресцентный сигнал в каждом стеке по отдельности или использовать сумму всех стеков в проекцию. Все количественные оценки могут быть выполнены с помощью ImageJ. Общая исправленная флуоресценция ТФФ сфероидов определяется как нормализованный TCCF, учитывая площадь сфероидов и количество стеков, используя Уравнение 2. Это объясняет различные размеры сфероидов и расхождение в сферической форме. Анализ иммунофлуоресцентного окрашивания сфероидов с помощью этого метода может занять до 5 мин на сфероид. Аналогичным образом, вторжение клеток из сфероидов в окружающую стромальную матрицу может быть проанализировано различными алгоритмами. Простой метод был ранее описан Nowicki и др. Для того, чтобы дискриминировать инвазивные клетки от тех, которые не вторгаются, важно установить пространственный предел, за которым клетки считаются покинули структуру сфероидов. Таким образом, отправной точкой является предел, который соответствует периметру сфероидных изображений, приобретенных в начальную точку времени время 0 , когда сфероиды были встроены в гель. Клетка, которая вторгается в гель дальше всего считается максимальное расстояние инвазивной клетки может достичь, и, таким образом, он определяет внешний край региона вторжения. Этот метод подсчитывает инвазивные раковые клетки, которые присутствуют в области вторжения, используя инструмент подсчета от ImageJ, и рентабельность инвестиций, соответствующая сфероиду в то время 0 ч добавляется к менеджеру рентабельности инвестиций, а затем транспонируется к изображению того же точного сфероида, приобретенного 48 h или 72 ч позже. По этой причине, важно, чтобы сфероид остается как можно ближе к центру плоскостей, как это возможно, в разное время приобретения. Подсчет количества клеток может занять до 5 мин на сфероид. Другим важным соображением является различение различных типов клеток в гетеросфероид. Это может быть выполнено с помощью живых клеточных флуоресцентных красителей, которые могут быть проблематичными, когда тип клетки имеет высокую скорость деления клеток или если эксперимент должен быть выполнен в течение длительных периодов времени. Более надежный и надежный способ отличить две разные популяции заключается в разработке клеточных линий, выражающих флуоресцентные белки, такие как mCherry и GFP. Доставка векторов экспрессии может осуществляться с помощью лентивируса, что приводит к стабильному выражению этих белков. Авторы не заявляют о конфликте интересов. Этот материал отражает только мнения автора, и Европейский союз не несет ответственности за любое использование информации, содержащейся в нем. Мы признаем помощь Барбары Шеддинг в подготовке BM2 и lebein Мы признательны Огнес Ноэль за то, что она поделилась своим опытом в сфероидных анализах. Мы благодарим Соню Шелхаас и Михаэля Шефера за помощь в обработке трансфекции лентивирвейра в условиях S2. Кроме того, J. Этот проект также был поддержан Вильгельмом Сандером Стифтунгом грант: Cavaco, A. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing Log in or Start trial to access full content. При подготовке одной пластины 96 скважин, подготовить избыток сфероидов формирования раствора, 10 мл и добавить клеток, имея в виду, что каждый сфероид состоит из клеток, и что Л распространяются на каждый колодец пластины. Если цитокины или ингибиторы ингибирования ингибирования включены в исследование, добавить эти соединения в клеточной суспензии, для того, чтобы вставлять их в сфероиды во время их формирования. Распределите раствор образования сфероидов на круглую нижнюю 96 многоколодцную пластину, добавив л раствора в каждом колодце. Каждый раз, когда раствор сфероидов распределяется в скважинах, хорошо перемешайте, вставая вверх и вниз, несколько раз. Поместите пластину в инкубатор клеточной культуры на 24 ч, чтобы один сфероид, чтобы быть сформированным в каждом колодце. Соберите сфероиды примерно через 24 ч и используйте их для различных целей вниз по течению: иммунофлуоресцентное окрашивание, в режиме реального времени RT q-PCR и цитометрии потока. Для обнаружения экспрессии внутриклеточных антигенов, включая осаждение белков ECM в сфероиде, используйте иммунофлуоресцентное окрашивание. После распада сфероидов в одиночные клетки, количественно мембранно-якорный рецептор по цитометрии потока. Иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов Соберите сфероиды примерно через 24 ч в одну 1,5 мл реакционную трубку на экспериментальное состояние или на протеин, который необходимо проанализировать. Чтобы избежать разрыва сфероидов из-за слишком сильных сил сдвига, вырежьте конец кончика пипетки, чтобы увеличить обита. Включите не менее сфероидов в одну реакционную трубку, чтобы позволить репликации и принять во внимание возможные потери во время стирки шагов. Centrifuge сфероидов со скамейкой верхней центрифуги около с на х г. Тщательно удалите метилцеллюлозы содержащие супернатант путем pipetting, не нарушая гранулы сфероидов. Вымойте 50 л 1x PBS. Повторите шаг центрифугации и тщательно удалите PBS путем пипетки, как описано в 2. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шагах 2. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шагах 2,,3 три раза. Инкубировать клетки с 30 злитроду dAPI окрашивающий раствор в течение 4 мин при комнатной температуре. Поместите сфероиды на стеклянную горку, в каплю PBS, используя стеклянный труба Пастер. Изображение сфероидов флуоресценцией микроскопии в лазерном сканирующем микроскопе с помощью увеличения 10x. Возьмите различные оптические поперечные сфероид на различных оптических плоскостях z-стек стек самолетов. Для установления лазерных настроек в микроскопе используйте сфероид, состоящий из клеток, отрицательных для антигена интереса, или сфероида, окрашенного только вторичным антителом. Повторное использование одинаковых параметров для всех образцов, которые будут сравниваться. Проанализируйте микроскопические изображения с помощью программного обеспечения ImageJ, опубликованного ранее Шаги обобщены на дополнительной рисунке 1. В качестве фона определите плотность встроенного сигнала области, свободной от клеток ROI. Центрифуга в течение 5 мин при х г и тщательно удалить метилцеллюлозы содержащие супернатант путем pipetting, не нарушая гранулы сфероидов. Вымойте 1 мл 1x PBS и перенесите сфероиды в реакционную трубку 1,5 мл. Тщательно удалите PBS путем pipetting, не нарушая гранулированных сфероидов. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шаге 3. Изолировать общую РНК из клеток распавшиеся сфероиды с помощью коммерческого комплекта изоляции РНК, в соответствии с инструкциями производителей. Обратный транскрибировать изолированные мРНК в кДНК с коммерческим комплектом, в соответствии с инструкциями производителей. Количественная оценка уровней транскрипции в репликациях в режиме реального времени PCR. Анализ цитометрии потока экспрессии интегрина Для цитометрического анализа потока соберите не менее сфероидов соответствующих трем колодульным пластинам в реакционную трубку мощностью 50 мл. Центрифуга в течение 5 мин при х г и тщательно удалить метилцеллюлозы содержащего супернатант путем pipetting. Повторите шаг центрифугации и осторожно удалите PBS путем пипетки. Разъедините сфероиды, описанные в шаге 3. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шаге 4. Проанализируйте 2. Ворота для одиночных живых клеток через участок точки FSC-SSC и анализируют флуоресценцию закрытых клеток на канале, подходящем для выбранного флюорофора. Вторжение ассси с использованием гетеросфероидов Подготовьте раствор образования сфероидов для гетеросфероидов, содержащих различные типы клеток и соответствующие среды, как обобщено в таблице 1. Клетки ранее были трансумцированы с лентивирусом, содержащим переносчики для выражения mCherry или GFP. Заполните л раствора образования сфероидов в каждом колодце пластины и инкубировать пластину в инкубаторе клеточной культуры в течение 24 ч, чтобы один сфероид образуется в каждом колодце. Быстро распределите 15 л в 3 скважинах камеры ангиогенеза. Вставлять по одному сфероиду в каждый колодец, уже содержащий гель. При необходимости быстро отрегулируйте расположение сфероида к центру колодца с помощью пипетки под микроскопом. Повторите шаги 5. Инкубировать гели в инкубаторе на 1 ч, чтобы затвердеть, а затем аккуратно наложить гели с клеточной культуры среды. Изображение сфероидов флуоресценцией микроскопии в лазерном сканирующем микроскопе. Возьмите различные оптические поперечные сфероид на различных оптических плоскостях z-стека и в разное время точки вторжения например, 0 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч. Проанализируйте изображения, подсчитывая количество вторгшихся раковых клеток. Вторжение клетки те, которые покинули сфероид и вошел в инвазивной области. Инвазивная область определяется как область кольца между внешними и внутренними периметрами, приведенными дальней вторгшейся клеткой, и сфероидной границей сфероида в начале экспериментов вторжения, соответственно, как указано на дополнительном рисунке 2. Гетеросфероиды Тип клеток проход до 25 Количество ячеек Средний 1 часть метилцеллюлозы Play Video. Cite this Article Cavaco, A. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. Please enter your institutional email to check if you have access to this content. Please create an account to get access. Forgot Password? To receive a free trial, please fill out the form below. Not your institution? A JoVE representative will be in touch with you shortly. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Thank You. Please enjoy a free hour trial. In order to begin, please login or create an account. Please click here to activate your free hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close.

Верхняя Салда купить закладку MDMA Pills - GREEN

Гидра купить Ханка, лирика Махачкала

Диссоциативы МСК

Купить закладку Cтимуляторы Череповец

Купить мефедрон закладкой Доминикана

Купить бошки в Климовск